Khảo sát tác động kháng viêm của cao phân đoạn từ lá cây lá đắng vernonia amygdalina delile trên chuột nhắt trắng

Khảo sát tác động kháng viêm của cao phân đoạn từ lá cây lá đắng Vernonia amygdalina Delile trên chuột nhắt trắng Tổng quan về cây lá đắng, về tác dụng dược lý của cây lá đắng, tổng quan về kháng viêm và các thuốc kháng viêm, giới thiệu một số mô hình đã nghiên cứu tác dụng kháng viêm. Trình bày đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu: xác định độ tinh khiết của dược liệu, khảo sát sơ bộ thần phần hóa học, chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn, khảo sát tác dụng kháng viêm của các cao phân đoạn lá đăng trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan. Kết quả nghiên cứu, bàn luận, kết luận và kiến nghị.

TổngquanvềcâyLáđắngVernoniaamygdalinaDelile

Danhpháp

Tên khoa học:Vernonia amygdalinaDelile [4], tên Việt Nam: cây Lá đắng, cây Mật gấu.Theo hệ thống phân loại của A.Takhtajan (2009) [45], họ Cúc (Asteraceae), chiVernonia vàcâyVernoniaamygdalinacóvịtríphânloạinhưsau:

ĐặcđiểmthựcvậtcâyVernoniaamygdalina

Vernonia amygdalinalà một câybụi cao từ 2 - 10 m, phân nhiều nhánh, tiết diện tròn, vỏ màu xám hoặc nâu; lá đơn, hình mũi mác thuôn dài, 15 x 5 cm, màu xanh đậm, không hoặc có lông thưa thớt, mọc đối xứng, cuống lá thường rất ngắn thường là 1 - 2 cm Đặc điểm hoa: hoa nhỏ, màu trắng kem, cánh dài khoảng 10 mm, cụm hoa đầu có mùi thơm,cây ra hoa và quả từ tháng 12 đến tháng 3 [4].

Phânbố,sinhtháicủacâyVernoniaamygdalina

Vernonia amygdalinaphân bố chủ yếu ở các vùng Tây Phi, Nam Phi, Ấn Độ Sau khi du nhập vào nước ta,V amygdalinađược trồng rải rác ở một số nơi trong cả nước.Vernoniaamygdalinađược trồng bằng cách giâm cành, nước là yếu tố quan trọng để lá phát triểnv à c h o n ă n g s u ấ t c a o v à o m ù a m ư a B ộ p h ậ n t h ư ờ n g d ù n g l à m t h u ố c l à l á v à r ễ L á s a u k h i t h u h o ạ c h t h ư ờ n g đ ư ợ c s ấ y k h ô ở n h i ệ t đ ộ d ư ớ i 4 5 o C [4].

ThànhphầnhóahọccủacâyVernoniaamygdalina

Trong các nghiên cứu trước đây cho thấy nhiều hợp chất được phân lập từVernoniaamygdalina,baogồm:3flavonoid,1steroidalcol,10steroidglycosid,12acid béovà7 sesquiterpenlacton[4],[35].

VernoniosidA3;vernoniosidA4 Jisakavàcộngsự(1992,1993) VernoniosidB1;vernoniosidB2 Kamperdickvàcộngsự(1992)

VernoniosidB3;vernoniosidD; vernoniosidD2;vernoniosidE Igilevàcộngsự(1994,1995)

Flavonoid Luteolin;luteolin7–O–β– glycosid;luteolin7–O–glucuronid Igilevàcộngsự(1994)

Acidbéo Acidlinoleic,acidα–linolenic Erastovàcộngsự(2006)

Vị đắng của Lá đắng là từ các steroid glycosid (saponin) [29] Trong đó, vernoniosid B1 được tìm thấy có trong lá nhiều hơn trong thân cây và nhiều hơn hẳn là trong rễ cây. Vernoniosid A1, A2, A3, A4 được cho là một phần trong các thành phần góp nên vị đắng của cây trong khi vernoniosid B1, B2, B3 thì không thể hiện đặc tính này [51].

