2.1.1. Vật liệu
Mẫu cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) đã được định danh và trồng tại Vườn thực nghiệm của Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Chủng Agrobacterium tumefaciens (AGL1_PZY102) mang vector chuyển gen pCB-gusplus có gen uidA do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
(A) (B)
Hình 2.1. Khuẩn AGL1_PZY102 (A) và sơ đồ cấu trúc vector pCB-gusplus (B) 2.1.2. Thiết bị và hóa chất
2.1.2.1. Hóa chất
Đề tài sử dụng các hóa chất như kháng sinh kanamycin, carbenicillin, cefotaxim và rifamycine, 6-Benzylaminopurine (BAP), Indole-3-butyric acid (IBA), 1-Naphthaleneacetic acid (NAA), Acetosyringone (AS) từ hãng Bio- world (Mỹ); X-gluc từ hãng Thermo (Mỹ), bột môi trường LB (Sigma, Mỹ)…
Ngoài ra, các hóa chất khác được sử dụng trong thí nghiệm như cồn, HgCl2, sucrose, agar, nước dừa có nguồn gốc của Việt Nam.
2.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Nồi khử trùng (Tomy, Nhật Bản), tủ cấy vô trùng Biological Safety Cabinets (Nuarie, Mỹ), máy nuôi cấy lắc ổn nhiệt (Mỹ), tủ sấy (Heraeus), cân điện tử (Đức), máy chuẩn pH tự động (Thụy Sỹ), tủ ấm Binder (Đức),…
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu khoa học được thực hiện tại các phòng: Vi sinh vật, Công nghệ gen, Công nghệ tế bào thuộc Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 4/2021 đến tháng 9/2022.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường MS cơ bản và môi trường LB. Các môi trường đều được chuẩn pH và khử trùng.
Môi trường dinh dưỡng được sử dụng để nuôi cây vô trùng là môi trường MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8,5g/l, chuẩn pH=5,8. Sau đó được hấp khử trùng bằng nồi hấp ở 121ºC trong 30 phút. Thành phần môi trường MS được trình bày ở Phụ lục 1.
Môi trường sử dụng để nuôi khuẩn là môi trường LB lỏng. Thành phần môi trường LB gồm có: Peptone 10g/l + Yeast Extract 5g/l + Muối NaCl 10g/l, chuẩn pH=7. Sau đó được hấp khử trùng bằng nồi hấp ở 121ºC trong 30 phút.
2.2.2. Phương pháp khử trùng mẫu Bình vôi và tái sinh đa chồi từ đoạn thân Vật liệu được sử dụng nhân giống in vitro cây Bình vôi là đoạn thân non, bánh tẻ có chồi ngủ. Mẫu cây được cắt thành các khúc 4-5 cm ngâm trong dung dịch xà phòng loãng. Sau 30 phút, rửa sạch mẫu. Các bước khử trùng tiếp theo được tiến hành trong box cấy vô trùng, mẫu lắc trong HgCl2 (0,1%) thời gian 5 phút, 7 phút và 9 phút. Mẫu được rửa sạch lại 3-5 lần bằng nước cất vô trùng và cấy vào môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l. Đánh giá kết quả khử trùng sau hai tuần nuôi cấy.
Các mẫu sạch sống sót sau hai tuần nuôi cấy được chuyển vào môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l + BAP 2 mg/l (tiến hành trong box cấy vô trùng) để tạo mẫu cây con vô trùng.
Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ chiếu sáng 30 - 40 Em-2s-1, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ ngày.
2.2.3. Phương pháp xây dựng quy trình chuyển gen
Phương pháp chuyển gen được tiến hành theo phương pháp của Olhoft và cs (2001) [25].
Mẫu (đoạn thân chứa chồi ngủ) Chủng vi khuẩn Agrobacterium mang gen uidA
Khử trùng bằng HgCl2 0,1% Nuôi lỏng tạo huyền phù ở 28oC
Sinh trưởng trên MS+ BAP 2,0mg/l
Ly tâm sinh khối, tạo huyền phù trong môi trường nhiễm khuẩn, (thăm dò OD600= 0,2;
0,4; 0,6; 0,8; 1,0)
Đoạn thân mang mắt chồi có kích thước 1-1,5 cm
cảm ứng trong dung dịch huyền phù có AS (thăm dò nồng độ AS 50mg/l, 100mg/l, 150mg/l, 200mg/l)
Lây nhiễm (thăm dò thời gian lây nhiễm: 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút)
Đồng nuụi cấy ở điều kiện tối trong mụi trường CCM + AS 100 àM (Thăm dũ 2 ngày, 3 ngày)
Chuyển mô sang môi trường diệt khuẩn SIM 2 tuần
Lấy mẫu đi nhuộm màu, tẩy diệp lục đánh giá sự biểu hiện tạm thời của gen uidA
Hình 2.2. Sơ đồ khái quát thí nghiệm chuyển gen cây Bình vôi
Môi trường tái sinh cây Bình vôi chuyển gen được thể hiện ở Phụ lục 1, Phụ lục 2. Sử dụng gen chỉ thị uidA để xây dựng quy trình chuyển gen cho cây
Bình vôi. Thông qua chuyển gen uidA, mật độ tế bào A. tumefaciens , nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn và nồng độ kanamycine được tối ưu làm cơ sở cho chuyển gen đích vào cây Bình vôi. Các bước thí nghiệm thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.2.
Các bước cụ thể như sau:
Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi Cấy trải A. tumefaciens cất giữ trong glycerol lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kanamycine 50 mg/l và rifamicine 50 mg/l, nuôi ở 28oC trong 48 giờ. Sau đó, lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycine và rifamicine, nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 28oC trong 16 - 18 giờ. Tiếp theo nuôi hoạt hóa lấy theo tỉ lệ 1 ml dịch vi khuẩn, 10 ml LB lỏng ở tốc độ 220 vòng/phút ở 28oC trong 3 - 4 giờ. Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần 2 ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút, ở 4oC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trường 1/2 MS và pha loãng cho tới mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1,0.
Vật liệu chuyển gen bao gồm: Đoạn thân mang mắt chồi ngủ được gây tổn thương phần mắt chồi, cuống là và mảnh lá được gây tổn thương xung quanh. Sau đú ngõm mẫu trong dịch huyền phự vi khuẩn cú bổ sung AS 100 àM, trong 20 phút sau đó thấm khô, cấy trên môi trường môi trường đồng nuôi cấy:
MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l + muối B5 0,3 g/l + AS 100 àM. Nuụi trong tối 3 ngày ở 25oC.
Xác định nồng độ AS phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi
Các bước nghiên cứu được tiến hành giống như ở trên, chỉ khác là dung dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens được bổ sung để dẫn dụ vi khuẩn với bốn nồng độ AS: 50 M, 100 M, 150 M và 200 M.
Xác định thời gian nhiễm A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi Làm các bước tương tự như trên, tuy nhiên lá mầm và đoạn thân được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn với thời gian là 15 phút, 20 phút, 25 phút và 30 phút.
Xác định thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi
Làm các bước tương tự như trên, tuy nhiên mẫu sau khi biến nạp được tiến hành đồng nuôi cấy với 2 khoảng thời gian là 2 ngày và 3 ngày.
Xác định nồng độ kanamycine thích hợp để chọn lọc chồi chuyển gen
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ kanamycine đến khả năng sinh trưởng, phát triển của chồi Bình vôi, các đoạn thân mang mắt tạo chồi bên (không chuyển gen) đã được nuôi trên môi trường có bổ sung các nồng độ kanamycine khác nhau là 25 mg/l; 50 mg/l; 75 mg/l; 50 mg/l + 500mg/l cefotaxime. Theo dõi tỷ lệ diệt khuẩn và tỷ lệ tạo chồi sau 2 tuần.
Phân tích biểu hiện tạm thời gen uidA
Sau 4 tuần, chuyển các mẫu tạo chồi lên môi trường: MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l + muối B5 3 g/l + BAP 1,5 mg/l để kéo dài chồi (có bổ sung kanamycine và cefotaxime).
Phân tích biểu hiện gen uidA bằng nhuộm hóa mô tế bào để kiểm tra sự biểu hiện bền vững gen uidA trong cây Bình vôi chuyển gen theo phương pháp của Jefferson và cs (1987) [24]. Các mẫu được nhuộm với dung dịch 5-bromo- 4- chloro-3-indolyl glucuronide (X-gluc) có nồng độ 0,05% trong đệm 50mM NaH2PO4, 50mM Na2HPO4, 0,1% Triton X100 pH=7,0. Để 8 - 12 giờ trong tối ở nhiệt độ 37oC. Sau đó rửa bằng cồn 70% ba lần và quan sát dưới kính hiển vi, những vùng biểu hiện gen uidA có màu xanh chàm đặc trưng.
Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn này được tính theo công thức:
Hiệu suất chuyển gen (%) =
Số dòng cây chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc/dương tính với RT- PCR
x100%
Tổng số mẫu biến nạp 2.2.4. Phương pháp xử lí số liệu
Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thập số liệu, sẽ được tính toán trên phần mềm Excel, IBM SPSS Statistics 2.0 của các giá trị thống kê về giá trị trung bình (X), sai số trung bình mẫu (mx).