Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. Xác định thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho chuyển gen vào đoạn thân ở cây Bình vôi
Đồng nuôi cấy cũng là một trong các giai đoạn quan trọng cho việc xâm nhập của vi khuẩn A. tumefaciens vào trong tế bào thực vật. Nghiên cứu tiến hành xác định thời gian đồng nuôi cấy phù hợp bằng cách tiến hành đồng nuôi cấy trong 3 mốc thời gian là 2 ngày, 3 ngày và 5 ngày, kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ biểu hiện tạm thời Thời gian
đồng nuôi cấy (phút)
Số mẫu lây nhiễm
Số mẫu biểu hiện gen uidA
Tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm thời
(%)
2 ngày 50 36,67b ± 0,58 73,34
3 ngày 50 44,33c ± 1,53 88,66
5 ngày 50 18,33a ± 1,53 36,66
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê p < 0,05 với phép thử Duncan
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, thời gian đồng nuôi cấy khác nhau thì ảnh hưởng khác nhau tới tỷ lệ biểu hiện gen uidA ở đoạn thân mang mắt chồi bên.
Ở thời gian ngưỡng thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày, tỷ lệ mẫu biểu hiện uid chỉ đạt 73,34%. Đối với ngưỡng thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày, tỷ lệ biểu hiện gen cao hơn và đạt 88,66%. Tỉ lệ Tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm thời sau 5 ngày đồng nuôi cấy giảm còn 36,66 %, số mẫu chết tăng. Ngoài ra, các mẫu sau đồng nuôi cấy 3 ngày có sự biểu hiện gen uidA tạm thời trên toàn bộ mỗi mẫu được chuyển gen. Theo Trần Lê Lưu Li và cs (2008) thu được kết quả biểu hiện uidA tối ưu ở sau 4 ngày đồng nuôi cấy đối với cây lan hồ điệp [8]. Điều này có thể lí giải do cấu tạo của từng cây và mẫu vật sử dụng cũng khác nhau nên sẽ có thời gian đồng nuôi cấy tối ưu khác nhau.
Vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, thời gian đồng nuôi cấy phù hợp nhất để chuyển gen vào cây Bình vôi là 3 ngày.
3.5. Xác định nồng độ kanamycin thích hợp để chọn lọc chồi và tái sinh in vitro cây chuyển gen
Việc chọn lọc và xác định những cá thể mang gen chuyển là khâu rất quan trọng trong quá trình chuyển gen. Để chọn lọc có hiệu quả, cần xác định được nồng độ chất chọn lọc phù hợp giúp cho việc loại bỏ phần lớn mẫu biến nạp không được chuyển gen, đồng thời giữ lại các mẫu chuyển gen. Trong nghiên cứu này, vector mang gen uidA chứa gen chọn lọc nptII kháng kháng sinh kanamycine, do vậy thí nghiệm xác định ngưỡng nồng độ kháng sinh chọn lọc kanamycine phù hợp cho chọn lọc cây Bình vôi chuyển gen được bố trí ở 3 thang nồng độ: 25 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l.
Tiến hành chuyển gen uidA vào đoạn thân thông qua A. tumefaciens . Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, mẫu được chuyển lên môi trường tạo chồi có bổ sung ba nồng độ Km là 25 mg/l, 50 mg/l và 75 mg/l và thêm một môi trường kanamycine 50mg/l có bổ sung cefotaxime 500mg/l để xác định ngưỡng chọn lọc kháng sinh thích hợp cho chồi chuyển gen. Tiếp tục theo dõi tỉ lệ mẫu tạo chồi sau 2 tuần và 4 tuần, kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ kanamycine đến chọn lọc mẫu chuyển gen Nồng độ
kanamycin (mg/l)
Số mẫu thử nghiệm
Mẫu sạch khuẩn sống sót
(sau 2 tuần) Mẫu tạo chồi (sau 4 tuần) Số mẫu Tỷ lệ % Số mẫu Tỷ lệ % 25 50 25,33c ± 1,53 50,66 11,33c ± 0,58 44,72 50 50 12,33b ± 1,53 24,66 1,67b ± 0,58 13,54 75 50 5,67a ± 0,58 11,34 0,33a ± 1,00 5,82 50 mg/l +
cefotaxime 500 mg/l
50 14,33b ± 0,58 28,66 2,33b ± 0,58 16,26 Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý
nghĩa thống kê p < 0,05 với phép thử Duncan
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, kanamycin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng chọn lọc chồi chuyển gen. Sau 4 tuần, nồng độ kháng sinh kanamycin 25 mg/l cho tỉ lệ mẫu nảy chồi khá cao là 44,72%. Nồng độ kháng sinh kanamycin 25 mg/l tỏ ra không thích hợp cho chọn lọc mẫu chuyển gen, tỉ lệ mẫu sống sót khá lớn đồng nghĩa với hiệu quả chọn lọc chưa cao. Khi tăng nồng độ kháng sinh kanamycin lên 50 mg/l tỉ lệ mẫu sống sót tạo chồi giảm còn 13,54%, tiếp tục tăng nồng độ lên 75 mg/l thì tỉ lệ sống sót tái sinh giảm mạnh chỉ còn 5,82 %. Điều này cho thấy, hiệu quả chọn lọc mẫu chuyển gen ở nồng độ kanamycin 50 mg/l là khá tốt. Những mẫu mang vector chuyển gen sẽ nhận được gen kháng kháng sinh nên sống sót được trên môi trường chọn lọc này. Môi trường có bổ sung kháng sinh nồng độ kanamycin 75 mg/l gần như ức chế hoàn toàn khả năng sống sót của chồi, tỉ lệ mẫu sống sót thu được là rất thấp, chứng tỏ nồng độ kháng sinh cao làm mẫu bị ức chế sinh trưởng, phát triển. Các mẫu không cảm ứng tạo chồi, đã bị chết trên môi trường chọn lọc dần chuyển sang màu vàng nâu.
