Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi
Các bộ phận của cây Bình vôi được lựa chọn để chuyển gen là mảnh lá, cuống là và đoạn thân chứa chồi ngủ. Các nguyên liệu biến nạp này được lấy từ mẫu đã được nuôi cấy trong môi trường in vitro với vật liệu là đoạn thân chứa chồi ngủ được rửa sạch, ngâm trong xà phòng 10% trong 30 phút rồi mang vào box cấy khử trùng với HgCl2 0,1% trong 5 phút sau đó lắc 5 lần vớt nước cất và đem cấy vào bình nuôi cấy môi trường MS + sucrose 30 g/l + agar 8 g/l với tỉ lệ sống sót và bật chồi là trên 90% với công thức nuôi cấy này.
Hình 3.1. Mẫu Bình vôi in vitro
Các mẫu đoạn thân vô trùng đã bật chồi được chuyển sang môi trường tái sinh và tạo đa chồi để chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình chuyển gen. Môi trường GM bao gồm: MS cơ bản + sucrose 30 g/l+ agar 8,5 g/l + BAP 2,0 mg/l + nước dừa 100 ml/l được lựa chọn, thu được trên 6,0 chồi/mẫu; chiều cao chồi đạt khoảng 0,8- 0,9cm sau 7 tuần nuôi cấy. Đây là môi trường có nồng độ BAP tối ưu cho sự tạo đa chồi cây Bình vôi đã được nghiên cứu thực nghiệm trước đó [14].
Gen β - glucuronidase (uidA) được phân lập từ chủng E.coli RA201. β- glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide tạo sản phẩm phân giải có màu xanh lam đặc trưng, dễ nhận biết. Cơ chất của β- glucuronidase thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen uidA là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X- gluc không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang
màu xanh lam. Vì thế gen uidA được thiết kế trong các vector chuyển gen để làm chỉ thị nhận biết kết quả biểu hiện gen uidA ở mô, tế bào thực vật [24].
Kết quả xác định tối ưu về mật độ A. tumefaciens , nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển gen uidA và ngưỡng chọn lọc kanamycine ở cây Bình vôi là cơ sở đề chuyển cấu trúc mang gen đích vào cây Bình vôi.
Hiệu suất chuyển gen thông qua A. tumefaciens không những phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến thực vật mà còn phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn và thời gian lây nhiễm. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của A. tumefaciens ở năm mật độ tế bào OD600nm= 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 đến hiệu suất chuyển gen qua đoạn thân mang mắt chồi bên, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mật độ A. tumefaciens đến tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm thời
Nồng độ vi khuẩn (OD600nm)
Số mẫu
lây nhiễm
Mảnh lá Cuống lá Đoạn thân
Số mẫu biểu hiện
gen uidA
Tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm
thời (%)
Số mẫu biểu hiện
gen uidA
Tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm
thời (%)
Số mẫu biểu hiện
gen uidA
Tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm
thời (%) 0,2 30 4,33a±
0,58 14,43 8,67a ±
0,58 28,90 9,33a ±
0,58 31,10 0,4 30 15,33b±
1,52 51,10 16,33b ±
1,53 54,43 19,67b ±
1,15 65,57 0,6 30 17,67c±
0,58 58,90 21,33c ±
0,58 71,10 24,67c ±
1,52 82,23 0,8 30 22,33d±
1,15 74,43 24,00d ±
1,00 80,00 28,67d ±
1,15 95,57 1,0 30 15,67b±
0,58 52,23 20,67c ±
0,58 68,90 22,67c ±
1,53 75,57 Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa
thống kê p < 0,05 với phép thử Duncan
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm thời của các mẫu chuyển gen sau đồng nuôi cấy của ba loại vật liệu nhận gen là mảnh lá, cuống lá và đoạn thân mang mắt chồi bên phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn sử dụng biến nạp. Ở mỗi mật độ vi khuẩn, tỷ lệ biểu hiện gen uidA của từng loại vật liệu có sự chênh lệch, đoạn thân có hiệu suất biến nạp gen cao hơn so với hai vật liệu còn lại. Ở mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,2 và OD600nm = 0,4 thu được hiệu quả biến nạp gen thấp, tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm thời ở mật độ OD600nm
= 0,2 chỉ đạt từ 14,43 đến 31,10 %; còn ở mật độ OD600nm = 0,4 tỷ lệ biểu hiện đạt từ 51,1 đến 65,57 %; Ở mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,6 và OD600nm = 1,0 thu được hiệu quả biến nạp gen tương đối cao, với OD600nm = 0,6 đạt tỷ lệ từ 58,9- 82,23% OD600nm = 1,0 thấp hơn một chút, tỷ lệ đạt từ 52,23-75,57%. Tỷ lệ biểu hiện gen uidA tạm thời của đoạn thân cao nhất tại mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,8 (từ 74,43-95,57%).
Vũ Thị Lan và cs (2013) khi nghiên cứu đã khẳng định mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,8 là mật độ tối ưu nhất khi chuyển gen vào khoai lang với hiệu suất biểu hiện là 38% [7]. Theo Đặng Thị Hoàng Hà và cs (2016) nghiên cứu chuyển gen uidA và giống ngô LVN99 cũng nhận định mật độ mật độ vi khuẩn A. tumefaciens OD660nm = 0,8 cho hiệu quả chuyển gen uidA cao nhất cho hiệu suất biểu hiện là 40,83% với mẫu vật tiến hành chuyển gen là phôi ngô [3]. Tuy nhiên với Hoàng Thi Giang và cs (2015) đã chỉ ra mật độ OD600nm = 0,1 là hiệu quả nhất với giống lúa Taichung 65 với hiệu quả chuyển gen là 81,25% [2]. Do vậy tùy từng loài cây khác nhau sẽ có mật độ vi khuẩn phù hợp khác nhau.
Hiệu quả chuyển gen của đề tài với mật độ vi khuẩn OD600nm = 0,8 (74,43- 95,57%). đem lại kết quả bước đầu rất khả quan so với các tác giả khác.
Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường SIM, các mẫu mảnh lá và cuống lá có xu hướng khô héo và hóa nâu, dần mất khả năng tái sinh, đặc biệt đối với mẫu mảnh lá. Sự biểu hiện gen uidA ở mẫu lá không đồng đều như ở đoạn thân. Như vậy, trong phạm vi nghiêm cứu của đề tài, mẫu đoạn thân mang mắt chồi bên thích hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi.