Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Agrobacterium do khả năng của nó trong việc nhận biết và phản ứng chính xác với các tín hiệu hóa học có nguồn gốc từ vết thương của thực vật. Vào năm 1980, các nhà khoa học đã phát hiện ra khả năng chuyển gen vào thực vật của loài vi khuẩn này. Nhờ đó, A. tumefaciens đã được sử dụng phổ biến để chuyển gen thực vật.
A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật nhờ vào việc nó nhận biết chính xác các tín hiệu có nguồn gốc từ thực vật để kích hoạt các gen độc lực, các gen này chịu trách nhiệm chuyển và tích hợp DNA đã chuyển (T-DNA) từ plasmid gây khối u (Ti) vào nhân tế bào thực vật. Sự biểu hiện của T-DNA trong vật chủ dẫn đến việc sản xuất một lượng lớn axit indole-3-acetic (IAA), cytokinin (CK) và opines. Sự xuất hiện của IAA và CK kích thích sự phát triển của thực vật dẫn đến sự phân chia mất kiểm soát và các mô không xảy ra biệt hóa mô thực dần hình thành khối u. Sự xâm nhiễm chỉ xảy ra khi tế bào thực vật bị tổn thương.
Ti- plasmid là một phân tử ADN mạch vòng, trong tế bào vi khuẩn Ti- plasmid tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập không phụ thuộc vào sự nhân đôi vật chất di truyền của vi khuẩn. Ti-plasmid có hai vùng chính liên quan đến sự hình thành u, vùng T được chuyển vào tế bào thực vật trong quá trình hình thành u, còn vùng vir (virulence region) xúc tiến và quyết định cho việc giải phóng sợi T-ADN khỏi Ti-plasmid đến tế bào thực vật. Trên Ti plasmid, chỉ có duy nhất vùng T-ADN được chuyển từ tế bào vi khuẩn sang tế bào của vật chủ.
Vùng ranh giới nằm hai bên T-ADN được giới hạn bằng bờ trái (left border) và bờ phải (right border) là yếu tố cần thiết cho quá trình xâm nhập của T-ADN vào tế bào chủ. Các gen nằm trên T-ADN không cần thiết hay gây ảnh hưởng tới quá trình xâm nhiễm, chuyển gen vào tế bào chủ. Do vậy nếu thay thế các gen nằm trên T-ADN bằng những gen quý cần được chuyển gen thì chúng có thể được chuyển vào nhân tế bào chủ và hợp nhất với gen trong nhân của tế bào thực vật mà không hề gây ảnh hưởng tới khả năng hoạt động hay các khả năng sinh học khác của vi khuẩn A. tumefaciens . Vị trí hợp nhất của T-ADN với ADN của tế bào thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên, T-ADN ổn định trong gen nhân và nhân bản cùng ADN nhân. Sau quá trình xâm nhiễm thì những tế bào thực vật này vẫn có khả năng tái sinh và phát triển bình thường.
Sự chuyển giao và tích hợp T-DNA vào nhân tế bào thực vật được thực hiện qua trung gian của một tập hợp phức tạp của vi khuẩn Agrobacterium và protein của vật chủ. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật: Tế bào thực vật khi bị thương tiết ra các hợp chất có bản chất là phenol, chất này sẽ thu hút vi khuẩn đồng thời hoạt hóa các gen vir là A, B, C, D, E, F, G. Sự chuyển T-DNA bắt đầu khi vi khuẩn A. tumefaciens bám vào thành tế bào thực vật ở vị trí gắn đặc trưng. Hợp chất phenol được nhận biết đầu tiên bởi gen virA. Gen virA tổng hợp nên protein để đáp ứng sự trao đổi chất với vết thương ở tế bào chủ. Protein VirA tự phosphoryl hóa kéo theo sự phosphoryl hóa của protein VirG và kích thích sự sao mã các gen vùng vir còn lại. Tiếp theo các protein VirD và VirE giải phóng T-DNA khỏi Ti-plasmid với đầu 5’ đi trước, protein VirE2 có chức năng bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của nuclease trong tế bào thực vật. Sự chuyển T-DNA vào tế bào thực vật qua kênh xuyên màng do protein VirB tạo ra [20].
