Nghiên cứu chuyển gen uida vào cây bình vôi stephania rotunada lour

Với nhiều công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực này đã đem lại lợi ích cho ngành y học khi ứng dụng công nghệ chuyển gen đã giúp tăng mạnh gấp nhiều lần nồng độ dược chất quý v

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ DIỄM QUỲNH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN UIDA VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunada Lour.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2022

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ DIỄM QUỲNH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN UIDA VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunada Lour.)

Ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số : 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Phú Hiệp

THÁI NGUYÊN - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đã thực hiện việc kiểm tra mức độ tương đồng nội dung luận văn qua phần mềm Turnitin một cách trung thực và đạt kết quả mức độ tương đồng % Bản luận văn kiểm tra theo phần mềm là bản cứng đã nộp để nghiệm thu trước hội đồng Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Thái Nguyên, ngày tháng 10 năm 2022

TÁC GIẢ CỦA SẢN PHẨM HỌC THUẬT

(Kí và ghi rõ họ tên)

Ngô Diễm Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy giáo: TS Hoàng Phú Hiệp và cô giáo PGS.TS Phạm Thị Thanh Nhàn đã chỉ bảo, động viên, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi nghiên cứu, thực hiện luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và có nhiều góp ý sâu sắc cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các cô Cao Thị Phương Thảo, Trần Thị Hồng, cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên, quan tâm, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và nghiên cứu Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài do thời gian có hạn, còn nhiều thiếu sót về chuyên môn cũng như kỹ thuật nên khó tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế trong nghiên cứu vì vậy tôi rất mong nhận được sự đóng góp, chỉ bảo của quý thầy cô và bạn bè để luận văn được hoàn thiện hơn

Thái Nguyên, tháng năm 2022

Học viên

Ngô Diễm Quỳnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Bình vôi 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi 4

1.1.3 Một số tác dụng và hiện trạng khai thác cây Bình vôi 5

1.2 Alkaloid và tác dụng của alkaloid trong cây Bình vôi 6

1.2.1 Alkaloid 6

1.2.2 Alkaloid chính trong cây Bình vôi 8

1.3 Nâng cao hàm lượng dược chất có hoạt tính bằng kỹ thuật chuyển gen 11

1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens 11

1.3.2 Thành tựu chuyển gen ở thực vật thông qua chuyển gen uidA nhờ A tumefaciens 13

1.4 Một số nghiên cứu về cây Bình vôi 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu, dụng cụ và hóa chất 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 20

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 21

2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu Bình vôi và tái sinh đa chồi từ đoạn thân 21 2.2.3 Phương pháp xây dựng quy trình chuyển gen 22

2.2.4 Phương pháp xử lí số liệu 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Xác định mật độ tế bào A tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi 25

3.2 Xác định nồng độ acetosyringone phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân ở cây Bình vôi 28

3.3 Xác định thời gian nhiễm khuẩn A tumefaciens phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân ở cây Bình vôi 29

3.4 Xác định thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân ở cây Bình vôi 30

3.5 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để chọn lọc chồi và tái sinh in vitro cây chuyển gen 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 43

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của mật độ A tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen uidA

tạm thời 26

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen uidA 28

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Bình vôi 4

Hình 1.2 Mặt trước và sau lá cây Bình vôi 5

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của rotundin (L - tetrahydropalmatine) [6] 9

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của roemerin (A) và cepharantin (B) [6] 10

Hình 1.5 Sự tương tác của A tumefaciens và cơ chế chuyển T-DNA 13

Hình 2.1 Khuẩn AGL1_PZY102 (A) và sơ đồ cấu trúc vector pCB-gusplus (B) 20 Hình 2.2 Sơ đồ khái quát thí nghiệm chuyển gen cây Bình vôi 22

Hình 3.1 Mẫu Bình vôi in vitro 25

Hình 3.2 Mẫu Bình vôi chuyển gen trên môi trường SIM sau 4 tuần nuôi cấy 33

Hình 3.3 Kết quả biểu hiện gen uidA 34

Hình 3.4 Quy trình chuyển gen uidA vào cây Bình vôi 35

E coli Escherichia coli

GM Germination medium Môi trường nảy mầm

uidA/GUS β-Glucuronidase

LB Luria Bertani Môi trường dinh dưỡng cơ

bản nuôi cấy vi khuẩn

MS Murashige and Skoog medium Môi trường dinh dưỡng MS

OD Optical density Mật độ quang

RM Rooting medium Môi trường tạo rễ

SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trường cảm ứng tạo chồi T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào

thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u

Vir Virulence region

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour thuộc họ Tiết dê - Menispermaceae) là

một loài dược liệu từ lâu đời đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều chứng bệnh Cây Bình vôi là một loài phân bố phổ biến ở vùng Đông Á