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Hồ Thị Thúy Linh (2016) phân lập được từ cao phân đoạn ethyl acetat Lỏ đắng cỏc hợp chất: luteolin (IC50 = 0,302 àg/ml); luteolin – 7 – O – glycoside; cynarin (IC50 = 0,297 àg/ml) và vitexin [4] Nghiờn cứu của Phạm ViệtC ư ờ n g ( 2 0 1 9 ) p h â n l ậ p đ ư ợ c h ợ p c h ấ t : v e r n o n i a c u m B , v e r n o n i o s i d B 1 , v e r n o n i o s i d B 2 , v e r n o m y o s i t C , v e r n o m y o s i t C 1 v à m ộ t h ợ p c h ấ t m ớ i đ ư ợ c đ ặ t t ê n l à v e r n o m y o s i t E [ 1 7 ]

Thành phần Hoạt tính Tàiliệuthamkhảo

Vernoniosid A3 Diệt sán máng: 200 ppm Jisaka và cộng sự

Khángkhuẩn:MIC=0,25-0,5mg/ ml Khángnấm:LC50=0,5mg/ml Kháng ký sinh trùng sốt rét:

LC50=0,2-0,4mg/ml Diệtsánmáng:200ppm Độctếbào:IC50=0,11mg/ml

Vernodalinol Độctếbào:IC p-75mg/ml Luovàcộngsự

4,15– dihydrovernodalin Độctếbào:IC50 =0,07mg/ml (1993)

- hexahydrovernodalin Độctếbào:IC50=0,52mg/ml

Tổngquanvềtácdụngdượclý

Tácdụngchốngoxyhóa

Khả năng tăng cường sức khỏe củaVernonia amygdalinacó thể liên quan đến tác dụng chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của loại cây này được đánh giá bằng cách so sánh khả năng khử và khả năng loại bỏ gốc DPPH của hai loại sesquitertene lacton được phân lập trước đó (vernolid và vernodalol) với dịch chiết ethanol của lá dược liệu này.K ế t q u ả c h o t h ấ y v e r n o l i d c ó k h ả n ă n g k h ử c a o h ơ n v e r n o d a l o l v à d ị c h c h i ế t e t h a n o l T ạ i n ồ n g đ ộ

0 , 2 5 m g / m l , v e r n o l i d c ó g i á t r ị đ ộ h ấ p t h ụ l à 0 , 1 5 t r o n g k h i v e r n o d a l o l v à d ị c h c h i ế t e t h a n o l c ó đ ộ h ấ p t h ụ l ầ n l ư ợ t l à 0 , 0 4 2 v à 0 , 1 4 4 T u y n h i ê n , c a t e c h i n ( m ộ t h ợ p c h ấ t c h ố n g o x y h ó a t i ê u c h u ẩ n ) , t h ể h i ệ n k h ả n ă n g k h ử c a o h ơ n c ả b a m ẫ u Đ ố i v ớ i k h ả n ă n g l o ạ i b ỏ g ố c D P P H , ở t ấ t c ả c á c n ồ n g đ ộ , d ị c h c h i ế t e t h a n o l c ó h o ạ t t í n h k h ử g ố c t ự d o c a o h ơ n s o v ớ i c á c l o ạ i s e s q u i t e r p e n e l a c t o n , c h o t h ấ y tác dụng hiệp đồng có thể do các thành phần trong dịch chiết [23].

Nghiên cứu của E.O Iwalewa và cộng sự (2005) [30] cũng cho thấy tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào của dịch chiết methanol cây Lá đắng ở vùng Tây Nam Nigeria.