Hình 1.5. Sự tương tác của A. tumefaciens và cơ chế chuyển T-DNA Ưu điểm của việc chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là: Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào, nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật; Có thể xử lý một lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn; Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát ngay sau vài ngày thực hiện biến nạp.
1.3.2. Thành tựu chuyển gen ở thực vật thông qua chuyển gen uidA nhờ A. tumefaciens
Những thành tựu của công nghệ chuyển gen thực vật đã đem lại những lợi ích to lớn cho nhiều ngành như ngành công nghiệp thực phẩm, ngành y học.
Cùng với sự phát triển của công nghệ này thì nhiều năm trở lại đây, các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã quan tâm hơn tới việc xây dựng quy trình chuyển gen ở loài cây lương thực, cây thực phẩm và cây lâm nghiệp.
Và một trong các nghiên cứu phổ biến để làm tiền đề cho việc xây dựng chuyển gen đích vào cây là việc xây dựng quy trình chuyển gen mã hóa β- glucuronidase [uidA (GUS)].
β-glucuronidase được phân lập từ chủng E. coli RA201, là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải β-glucuronide, kết quả cho sản phẩm có màu xanh lam đặc trưng. Cơ chất của β-glucuronidase thường dùng trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen uidA là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-
Tế bào chất
Tế bào thực vật
glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu nhưng dưới tác động của β- glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam. Nhờ yếu tố đặc biệt này nên gen uidA đã được các nhà khoa học lựa chọn để thiết kế vào các vector chuyển gen làm chỉ thị nhận biết gen chuyển có mặt ở mô, tế bào thực vật [24].
Những năm gần đây, các nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở Việt Nam thông qua xây dựng quy trình chuyển gen chỉ thị uidA được các nhà khoa học quan tâm. Trong lĩnh vực nghiên cứu chuyển gen ở cây lúa, Đoàn Thu Thủy và cs (2008) đã nghiên cứu và đánh giá sự hoạt động của 4 promoter (Rd29A, Gt1, RCg2 và CaMV35S) nhằm chọn ra một promoter thích hợp cho quá trình chuyển gen vào cây lúa thông qua sự biểu hiện của gen uidA , tác giả nhận thấy, các promoter khác nhau không có ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh in vitro. Kết quả gen uidA biểu hiện bền vững chỉ quan sát được ở cây chuyển gen khi sử dụng promoter RCg2 [15].
Nghiên cứu cải tiến quy trình chuyển gen ở lúa của Hoàng Thị Giang và cs (2015), theo hướng thao tác đơn giản, giảm thiểu khối lượng công việc, nhưng hiệu suất chuyển gen cao. Theo quy trình này, dịch khuẩn A. tumefaciens có mật độ OD600nm = 0,1 là tối ưu với tần số biểu hiện gen uidA ở mô sẹo cao (81,25%) và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp. Đánh giá sự biểu hiện của gen uidA và phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 đã chứng minh sự di truyền ổn định của gen chuyển sang thế hệ sau [2].