Ở Việt Nam các loài Bình vôi phân bố khá rộng ở cả 3 miền, thường ưa mọc ở những vùng có núi đá vôi như: Thanh Hóa, Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Cao Bằng, Vũng Tàu…

Đây là một loại dược liệu quý có tác dụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau Thường sử dụng phần củ của cây để làm thành thuốc chữa các bệnh: mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau dạ dày, trị ho có đờm, hen suyễn, khó

thở… Trong các loại dược chất có hoạt tính trong củ, L - tetrahydropalmatin

(rotundin) được sử dụng là nguyên liệu chính để tạo ra thuốc điều trị an thần, mất ngủ Tuy nhiên cây Bình vôi hoang dã ở Việt Nam đang bị sụt giảm mạnh do sự khai thác bừa bãi và không có kế hoạch trồng tái sinh, cây Bình vôi được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ [18]

Trong những thập kỷ vừa qua, công nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ chuyển gen thực vật với kĩ thuật chuyển gen cho phép con người can thiệp đưa một hoặc một vài gen quý hiếm vào cơ thể thực vật tạo ra thực vật biến đổi gen nhằm thay đổi hoặc cải thiện một số đặc tính của thực vật theo hướng có lợi cho con người Với nhiều công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực này đã đem lại lợi ích cho ngành y học khi ứng dụng công nghệ chuyển gen đã giúp tăng mạnh gấp nhiều lần nồng độ dược chất quý vốn có trong các cây dược liệu, tránh cho việc khai thác quá mức nguồn dược liệu để làm thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh

Hàm lượng dược chất cụ thể là rotundin trong cây Bình vôi tự nhiên là rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái Vì vậy định hướng nghiên cứu

nhằm tăng hàm lượng rotundin ở cây Bình vôi đang rất được quan tâm Có nhiều cách tiếp cận tăng sinh khối để khai thác dược chất quý từ cây dược liệu, trong đó có kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme chìa khóa bằng cách chuyển gen mục tiêu sẽ làm tăng tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi Tuy nhiên, trên thế giới và Việt Nam chưa có công trình khoa học nào công bố về việc xây dựng được quy trình chuyển gen ở cây Bình vôi Do vậy việc nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây Bình vôi để làm cơ sở cho việc chuyển gen đích tăng tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi là rất cần thiết

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình

chuyển gen uidA vào cây Bình vôi (Stephania rotunada Lour.)” làm tiền đề

cho việc xây dựng quy trình chuyển gen mục tiêu làm tăng hàm lượng rotudin ở cây Bình vôi

2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu điều kiện tối ưu chuyển gen uidA vào cây Bình vôi

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu mật độ vi khuẩn A tumefaciens mang gen uidA phù hợp

cho chuyển gen ở cây bình vôi

- Nghiên cứu nồng độ Acetosyringone phù hợp cho việc chuyển gen ở cây Bình vôi

- Nghiên cứu thời gian nhiễm khuẩn A tumefaciens mang gen uidA phù

hợp cho việc chuyển gen vào cây Bình vôi

- Nghiên cứu thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi

- Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến hiệu quả chọn lọc chồi

và tái sinh in vitro ở cây chuyển gen

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây Bình vôi

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát

(Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam Châu Á

Chi Bình vôi trên thế giới có khoảng trên 45 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ở các nước như Trung Quốc, Đông Nam Á, Úc, Ấn Độ, Châu Phi Ở

nước ta có khoảng từ 14 - 16 loài Những loài Bình vôi hiện có ở nước ta khá

đa dạng và phong phú Chúng sinh trưởng trong nhiều loại hình thảm thực vật, trên núi đá vôi, trên đất lẫn đá, và trên cát ven biển ở một số địa phương, cụ thể chúng phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Nhưng thường tập trung hơn ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hoà Bình, Cao Bằng, Thanh Hoá, Lâm Đồng, Lạng Sơn, Lào Cai,…

Một số loài đã được công bố có ở Việt Nam: Stephania rotunda Lour., S pierrei Diels, S brachchyandra Diels, S camhodiana Gagnep., S cepharantha hay S dielsiara Y.C.Wu, S exentrica H.S.Lo, S hainanensis H.s Lo et Y.Tsoong, S kwangsiensis H.S.Lo, S sinica Diels, S glabra (Roxb.) Miers [6]

Về mặt phân loại, cây Bình vôi được phân loại khoa học trong hệ thống giới Thực vật như sau :

Giới (genum): Plantea

Tên thường gọi khác ở Việt Nam của loài Stephania rotunada Lour: củ

Một, củ Ngếch, củ Thiên đầu thống, củ Ngải tượng, củ Mối tròn [6]

1.1.2 Đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi

Các cây trong chi Bình vôi đều là dây leo, sống lâu năm hoặc hàng năm Ở giai đoạn còn non thì thân thường nhẵn, màu xanh bóng hoặc xanh đậm Giai đoạn già thân thường có những rãnh dọc, có những mụn cóc màu nâu xám, nâu đen hoặc nâu đất Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành rễ củ

Cụ thể, theo Phạm Thanh Kỳ và cs (1998) các loại Bình vôi có đặc điểm chung như sau: thuộc dạng thân leo, nhẵn, thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm [6]

Hình 1.1 Cây Bình vôi

Rễ phình to thành củ rất đa dạng thường có dạng hình cầu, hình trụ nặng khoảng 0,5 đến 2 kg nhưng có loài rất to (nặng trên 40 kg) vỏ ngoài xù xì màu nâu, nâu đen, hình dáng củ thay đổi tùy theo nơi cây sinh trưởng [6]

Cuống lá Bình vôi dài, đính vào phiến lá khoảng 1/3 chiều dài lá Lá mọc cách, phiến lá mỏng, hai mặt nhẵn, hình tim hoặc gần như tròn có cạnh hoặc tam giác tròn, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy, gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá, gân lá dạng chân vịt Màu sắc của phiến lá tùy thuộc từng loài, thường là xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm [6]

Hình 1.2 Mặt trước và sau lá cây Bình vôi

Cây Bình vôi có hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ

lá hoặc ở những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc; hoa đực có 6

lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; bộ nhị liền thành một trục với 6 bao phấn màu vàng nhạt xếp thành vòng tròn Khi hoa nở các bao phấn

mở nắp ngang quay ra xung quanh Hạt phấn nhỏ màu vàng; hoa cái có một lá đài; hai cánh hoa, bầu hoa có hình trứng [6]

Quả của cây Bình vôi là dạng hạch hình cầu hơi dẹt, khi chín có màu đỏ hoặc da cam, hạt cứng hình móng ngựa, hình trứng hoặc hình gần tròn tùy theo loài Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Mùa hoa vào tháng 2 - 6, mùa quả vào tháng 7 - 10 [6]

Chi Bình vôi rất đa dạng về hình thái, sự đa dạng, phong phú này phụ thuộc vào điều kiện đất đai, khí hậu nơi cây sinh sống, phát triển và phụ thuộc vào đặc tính của tùy từng loài

1.1.3 Một số tác dụng và hiện trạng khai thác cây Bình vôi

Từ lâu củ Bình vôi đã được sử dụng như một loại thuốc nam có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe và được nhân dân ta sử dụng để chữa một số bệnh như mất ngủ, an thần, hen suyễn, kiết lỵ, lao, đau dạ dày, Cây Bình vôi chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid L- tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc, đặc biệt

là thuốc an thần [9]

Ở Việt Nam có nhiều loài Bình vôi khác nhau, do đó ở mỗi loài lại cho

một số thành phần alkaloid khác nhau Trên thực nghiệm, chất L -

tetrahydropalmatin của Bình vôi và hỗn hợp alkaloid chiết xuất từ một số loài Bình vôi có tác dụng an thần, chống co giật, hạ huyết áp, hạ sốt… [9]

Bình vôi được sử dụng làm dược liệu có nguồn gốc chủ yếu được khai thác từ ngoài tự nhiên hoang dã Ngoài ra chúng có khu phân bố chia cắt, sống

ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng Cây bị khai thác bằng cách đào rễ lấy củ và không có kế hoạch trồng tái sinh do vậy Bình vôi nguy cơ tuyệt chủng cao Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [18]

Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật sinh học hiện đại phù hợp để tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng được nhu cầu sử dụng

củ Bình vôi làm thuốc tăng cao mà vẫn đảm bảo sự phát triển của cây Bình vôi

Alkaloid có nhiều ở thực vật, người ta đã biết khoảng trên 6000 alkaloid

từ hơn 5000 loài, ở thực vật bậc cao chiếm khoảng 15 - 20%, tập trung ở một

số họ: Apocynaceae (họ Trúc đào) có khoảng 800 alkaloid, Papaveraceae (họ

Thuốc phiện) có khoảng 400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) có khoảng 350 alkaloid, Rutaceae (họ Cam) có khoảng 300 alkaloid, Liliaceae (họ Hành) có khoảng 250 alkaloid, Solanaceae (họ Cà) có khoảng 200 alkaloid, Amaryllidaceae (họ Thuỷ tiên) có 178 alkaloid, Menispermaceae (họ Tiết dê)

có 172 alkaloid, Rubiaceae (họ Cà phê) có 156 alkaloid, Loganiaceae (họ Mã tiền) có 150 alkaloid, Buxaceae (họ Hoàng dương) có 131 alkaloid, Asteraccae (họ Cúc) có 130 alkaloid, Euphorbiaceae (họ Thầu dầu) có 120 alkaloid [6]

Mặc dù có sự đa dạng về cấu trúc cũng như sự phân bố theo phân loại, nguồn gốc sinh tổng hợp nhưng các hợp chất này đều tuân theo một logic hóa học thống nhất là xoay quanh sự hình thành và phản ứng của cation iminium

Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, trừ một số trường hợp như trong cây Cinchona spp (Canh kina) hàm lượng alkaloid đạt 6 - 10%, trong nhựa cây Papaver somniferum L (Thuốc phiện) có tới 20 - 30% Một số

dược liệu chứa 1 - 3% alkaloid đã được coi là có hàm lượng alkaloid khá cao Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: ánh sáng, khí hậu, chất đất, phân bón, giống cây hay bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái Theo Carey (1987), alkaloid thường xuất hiện ở trong một số bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ Đôi khi trong cùng một cây, sự phân bố của alkaloid lại khác nhau, có chỗ có xuất hiện, có chỗ lại không Lượng alkaloid

và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây dễ thay đổi theo các yếu tố như mùa thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng [19]

Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên có công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong công thức có C,H,O,N Những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiêt độ thường Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có nhiệt độ chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phá huỷ ở nhiệt độ trước khi chảy Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phá huỷ bởi nhiệt độ Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và mội số ít có

vị cay như capsaixin, piperin Hầu hết các alkaloid đều có tính bazo yếu, không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng như becberin, palmatin, chelidonin [6]

Alkaloid thường đều là các chất có hoạt tính sinh học cao, có nhiều chất rất độc Một số tác dụng của alkaloid: tác dụng trên hệ thần kinh trung ương gây ức chế như morphin, reserpin hoặc kích thích như cafein, strychnin Có chất gây tê tại chỗ như cocain, làm tăng huyết áp như ephedrin, hydrastin, làm hạ huyết áp như yohimbin,veratnim hay làm diệt ký sinh trùng như quinin độc đối với ký sinh trùng sốt rét; cmetin và conexin độc đối với amip dùng đề chữa lỵ [6]

Tùy theo loại khác nhau mà tác dụng của các loại alkaloid cũng khác nhau Tuy nhiên tác dụng của alkaloid trong dược liệu không bao giờ giống với các alkaloid đã được phân lập Đó là lí do vì sao hiện nay dù có nhiều thuốc tổng hợp nhân tạo được nhưng vẫn không loại bỏ hoàn toàn các loại dược liệu

có alkaloid lấy từ cây cỏ thiên nhiên, một phần vì có các chất chưa tổng hợp được, một phần thuốc sản xuất tổng hợp không hề rẻ hơn so với chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng hợp chưa thể bằng được tác dụng của chất lấy trực tiếp

từ cây tự nhiên

Do vậy alkaloid là một hợp chất thiên nhiên rất quan trọng về nhiều mặt, nhất là trong lĩnh vực y học nhờ vào các hoạt tính sinh học đa dạng

1.2.2 Alkaloid chính trong cây Bình vôi

Trong củ Bình vôi có chứa nhiều alkaloid, các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin Trong đó chât quan trọng nhất là rotundin (0,2-3,55%) Hàm lượng rotundin trong chi Bình vôi không giống nhau, có sự khác biệt tùy từng loài khác nhau và tùy từng khu vực thu hái

Theo Bùi Thị Bằng và cs (2006), hàm lượng rotundin có thể đạt tới

3,55% ở loài S brachyandra Diels (thu hoạch ở Hoàng Liên Sơn), 1,30% ở loài

S Kwangsiensis H.S.Lo (thu hoạch ở Quảng Ninh), 0,72% ở loài S

hainanensis H.S.Loet Y.TSoong (thu hoạch ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài S cambodia Gagnep (thu hoạch ở Lâm Đồng), 0,21% ở loài S peirrei Diels (thu

hoạch ở Tây Nguyên) [1]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của rotundin (L - tetrahydropalmatine) [6]

Rotundin có tên khoa học là L - tetrahydropalmatin (5,8,13,13a – tetrahydro

- 2,3,9,10 - tetramethoxy - 6H dibenzo quinolizine) có công thức hóa học là

C21H25NO4.Rotundin lần đầu tiên được phân lập ở Việt Nam vào năm 1940 bởi

nhà khoa học Bùi Đình Sang từ loài S rotunda Lour Rotundin là tinh thể màu

trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Rotundin tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong sulfuric acid loãng Điểm nóng chảy của rotundin ở 141oC đến 144oC [6]