Để đảm bảo mẫu sạch không nhiễm khuẩn lạ chúng tôi bổ sung thêm cefotaxime 500 mg/l vào môi trường nuôi cấy, kháng sinh cefotaxime không
gây ảnh hưởng hay ức chế sinh trưởng tới thực vật nhưng lại có khả năng diệt khuẩn rất tốt do vậy ở môi trường bổ sung thêm cefotaxime 500 mg/l cho mẫu nảy chồi cao hơn đạt 16,26 %.
Hình 3.2. Mẫu Bình vôi chuyển gen trên môi trường SIM sau 4 tuần nuôi cấy Kanamycin tác động tới tế bào không chuyển gen theo cơ chế liên kết với các tiểu phần nhỏ của riboxom trong tế bào, ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác liên quan trong đó có hoạt động của lục lạp, do vậy cách thành phần của cây mất khả năng hấp thu chất dinh dưỡng, hoạt động của lục lạp bị rối loạn và cây sẽ chết dần. Tuy nhiên mức độ mẫn cảm của mô thực vật với kanamycine thay đổi tùy theo giống, loài thực vật. Theo kết quả nghiên cứu của Đỗ Huy Hoàng (2016), Đặng Thị Hoàng Hà (2016) cũng đưa ra ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycine đối với mẫu cây chuyển gen là 50mg/l [3], [4].
Để khẳng định hiệu quả và điều kiện phù hợp cho chuyển gen vào cây Bình vôi, các mẫu đoạn thân, lá, cuống lá từ các chồi sống sót ở môi trường có bổ sung kanamycin 50mg/l để kiểm tra sự biểu hiện gen. Kết quả nhuộm cho thấy hầu hết lá của các chồi sống sót đều có màu xanh đặc trưng, điều này chứng tỏ gen uidA đã được chuyển vào và biểu hiện trong môi trường nuôi cấy.
Các mẫu bị chết có thể do mẫu không nhận được vector chuyển gen mang gen uidA và gen kháng kháng sinh, hoặc đã được chuyển vào nhưng không tiếp tục phiên mã nên chúng không thể tái sinh trên môi trường chọn lọc. Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ kanamycin 50 mg/l kết hợp
cefotaxime 500 mg/l là ngưỡng chọn lọc thích hợp cho cây Bình vôi chuyển gen trên môi trường SIM.
Kết quả tạo cây Bình vôi chuyển gen màng gen uidA được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả chuyển gen uidA vào cây Bình vôi trong điều kiện tối ưu Đối chứng và
thí nghiệm
Số mẫu biến nạp
Số mẫu tạo cụm chồi
Số chồi tái sinh
Số chồi ra rễ
ĐC 50 20 45 23
ĐC1 50 0 0 0
Chú thích: ĐC là mầm cây Bình vôi chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh; ĐC1 là lá cây Bình vô không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh.
Qua bảng 3.6 cho thấy 20/50 mẫu biến nạp được tái sinh và tạo cụm chồi, 45 chồi được tái sinh trong đó có 23 chồi ra rễ. Sau khi ra rễ, cây Bình vôi in vitro được nhuộm và chụp ảnh dưới kính soi nổi (hình 3.2).
Kết quả hình 3 cho thấy gen uidA đã được chuyển và biểu hiện ở cây Bình vôi, tuy nhiên sự biểu hiện màu khi nhuộm X-gluc chưa đồng đều ở cả cây.