Tácdụnghạđườnghuyết

Trong mộtthử nghiệm dungnạpglucoseđườnguống của Khang Wei Ong vàcác cộng sự

(2011), liều 400 mg/kg dịch chiết từ cây Lá đắng cho thấy sự cải thiện đáng kể về khả năng dung nạp glucose của chuột bị đái tháo đường do streptozotocin (STZ) Điều trị 28 ngày với 400 mg/kg dịch chiếtVernonia amygdalinalàm giảm 32,1% đường huyết lúcđ ó i s o v ớ i m e t f o r m i n 5 0 0 m g / k g B ê n c ạ n h đ ó , L á đ ắ n g c ũ n g c h o t h ấ y t á c d ụ n g b ả o v ệ đ ố i v ớ i c á c t ế b à o c ủ a t u y ế n t ụ y c h ố n g l ạ i t ổ n t h ư ơ n g d o S T Z g â y r a , l à m t ă n g n h ẹ n ồ n g đ ộ i n s u l i n s o v ớ i m e t f o r m i n N g h i ê n c ứ u n à y c ũ n g c h o t h ấ y r ằ n g L á đ ắ n g l à m t ă n g s ự b i ể u h i ệ n c ủ a G L U T 4 l ê n m à n g t ế b à o , g i ú p k í c h t h í c h s ự h ấ p t h u g l u c o s e c ủ a c ơ x ư ơ n g v à ứ c c h ế g l u c o s e – 6 – p h o s p h a t a s e ở g a n [ 4 2 ]

Tácdụnghạlipidhuyết

Dịch chiết nước từ lá câyVernonia amygdalinalàmgiảmđángkể triglycerid huyếtthanh, cholesterol cũng như trọng lượng cơ thể với liều 80 mg/kg là liều tối thiểu có hiệu quả ở chuột thí nghiệm [27].

Ngoài ra, kết quả nghiên cứu dịch chiết methanol từ lá câyVernonia amygdalinatrên chuột cống cho chế độ ăn giàu cholesterol trong vòng 9 tuần, cho thấyLá đắng không chỉ làm giảm nồng độ LDL cholesterol và triglycerid mà còn làm tăng HDL cholesterol và có sự giảm đáng kể mức LPO ở những chuột sử dụng dịch chiết [13].

Tácdụngchốngungthư

Vernonia amygdalinacho thấy tác dụng chống ung thư trên hai dòng tế bào ung thư vú ở người (MCF – 7, MDA – MB – 231) và sự tổnghợpDNA,hiệuquả trong việc ngăn ngừa và trì hoãn phát bệnh ung thư vú [50], [52] Dịch chiết nước củaV amygdalinacũng cho thấytăng tác dụng chống lại sự phát triển của thụ thể estrogen ung thư tuyến vú với nồng độIC50ở1000mg/mlthôngquasựứcchếtổnghợpADN.Mặcdùnồngđộứcchếcao,

V amygdalinađược sử dụng với số lượng lớn mà không có báo cáo nào về trường hợp độc tính và do đó có thể phối hợp vào chế độ ăn uống của bệnh nhân ung thư để cải thiện tiên lượng hoặc chất lượng cuộc sống [4], [26].

Tácdụngbảovệgan

Uống dịch chiết nước của láV amygdalinacó thể hồi phục chức năng gan qua việc giảm các chỉ số men gan AST, ALT, ALP, glutamate - oxaloacetat transaminase, glutamat pyruvat transaminase, lactat dehydrogenase và chỉ số bilirubin trong xét nghiệm sinh hóa

[4], [18] Dịch chiết methanol của Lá đắng cũng cho thấy tác dụng bảo vệ, chống nhiễm độc gan do CCl4gây [4], [15].

Một nghiên cứu của IJ Atangwho và cộng sự (2007) chứng minh hoạt động của aminotransferase huyết thanh(tăng đángkể trongnhómkiểmsoátbệnh đáitháođường so vớigiátrịkiểmsoátbìnhthườngtươngứng)đãgiảmđángkểsaukhiđiềutrịvớidịch chiết ethanol cây Lá đắng Tổng lượng protein huyết thanh và albumin tương ứng cũng tăng, tuy nhiên mức tăng chỉ có ý nghĩa đối với albumin [20].

Tácdụngkhángkhuẩnvàkhángkýsinhtrùng

Dịch chiết methanol củaV amygdalinakhông chỉ ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn Gram dương nhưBacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis,

StaphylococcusaureusvàMicrococcus kristinaemà còn có hiệu quả chống lại các vi khuẩn

Gram âmKlebsiellapneumonia,Pseudomonasaeruginosa,Proteusvulgaris,Enterobactercloacae,Sh igella dysenteriaevàEscherichia coli[33], [40].

Dịch chiết aceton của láV amygdalinacó hoạt tính khángBacillus cereus,Bacilluspumilus,Bacillus subtilis,Micrococcus kristinae,Staphylococcus aureus,Enterobactercloacaev à E s c h e r i c h i a c o l i v ớ in ồ n g đ ộ ứ c c h ế t ố i t h i ể u ( M I C ) 5 m g / m l D ị c h c h i ế t n ư ớ c t h â n c â yV amygdalinacho thấy khả năng chống lại các vi khuẩnk ỵ k h í ở m i ệ n g :B a c t e r o i d e s g i n g i v a l i s,B a c t e r o i d e s a s a c c h a r o l y t i c u s,Bacteroides melaninogenicusvàBacteroides oralis[4].

Theo một nghiên cứu của A U Ogboli và cộng sự (2000), tiêm năm ngày liên tiếp với liều 1 mg/kg dịch chiết ether và ethanol của láV amygdalinacho hiệu quả trị sán máng (giảm 72,3% và 83,61% về lượng ký sinh trùng) trên chuột bị nhiễmSchistosomamansoni. Ngoài ra, dự phòng với (1 mg/kg) cao chiết ether hoặc ethanol chiết xuất từ lá củaV. amygdalinacũng giảm 34,06% và 44,57% nguy cơ nhiễm ký sinh trùng [39].

Dịch chiết ethanol, ether, dicloromethan, ethyl acetat, aceton, nước củaV amygdalinacó khả năng kháng ký sinh trùng sốt rétPlasmodium falciparum in vitro,tác dụng chống sốt rét củaV amygdalinanhờ vào các sesquiterpen lacton như vernolepin, vernolin, vernolid, vernodalin và hydroxyvernodalin [36], [47] Bên cạnhP falciparum, V amygdalinacũng có hiệu quả chống ký sinh trùngPlasmodiumkhác Tuy nhiên, các dịch chiết không loại bỏ hoàn toàn các nhiễm trùng [12], [44].

Tácđộngkhángviêm,giảmđau

Kết quả từ nghiên cứu của A.A Adedapo và cộng sự (2014) cho thấy ở liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết acetonV amygdalinalàm giảm phù chân chuột đáng kể do cả carrageenan và histamin [14] Sự gia tăng phụ thuộc vào liều trong các đặc tính kháng viêm, giảm đau đã được quan sát thấy ở cả dịch chiết lá nonV amygdalinavà dịch chiết lá giàV amygdalina.Thoái hóa tế bào mast đi kèm với giãn mạch và bạch cầu tăng caođ ã đ ư ợ c q u a n s á t t h ấ y t r o n g n h ó m t h ử n g h i ệ m â m t í n h , n h ư n g t h ấ p r õ r ệ t t r o n g c á c n h ó m đ ư ợ c đ i ề u t r ị v ớ iV amygdalina Cả hai dịch chiết lá non và lá giàV amygdalinađều tác động giảm đau thông qua các con đường opioidergic và nitric oxid, ngoài ra dịch chiết từ lá nonV amygdalinacòn liên quan đến hệ cholinergic muscarinic [19].

Theo một nghiên cứu khác của Mustapha A Tijjani và cộng sự (2017) cho thấy sự hiện diện của saponin, carbohydrat, glycosid tim, flavonoid, alkaloid, steroid, triterpenoid,không có anthraquinon Tương ứng ở các liều 600, 400, 200 mg/kg tiêm phúc mô chuột thí nghiệm có số lần đau quặn trung bình là 36,0 ± 0,81, 43,8 ± 0,11, 52,8 ± 0,37, kết quả này chứng minh tiềm năngV amygdalinacó thể được sử dụng làm thuốc giảm đau [46].

Tổngquanvềkhángviêm

Kháiniệmviêm

Viêm là phản ứng của mô và vi tuần hoàn với tác nhân gây bệnh, có đặc điểm là tạo ra những chất trung gian gây viêm, kèm theo sự di chuyển của dịch và những bạch cầu từ mạch máu vào trong các mô kẽ Bằng cách này, các túc chủ khu trú lại và loại trừ những tế bào đã bị biến đổi về chuyển hóa, những tiểu phần lạ, những vi sinh vật hoặc những kháng nguyên [5].

Viêmđược xemlà một phản ứngphức tạpcủa cơthể khởiphát sau khibị tổnthương,gây chết hoặc không gây chết tế bào Viêm có thể được khởi phát khi có sự hiện diện của tế bào chết của túc chủ, vi khuẩn hoặc tế bào chết của ký sinh trùng, song dù do bất cứ nguyên nhân nào, viêm cũng có các biểu hiện lâm sàng: sưng, nóng, đỏ, đau và kèm theo các rối loạn chức năng của cơ quan bị viêm [8].

Nguyênnhângâyviêm

 Nguyên nhân từ bên ngoài: Vi khuẩn là tác nhân gâyviêm thường thấynhất, ngoài ra còn có các yếu tố gây viêm khác như vật lý, hóa học, cơ học, sinh học (viêm gây ra do đáp ứng miễn dịch, sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể) [8].

 Nguyênnhântừ bêntrong:Sự hoạitử tổchứcdonghẽntắcmạch,xuấthuyết,viêm tắc động mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng, miễn dịch (bệnh tự miễn) [8].

Diễntiếncủaquátrìnhviêm

Viêmcấp

Trong viêm cấp, các rối loạn tuần hoàn xảy ra sớm nhất, sự co các tiểu động mạch xảy ra trong khoảng thời gian rất ngắn, sau đó là sự giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch do có sự co thắt tế bào nội mô tạo thành khoảng hở giữa các tế bào tạo điều kiện cho sự thoát mạch tế bào và các protein huyết tương Chúng giữ hai vai trò: (1) Kích thích và điều khiển quá trình viêm; (2) Tác động qua lại với các thành phần của đáp ứng miễn dịch [8].

Lành vết thương Viêm mạn tính

Lành vết thương Viêm cấp tính

 Bạch cầu trung tính được dự trữ ở tủyxương, lưu thông trong máu và tụ tập nhanh chóng ở những vị trí tổn thương haynhiễm khuẩn Trong các mô, bạch cầu đa nhân trung tính thực bào vi khuẩn xâm nhập và mô đã chết [8].

 Tế bào mast và bạch cầu ái kiềmcó chứa thụ thể IgE trên bề mặt tế bào của chúng. Khi được hoạt hóa sẽ tạo ra hiện tượng thoát hạt làm giải phóng nhanh chóng các hoạt chất trong tế bào ra môi trường bên ngoài làm tăng cường phản ứng viêm trong dị ứng[ 8 ] ,

 Bạch cầu ái toan với các hạt có chứa protein EBP (Eosinophilic Basic Protein) rất độc đối với ký sinh trùng, protein này có tác động làm mòn lớp màng ngoài của ký sinh trùng Đây là một cơ chế để đối phó với các ký sinh trùng vì chúng đa số là những sinhv ậ t đ a b à o k h ô n g t h ể t h ự c b à o đ ư ợ c [ 8 ]

 Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào: Bạch cầu đơn nhân di chuyển trong mao mạch và có thể thoát khỏi vòng tuần hoàn đi vào mô và biệt hóa thành đại thực bào Đại thực bào sản xuất ra những chất trung gian hóa học gây viêm như TNF-α, IL-1, IL-6… làm khuếch đại phản ứng ra xa [8].