Ngoài rotundin, trong cây Bình vôi còn có một số chất alkaloid quan trong khác là roemerin và cepharantin Roemerin có tác dụng dược lý là gây tê niêm mạc và phong bế Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine Đối với hệ thần kinh trung ương với liều thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong Roemerin còn có tác dụng dãn mạch, hạ huyết áp Liều LD50 trên chuột là 0,125g/kg tương đương với liều độc của cocain hydroclorid [6]

(A) (B)

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của roemerin (A) và cepharantin (B) [6]

Cepharantin có công thức hóa học C37H38N2O6 được phân lập lần đầu

tiên từ loài Bình vôi Nhật Bản (Stephania cepharantha Hayata) là một loại

alkaloid có giá trị rất lớn trong y học Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka và cs (1984), cepharanthin có tác dụng dãn mạch nhẹ trên những mạch

vi tuần hoàn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu hoặc sắc tố máu hầu như không có thay đổi khi dùng cepharanthin Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện [6], [23]

Năm 1941, Trần Xuân Thuyết và cs đã phát hiện ra rotundin có tác dụng

an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn, đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết suất được rotundin [10] Sau này, rotundin được sử dụng làm thuốc an thần và giảm đau dưới dạng thuốc bột, thuốc viên, thuốc tiêm và được ghi trong dược điển một số nước.Tác dụng chủ yếu của rotundin là an thần, gây ngủ, hạ nhiệt,

hạ huyết áp, kéo dài thời gian tác dụng của các thuốc ngủ barbituric trên động vật thí nghiệm Với liều cao có tác dụng chống co giặt do corasol, strychnin và sốc điện [6]

Ngoài tác dụng an thần giảm đau, rotundin còn có tác dụng điều hòa nhịp tim, hạ huyết áp, giãn cơ trơn, do đó làm giảm các cơn đau do co thắt ở đường

ruột và tử cung Rotundin được dùng trong các trường hợp lo âu, căng thẳng do

các nguyên nhân khác nhau dẫn đến mất ngủ [6]

1.3 Nâng cao hàm lượng dược chất có hoạt tính bằng kỹ thuật chuyển gen

1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh

khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Agrobacterium do khả năng của nó trong việc nhận biết và phản ứng chính xác với các tín hiệu hóa học có nguồn gốc từ vết thương của thực vật Vào năm 1980, các nhà khoa học đã phát hiện ra khả

năng chuyển gen vào thực vật của loài vi khuẩn này Nhờ đó, A tumefaciens

đã được sử dụng phổ biến để chuyển gen thực vật

A tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật nhờ vào việc

nó nhận biết chính xác các tín hiệu có nguồn gốc từ thực vật để kích hoạt các gen độc lực, các gen này chịu trách nhiệm chuyển và tích hợp DNA đã chuyển (T-DNA) từ plasmid gây khối u (Ti) vào nhân tế bào thực vật Sự biểu hiện của T-DNA trong vật chủ dẫn đến việc sản xuất một lượng lớn axit indole-3-acetic (IAA), cytokinin (CK) và opines Sự xuất hiện của IAA và

CK kích thích sự phát triển của thực vật dẫn đến sự phân chia mất kiểm soát

và các mô không xảy ra biệt hóa mô thực dần hình thành khối u Sự xâm nhiễm chỉ xảy ra khi tế bào thực vật bị tổn thương

plasmid là một phân tử ADN mạch vòng, trong tế bào vi khuẩn plasmid tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập không phụ thuộc vào sự nhân đôi vật chất di truyền của vi khuẩn Ti-plasmid có hai vùng chính liên quan đến sự hình thành u, vùng T được chuyển vào tế bào thực vật trong quá trình hình thành u, còn vùng vir (virulence region) xúc tiến và quyết định cho việc giải phóng sợi T-ADN khỏi Ti-plasmid đến tế bào thực vật Trên Ti plasmid, chỉ có duy nhất vùng T-ADN được chuyển từ tế bào vi khuẩn sang

Ti-tế bào của vật chủ

Vùng ranh giới nằm hai bên T-ADN được giới hạn bằng bờ trái (left border) và bờ phải (right border) là yếu tố cần thiết cho quá trình xâm nhập của T-ADN vào tế bào chủ Các gen nằm trên T-ADN không cần thiết hay gây ảnh hưởng tới quá trình xâm nhiễm, chuyển gen vào tế bào chủ Do vậy nếu thay thế các gen nằm trên T-ADN bằng những gen quý cần được chuyển gen thì chúng có thể được chuyển vào nhân tế bào chủ và hợp nhất với gen trong nhân của tế bào thực vật mà không hề gây ảnh hưởng tới khả năng hoạt

động hay các khả năng sinh học khác của vi khuẩn A tumefaciens Vị trí

hợp nhất của T-ADN với ADN của tế bào thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên, T-ADN ổn định trong gen nhân và nhân bản cùng ADN nhân Sau quá trình xâm nhiễm thì những tế bào thực vật này vẫn có khả năng tái sinh và phát triển bình thường

Sự chuyển giao và tích hợp T-DNA vào nhân tế bào thực vật được thực hiện qua trung gian của một tập hợp phức tạp của vi khuẩn

Agrobacterium và protein của vật chủ Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào

thực vật: Tế bào thực vật khi bị thương tiết ra các hợp chất có bản chất là phenol, chất này sẽ thu hút vi khuẩn đồng thời hoạt hóa các gen vir là A, B,

C, D, E, F, G Sự chuyển T-DNA bắt đầu khi vi khuẩn A tumefaciens bám

vào thành tế bào thực vật ở vị trí gắn đặc trưng Hợp chất phenol được nhận biết đầu tiên bởi gen virA Gen virA tổng hợp nên protein để đáp ứng sự trao đổi chất với vết thương ở tế bào chủ Protein VirA tự phosphoryl hóa kéo theo sự phosphoryl hóa của protein VirG và kích thích sự sao mã các gen vùng vir còn lại Tiếp theo các protein VirD và VirE giải phóng T-DNA khỏi Ti-plasmid với đầu 5’ đi trước, protein VirE2 có chức năng bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của nuclease trong tế bào thực vật Sự chuyển T-DNA vào

tế bào thực vật qua kênh xuyên màng do protein VirB tạo ra [20]

Hình 1.5 Sự tương tác của A tumefaciens và cơ chế chuyển T-DNA

Ưu điểm của việc chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens là: Có thể

áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào, nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật; Có thể xử lý một lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn; Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát ngay sau vài ngày thực hiện biến nạp

1.3.2 Thành tựu chuyển gen ở thực vật thông qua chuyển gen uidA nhờ

A tumefaciens

Những thành tựu của công nghệ chuyển gen thực vật đã đem lại những lợi ích to lớn cho nhiều ngành như ngành công nghiệp thực phẩm, ngành y học Cùng với sự phát triển của công nghệ này thì nhiều năm trở lại đây, các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã quan tâm hơn tới việc xây dựng quy trình chuyển gen ở loài cây lương thực, cây thực phẩm và cây lâm nghiệp

Và một trong các nghiên cứu phổ biến để làm tiền đề cho việc xây dựng chuyển gen đích vào cây là việc xây dựng quy trình chuyển gen mã hóa β-

glucuronidase [uidA (GUS)]

β-glucuronidase được phân lập từ chủng E coli RA201, là một hydrolase

xúc tác cho sự phân giải β-glucuronide, kết quả cho sản phẩm có màu xanh lam đặc trưng Cơ chất của β-glucuronidase thường dùng trong phản ứng để nhận

biết sự tồn tại của gen uidA là X-gluc

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Tế bào chất

Tế bào thực vật

glucuronide) Dung dịch X-gluc không màu nhưng dưới tác động của glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam Nhờ yếu tố đặc biệt này nên gen

β-uidA đã được các nhà khoa học lựa chọn để thiết kế vào các vector chuyển gen

làm chỉ thị nhận biết gen chuyển có mặt ở mô, tế bào thực vật [24]

Những năm gần đây, các nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở

Việt Nam thông qua xây dựng quy trình chuyển gen chỉ thị uidA được các nhà

khoa học quan tâm Trong lĩnh vực nghiên cứu chuyển gen ở cây lúa, Đoàn Thu Thủy và cs (2008) đã nghiên cứu và đánh giá sự hoạt động của 4 promoter (Rd29A, Gt1, RCg2 và CaMV35S) nhằm chọn ra một promoter thích hợp cho

quá trình chuyển gen vào cây lúa thông qua sự biểu hiện của gen uidA , tác giả

nhận thấy, các promoter khác nhau không có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình

thành mô sẹo và khả năng tái sinh in vitro Kết quả gen uidA biểu hiện bền vững chỉ quan sát được ở cây chuyển gen khi sử dụng promoter RCg2 [15]

Nghiên cứu cải tiến quy trình chuyển gen ở lúa của Hoàng Thị Giang và cs (2015), theo hướng thao tác đơn giản, giảm thiểu khối lượng công việc, nhưng

hiệu suất chuyển gen cao Theo quy trình này, dịch khuẩn A tumefaciens có

mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu với tần số biểu hiện gen uidA ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp Đánh giá sự biểu hiện của gen uidA và

phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền ổn định của

gen chuyển sang thế hệ sau [2]

Đối với đối tượng là cây đậu tương, Đinh Thị Phòng và cs (2007) đã

nghiên cứu chuyển gen uidA và thành công, kết quả thời gian nhiễm khuẩn cho hiệu quả biến nạp cao nhất là 2 giờ, gen uidA biểu hiện qua tỷ lệ mẫu sống sót

là 67,5%, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi là 47% và hiệu quả biểu hiện gen uidA ở cây tái sinh in vitro đạt 12,8% [12] Theo Vũ Thị Lan và cs (2013) khi nghiên cứu

cây khoai lang với vật liệu nhận gen là mảnh cấy từ đỉnh ngọn được nhiễm với

A tumefaciens CV58 ở nồng độ OD600nm = 0,8, bổ sung AS 150µM trong 20 -

30 phút, thu được tỉ lệ biểu hiện tạm thời gen uidA cao nhất (38%) Mô sẹo

chuyển gen được chọn lọc trên môi trường CP3 bổ sung cefotaxim 500 mg/l,

kanamycine 50 mg/l trong 3 - 4 tuần Chồi tái sinh từ các mô sẹo sống sót được chọn lọc tiếp trên môi trường ra rễ MS bổ sung kanamycine 100 mg/l Kết quả

ban đầu về chuyển gen uidA vào giống khoai lang KB1 là hầu hết các dòng mô sẹo sống sót đều biểu hiện hoạt động gen uidA (có màu xanh chàm rất đậm) và thu được 8/21 dòng cây khoai lang chuyển gen uidA ra rễ trên môi trường chọn

lọc bổ sung kanamycine 50 mg/l [7]

Nghiên cứu chuyển gen cũng được tiến hành trên cây lan hồ điệp, Trần

Lê Lưu Li và cs (2008) đã công bố thí nghiệm chuyển gen lây nhiễm nhờ vi

khuẩn A tumefaciens mang vector có gen uidA và thu được kết quả biểu hiện uidA tối ưu ở nồng độ AS 50μM sau 4 ngày đồng nuôi cấy [8]

Ngoài đối tượng cây lúa, đậu tương hay lan hồ điệp cũng có nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen thông qua việc xây dựng quy trình

chuyển gen chỉ thị uidA trên các cây khác như cà chua, dưa hấu, dừa hay một

số loại cây dược liệu nhằm nâng cao dược tính cũng đang được quan tâm

Điển hình là chuyển gen ở cây dừa cạn nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogens (A rhizogens) đang được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây Năm 2010, Wang CT và cs đã chuyển gen G10H và ORCA3 (một nhân

tố của họ AP2) vào cây Dừa cạn thông qua vi khuẩn A rhizogens MSU440

Kết quả cho thấy khi phân tích mức độ tích lũy alkaloid tất cả các cây chuyển gen đều tích lũy catharanthine nhiều gấp 6,5 lần so với những cây không

chuyển gen và mức độ tích lũy cao nhất ở các cây chuyển gen OG12 Sau khi

xử lý với ABA, mức độ tích lũy catharanthine đạt 1,96 mg/g khối lượng khô ở

cây chuyển gen OG12 [27] Cũng trong năm 2010, Mohsen Zargar và cs công

bố nghiên cứu chuyển gen vào rễ cây Dừa cạn khi sử dụng lá mầm trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP và NAA Sau 10 ngày ra rễ trên môi trường MS cơ bản, rễ có chiều dài 8-9 cm và hình thái cây Dừa cạn chuyển gen không có gì khác so với cây bình thường [22] Tới năm 2012, Wang Q và

cs đã đề xuất quy trình chuyển gen thông qua A tumefaciens EHA105 sử dụng gen chỉ thị uidA Trong nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng vật liệu

chuyển gen là lá mầm, nuôi cấy trên môi trường MS có chứa AS 100 µM, thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút có bổ sung kanamycine Sau khi chuyển thành

công gen chỉ thị uidA vào cây Dừa cạn Tác giả dựa trên quy trình đó và đã chuyển gen CrDAT vào cây Dừa cạn [28]

Cũng với đối tượng nghiên cứu là cây dừa cạn Đến năm 2016, Đỗ Huy Hoàng đã nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn

(Catharanthus roseus (L.) G Don) thành công nhờ vào việc sử dụng gen chỉ thị uidA Tác giả đã tối ưu nhất được một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chuyển

gen như vật liệu chuyển gen là lá mầm, nồng độ vi khuẩn OD600nm = 0,8, nồng độ acetosyringone là 100µM, thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút, nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen là 50 mg/l dựa trên quy trình đã xây

dựng, tác giả đã chuyển thành công cấu trúc mang gen uidA vào cây [4]

1.4 Một số nghiên cứu về cây Bình vôi

Sự phát hiện cũng như dẫu đầu cho quá trình nghiên cứu Bình vôi ở Việt Nam vào năm 1940, Bùi Đình Sang đã nghiên cứu và chiết được ở củ Bình vôi các chất: tinh bột, đường khử oxy, axit malic, men oxydaza và một alkaloid với

tỷ lệ 1,2 - 1,5% (tính trên củ tươi), được ông đặt tên là rotundin Đến năm 1941, Trần Xuân Thuyết, Đỗ Tất Lợi, Bonnet và Bùi Đình Sang đã nghiên cứu chiết suất thành công được rotudin từ cây Bình vôi Tới năm 1964, Ngô Văn Thu nghiên cứu thành phần dịch chiết từ củ Bình vôi tìm ra được một alkaloid khác

có dược tính và đặt tên là roemerin [10]

Ngoài các alkaloid trên, tùy từng cây Bình vôi trồng ở các vùng khác nhau cũng sẽ có các loại alkaloid khác nhau Theo Phạm Thanh Kỷ và cộng sự,

trong củ của loài S.sinica có alkaloid chính là rotundin (1,2-15%) Loài S.cepharantha tác giả đã phân lập được alkaloid chính là cepharanthin và

những alkaloid phụ khác như: isotetrandin berbamin, cepharanolin, cycleanin, stephanin, crebanin,o-nornuciferin, stesakin, palmatin, cepharamin Trong củ

loài S.dielsiana có: crebanin (0,3%), sinoacutin (0,2%), stephanin (0,2%),

tetrahydropalmatin (0,1%) và dehydrostephanin Hay trong củ loài

S.brachyandra có: isocorydin (1,5%), tetrahydropalmatin (0,2%), dicentrin

(0,3%), sinomenin (0,1%), corytuberin (0,04%), sinoacutin (0,006%), dehydrodicentrin (0,006%), isoboldin (0,004%), dihydrosalutaridin (0,001%)

và N-metyllaurotetanin (0,006%) [5],[6]

Theo Phạm Thanh Kỳ, cách chiết xuất rotundin như sau: Củ bình vôi phơi khô tán nhỏ, gói vào vải gạc rồi đem ép hết nước có vị đắng hoặc tới khi nào cho tủa với thuốc thử Mayer Lấy nước vừa ép dùng nước vôi trong kiềm hóa đến pH 9-10, rotundin thô sẽ kết tủa xuống, đổ bỏ nước trong ở trên Lọc lấy tủa, rửa lại tủa bằng nưóc máy Lấy tủa đem phơi khô Tinh chế: chiết rotundin thô bằng cổn 90o trong bình Zaixenko hay Soclet trong khoảng 2 giờ (cho đến hết phản ứng alkaloit) Acid hoá dịch chiết bàng HCI đặc tới pH=4

Để nguội rotundin hydroclorid tủa xuống, kết tinh lại 1 - 2 lần Lọc lấy tinh thể, rửa bằng 1 - 2ml ete Sấy nhẹ cho khô ta thu được rotundin ở dạng tinh thể [6]

Qua định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận của cây và theo dõi quá trình thay đổi của chúng trong suốt quá trình phát triển của cây, Carey (1987) nhận ra rằng nơi tạo ra alkaloid không phải luôn là nơi tích tụ Nhiều alkaloid được tạo ra ở rễ nhưng được vận chuyển lên các bộ phận khác của cây, sau khi thực hiện các biến đổi chúng chuyển sang tích lũy ở lá, quả hoặc hạt [19]

Khi trồng cây Bình vôi trong tự nhiên thường dùng đoạn thân, cành bánh tẻ và các mảnh củ (cắt từ phần gốc) và trồng vào mùa xuân, tuy nhiên tốc

độ sinh trưởng, phát triển rất chậm, tỉ lệ sống sót chỉ đạt được khoảng 33% Cây Bình vôi trong tự nhiên chủ yếu sinh sản, phát tán bằng hạt, khi quả chín

có màu đỏ hoặc cam rụng xuống đất thì hạt sẽ nảy mầm vào khoảng mùa xuân, hoặc thu hái hạt từ quả chín vào khoảng tháng 8-10, lấy hạt bảo quản trong cát

ẩm rồi gieo hạt vào mùa xuân (tháng 2, tháng 3) Tỉ lệ nảy mầm của hạt Bình vôi cũng rất khác nhau ở các điều kiện, cao nhất chỉ đạt 85% khi hạt còn tươi Cây Bình vôi được mọc tự nhiên bằng hạt sinh trưởng nhanh, sau khoảng 4 tháng tuổi, củ dần dần được hình thành từ gốc dưới gần rễ của thân Ngoài ươm