A B C D
E F G H I J Hình 3.3. Kết quả biểu hiện gen uidA
A: Đoạn thân sau biến nạp B: Đoạn thân sau đồng nuôi cấy C, D: Đối chứng không chuyển gen E- I: Mẫu được chuyển gen sau 4 tuần J: Mẫu được chuyển gen tái sinh cây
Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã tối ưu được một số yếu tố điều kiện để chuyển gen chỉ thị uidA vào mẫu đoạn thân Bình vôi là: đoạn thân mang mắt chồi bờn được ngõm trong dịch huyền phự vi khuẩn cú bổ sung AS 100 àM trong 20 phút sau đó thấm khô, cấy trên môi trường môi trường đồng nuôi cấy trong tối 3 ngày ở 25oC; Hiệu suất biểu hiện gen uidA tạm thời của đoạn thân cao nhất tại mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,8; Nồng độ AS phù hợp cho chuyển gen ở cõy Bỡnh là 100 àM; Thời gian lõy nhiễm A. tumefaciens phự hợp là 20 phỳt; Thời gian đồng nuôi cấy phù hợp nhất là 3 ngày; Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, mẫu chuyển gen được rửa sạch khuẩn bằng cefotaxime 500 mg/l trong thời gian 30 phút; hiệu quả chọn cây chuyển gen in vitro bằng kháng sinh kanamycin 50 mg/l kết hợp cefotaxime 500 mg/l.
Quy trình chuyển gen uidA vào cây Bình vôi thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens được tóm tắt ở hình 3.4.
Hình 3.4. Quy trình chuyển gen uidA vào cây Bình vôi
Sử dụng gen chỉ thị uidA trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở thực vật đã được nhiều tác giả trong nước cũng như ở nước ngoài quan tâm tiến hành. Các nghiên cứu chuyển gen ở khoai lang, sắn, cà chua, dưa dấu cũng đã được xây dựng và tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen [7], [28]. Có nhiều vector chuyển gen vào thực vật được thiết kế có mang gen uidA như pB1121, pCAM301,… nhưng nhược điểm của các vector này là không được thiết kế đoạn intron ở đầu 5’ trước gen uidA . Vì vậy khi nhuộm X- gluc gen uidA biểu hiện trong cả tế bào vi khuẩn và trong cả tế bào thực vật, điều này gây khó khăn cho việc nhận biết chính xác sự có mặt của gen uidA trong mô tế bào thực vật. Để khắc phục nhược điểm này, vector pPTN289 đã được thiết kế thêm đoạn intron ở đầu 5’ trước gen uidA . Vì thế, khi phân tích gen uidA , màu xanh chàm chỉ biểu hiện trong mô tế bào thực vật mà không biểu hiện trong vi khuẩn khi có mặt của cơ chất X-gluc [26]. Chính vì vậy khi xây dựng quy trình chuyển gen vào cây Bình vôi chúng tôi lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1_PZY102 mang vector chuyển gen pCB-gusplus mang gen uidA.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Đã xác định được điều kiện tối ưu để chuyển gen uidA vào cây Bình vôi (Stephania rotunada Lour.) qua đoạn thân mang chồi ngủ như sau:
- Mật độ vi khuẩn A.tumefaciens cho chuyển gen là OD600nm= 0,8.
- Nồng độ acetosyringone tốt nhất cho quá trình xâm nhiễm vi khuẩn A.
tumefaciens vào đoạn thõn là 100 àM.
- Thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens mang gen uidA vào cây Bình vôi là 20 phút.
- Thời gian đồng nuôi cấy cho việc xâm nhập của vi khuẩn A.
tumefaciens vào mẫu là 3 ngày.
- Nồng độ kháng sinh thích hợp để chọn lọc chồi là kanamycine 50 mg/l kết hợp cefotaxime 500 mg/l.
2. Đề nghị
Ứng dụng quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens đã được xây dựng để chuyển các gen mục tiêu nhằm tạo giống mới có khả năng tổng hợp rotundin cao.
CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN THẠC SĨ
1. Tangmany SYSOMEPHONE, Ngô Diễm Quỳnh, PHANTHAHAK Santhana, Nongkhan MANISOK, Phạm Thị Thanh Nhàn (2020), “Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi vàng (Stephania spp.)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 225(08): 239 - 244, ISSN:
1859 - 2171.
2. Phạm Thị Thanh Nhàn, Ngô Diễm Quỳnh, Phan Hoàng Tuấn, Hoàng Phú Hiệp, Chu Hoàng Mậu (2022), “Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị gus vào cây bình vôi (Stephania spp.)”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2022, tr. 977 – 982.