Đối với đối tượng là cây đậu tương, Đinh Thị Phòng và cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen uidA và thành công, kết quả thời gian nhiễm khuẩn cho hiệu quả biến nạp cao nhất là 2 giờ, gen uidA biểu hiện qua tỷ lệ mẫu sống sót là 67,5%, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi là 47% và hiệu quả biểu hiện gen uidA ở cây tái sinh in vitro đạt 12,8% [12]. Theo Vũ Thị Lan và cs (2013) khi nghiên cứu cây khoai lang với vật liệu nhận gen là mảnh cấy từ đỉnh ngọn được nhiễm với A. tumefaciens CV58 ở nồng độ OD600nm = 0,8, bổ sung AS 150àM trong 20 - 30 phút, thu được tỉ lệ biểu hiện tạm thời gen uidA cao nhất (38%). Mô sẹo chuyển gen được chọn lọc trên môi trường CP3 bổ sung cefotaxim 500 mg/l,
kanamycine 50 mg/l trong 3 - 4 tuần. Chồi tái sinh từ các mô sẹo sống sót được chọn lọc tiếp trên môi trường ra rễ MS bổ sung kanamycine 100 mg/l. Kết quả ban đầu về chuyển gen uidA vào giống khoai lang KB1 là hầu hết các dòng mô sẹo sống sót đều biểu hiện hoạt động gen uidA (có màu xanh chàm rất đậm) và thu được 8/21 dòng cây khoai lang chuyển gen uidA ra rễ trên môi trường chọn lọc bổ sung kanamycine 50 mg/l [7].
Nghiên cứu chuyển gen cũng được tiến hành trên cây lan hồ điệp, Trần Lê Lưu Li và cs (2008) đã công bố thí nghiệm chuyển gen lây nhiễm nhờ vi khuẩn A. tumefaciens mang vector có gen uidA và thu được kết quả biểu hiện uidA tối ưu ở nồng độ AS 50μM sau 4 ngày đồng nuôi cấy [8].
Ngoài đối tượng cây lúa, đậu tương hay lan hồ điệp cũng có nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen thông qua việc xây dựng quy trình chuyển gen chỉ thị uidA trên các cây khác như cà chua, dưa hấu, dừa hay một số loại cây dược liệu nhằm nâng cao dược tính cũng đang được quan tâm.
Điển hình là chuyển gen ở cây dừa cạn nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogens (A. rhizogens) đang được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Năm 2010, Wang CT và cs đã chuyển gen G10H và ORCA3 (một nhân tố của họ AP2) vào cây Dừa cạn thông qua vi khuẩn A. rhizogens MSU440.
Kết quả cho thấy khi phân tích mức độ tích lũy alkaloid tất cả các cây chuyển gen đều tích lũy catharanthine nhiều gấp 6,5 lần so với những cây không chuyển gen và mức độ tích lũy cao nhất ở các cây chuyển gen OG12. Sau khi xử lý với ABA, mức độ tích lũy catharanthine đạt 1,96 mg/g khối lượng khô ở cây chuyển gen OG12 [27]. Cũng trong năm 2010, Mohsen Zargar và cs công bố nghiên cứu chuyển gen vào rễ cây Dừa cạn khi sử dụng lá mầm trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP và NAA. Sau 10 ngày ra rễ trên môi trường MS cơ bản, rễ có chiều dài 8-9 cm và hình thái cây Dừa cạn chuyển gen không có gì khác so với cây bình thường [22]. Tới năm 2012, Wang Q và cs đã đề xuất quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens EHA105 sử dụng gen chỉ thị uidA . Trong nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng vật liệu
chuyển gen là lỏ mầm, nuụi cấy trờn mụi trường MS cú chứa AS 100 àM, thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút có bổ sung kanamycine. Sau khi chuyển thành công gen chỉ thị uidA vào cây Dừa cạn. Tác giả dựa trên quy trình đó và đã chuyển gen CrDAT vào cây Dừa cạn [28].
Cũng với đối tượng nghiên cứu là cây dừa cạn. Đến năm 2016, Đỗ Huy Hoàng đã nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) thành công nhờ vào việc sử dụng gen chỉ thị uidA. Tác giả đã tối ưu nhất được một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chuyển gen như vật liệu chuyển gen là lá mầm, nồng độ vi khuẩn OD600nm = 0,8, nồng độ acetosyringone là 100àM, thời gian nhiễm khuẩn là 30 phỳt, nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen là 50 mg/l dựa trên quy trình đã xây dựng, tác giả đã chuyển thành công cấu trúc mang gen uidA vào cây [4].