Với nhiều công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực này đã đem lại lợi ích cho ngành y học khi ứng dụng công nghệ chuyển gen đã giúp tăng mạnh gấp nhiều lần nồng độ dược chất quý v
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ DIỄM QUỲNH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN UIDA VÀO CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunada Lour.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ DIỄM QUỲNH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN UIDA VÀO CÂY BÌNH VƠI (Stephania rotunada Lour.) Ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Phú Hiệp THÁI NGUYÊN - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan thực việc kiểm tra mức độ tương đồng nội dung luận văn qua phần mềm Turnitin cách trung thực đạt kết mức độ tương đồng % Bản luận văn kiểm tra theo phần mềm cứng nộp để nghiệm thu trước hội đồng Nếu sai tơi hồn tồn chịu trách nhiệm Thái Nguyên, ngày tháng 10 năm 2022 TÁC GIẢ CỦA SẢN PHẨM HỌC THUẬT (Kí ghi rõ họ tên) Ngô Diễm Quỳnh i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy giáo: TS Hồng Phú Hiệp giáo PGS.TS Phạm Thị Thanh Nhàn bảo, động viên, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình tơi nghiên cứu, thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn hỗ trợ Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09 Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền học Công nghệ sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có nhiều góp ý sâu sắc cho tơi q trình học tập hồn thiện nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn cô Cao Thị Phương Thảo, Trần Thị Hồng, cán phòng thí nghiệm Khoa Sinh học tạo điều kiện tốt giúp tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè động viên, quan tâm, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình học tập nghiên cứu Trong trình nghiên cứu thực đề tài thời gian có hạn, cịn nhiều thiếu sót chun mơn kỹ thuật nên khó tránh khỏi thiếu sót hạn chế nghiên cứu tơi mong nhận đóng góp, bảo q thầy bạn bè để luận văn hoàn thiện Thái Nguyên, tháng năm 2022 Học viên Ngô Diễm Quỳnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Bình vơi 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học Bình vơi 1.1.3 Một số tác dụng trạng khai thác Bình vơi 1.2 Alkaloid tác dụng alkaloid Bình vơi 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Alkaloid Bình vơi 1.3 Nâng cao hàm lượng dược chất có hoạt tính kỹ thuật chuyển gen 11 1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens 11 1.3.2 Thành tựu chuyển gen thực vật thông qua chuyển gen uidA nhờ A tumefaciens 13 1.4 Một số nghiên cứu Bình vơi 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu, dụng cụ hóa chất 20 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Thiết bị hóa chất 20 iii 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 21 2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu Bình vôi tái sinh đa chồi từ đoạn thân 21 2.2.3 Phương pháp xây dựng quy trình chuyển gen 22 2.2.4 Phương pháp xử lí số liệu 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Xác định mật độ tế bào A tumefaciens phù hợp cho chuyển gen Bình vơi 25 3.2 Xác định nồng độ acetosyringone phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân Bình vơi 28 3.3 Xác định thời gian nhiễm khuẩn A tumefaciens phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân Bình vơi 29 3.4 Xác định thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân Bình vơi 30 3.5 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để chọn lọc chồi tái sinh in vitro chuyển gen 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 43 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Ảnh hưởng mật độ A tumefaciens đến tỷ lệ biểu gen uidA tạm thời 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ AS đến tỷ lệ biểu tạm thời gen uidA 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ biểu tạm thời gen uidA 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ biểu tạm thời 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ kanamycine đến chọn lọc mẫu chuyển gen 32 Bảng 3.6 Kết chuyển gen uidA vào Bình vơi điều kiện tối ưu 34 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Bình vơi Hình 1.2 Mặt trước sau Bình vơi Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo rotundin (L - tetrahydropalmatine) [6] Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo roemerin (A) cepharantin (B) [6] 10 Hình 1.5 Sự tương tác A tumefaciens chế chuyển T-DNA 13 Hình 2.1 Khuẩn AGL1_PZY102 (A) sơ đồ cấu trúc vector pCB-gusplus (B) 20 Hình 2.2 Sơ đồ khái quát thí nghiệm chuyển gen Bình vơi 22 Hình 3.1 Mẫu Bình vôi in vitro 25 Hình 3.2 Mẫu Bình vơi chuyển gen môi trường SIM sau tuần nuôi cấy 33 Hình 3.3 Kết biểu gen uidA 34 Hình 3.4 Quy trình chuyển gen uidA vào Bình vôi 35 v DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AS A tumefaciens BAP Tiếng Anh Tiếng Việt Acetosyringone Agrobacterium tumefaciens Benzylaminopurine cs Cộng CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli GM uidA/GUS LB Môi trường đồng nuôi cấy Môi trường nảy mầm Germination medium β-Glucuronidase Môi trường dinh dưỡng Luria Bertani nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige and Skoog medium Môi trường dinh dưỡng MS OD Optical density Mật độ quang RM Rooting medium Môi trường tạo rễ SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trường cảm ứng tạo chồi Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào T-DNA thực vật Ti-plasmid Vir X-gluc Tumor inducing - plasmid Virulence region 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-glucuronide vi Plasmid gây khối u MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây Bình vơi (Stephania rotunda Lour thuộc họ Tiết dê - Menispermaceae) loài dược liệu từ lâu đời sử dụng y học cổ truyền để điều trị nhiều chứng bệnh Cây Bình vơi lồi phân bố phổ biến vùng Đơng Á Ở Việt Nam lồi Bình vơi phân bố rộng miền, thường ưa mọc vùng có núi đá vơi như: Thanh Hóa, Hà Giang, Tun Quang, Hịa Bình, Cao Bằng, Vũng Tàu… Đây loại dược liệu quý có tác dụng an thần, dưỡng huyết, nhiệt, giải độc, giảm đau Thường sử dụng phần củ để làm thành thuốc chữa bệnh: ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau dày, trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Trong loại dược chất có hoạt tính củ, L - tetrahydropalmatin (rotundin) sử dụng nguyên liệu để tạo thuốc điều trị an thần, ngủ Tuy nhiên Bình vơi hoang dã Việt Nam bị sụt giảm mạnh khai thác bừa bãi khơng có kế hoạch trồng tái sinh, Bình vơi ghi Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) Danh mục Thực vật rừng quý (nhóm 2) Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 Chính phủ [18] Trong thập kỷ vừa qua, công nghệ sinh học đem lại thành to lớn, đặc biệt công nghệ chuyển gen thực vật với kĩ thuật chuyển gen cho phép người can thiệp đưa một vài gen quý vào thể thực vật tạo thực vật biến đổi gen nhằm thay đổi cải thiện số đặc tính thực vật theo hướng có lợi cho người Với nhiều cơng trình nghiên cứu thành cơng lĩnh vực đem lại lợi ích cho ngành y học ứng dụng công nghệ chuyển gen giúp tăng mạnh gấp nhiều lần nồng độ dược chất quý vốn có dược liệu, tránh cho việc khai thác mức nguồn dược liệu để làm thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh Hàm lượng dược chất cụ thể rotundin Bình vơi tự nhiên thấp, tùy thuộc loài điều kiện sinh thái Vì định hướng nghiên cứu