 Tế bào lymphoB tham giavào miễndịchdịch thể, khikháng nguyên vào cơthể sẽ gắnvớitếbàoBcókhángthểbềmặt tươngứngrồikíchthíchbiệthóatếbàoBthànhbào tương có khả năng sản xuất kháng thể (IgM, IgG, IgA, IgE, IgD) [9].

 Dòng chứa kháng nguyên CD4 sinh ra các lymphokin tiêu diệt vật lạ bằng cách hoạt hóa các tế bào lympho khác và kích thích tổng hợp globulin miễn dịch.

 Dòngchứakháng nguyênCD8giúpnhậnbiếtkhángnguyên,tấncôngtrựctiếpcác tế bào có kháng nguyên lạ trên bề mặt, điều hòa miễn dịch và ức chế hoạt động của các lympho khác.

 Tế bào NK là những tế bào lympho không biệt hóa thành lympho B hay lympho T và tham gia vào đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào theo cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể [8].

 Tiểu cầu có vai trò trong cầm máu và điều hòa hình thành cục máu đông Chúng là nguồn của những chất trung gian gây viêm [8].

 Các tế bào và tiểu cầu thực hiện các chức năng với sự hỗ trợ của ba hệ thống proteinhuyếttương(plasmaproteinsystem)đólàhệthốngbổthể,hệ thốngđông máu,hệ thống kinin: (1) Hệ thống bổ thể chẳng những hoạt hóa, hỗ trợ viêm và miễn dịch, đồng thời giữ vai trò quan trọng trong phá hủy tế bào (vi khuẩn); (2) Hệ thống đông máu giữv a i t r ò b a o v â y v i k h u ẩ n v à t á c đ ộ n g q u a l ạ i v ớ i t i ể u c ầ u c h ố n g c h ả y m á u ; ( 3 ) H ệ t h ố n g k i n i n g i ú p c h o k i ể m s o á t t í n h t h ấ m t h à n h m ạ c h

 Ngoài ra còn có sự tham gia của các chất trung gian hóa học trong phản ứng viêm

 Prostaglandin: Khi tế bào bị tổn thương, màng phospholipid của tế bào bị thủy phân bởi phospholipase A2 tạo thành acid arachidonic Prostaglandin là sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic dưới tác dụng của enzym cyclooxygennase (COX) Có 2 loại enzym COX là COX-1 và COX-2 COX-1 có mặt ở hầu hết các mô, thận, dạ dày…tham gia tổng hợp các PG có tác dụng điều hòa chức phận sinh lý, ổn định nội môi, bảo vệ tế bào COX-2 được xem là enzym tiền viêm, chỉ xuất hiện ở các tổ chức bị tổn thương vàc ó v a i t r ò t ạ o r a c á c P G g â y v i ê m

 Leukotrien: Ngoài con đường COX, acid arachidonic còn có thể được chuyển hóa qua con đường lipoxygenase (LOX) để tạo ra các leukotrien.

 Histamin: Histamin là chất trung gian của phản ứng viêm do tế bào mast sản xuất ra từ histidinvà lưu trữ trongcác hạtchuyên biệt.Khi mô bịtổnthương,các hạtnàyđược phóng thích ra ào ạt Histamin làm giãn tiểu động mạch và tăng tính thấm mao mạch,có tác dụng hóa ứng động với bạch cầu ái toan.

 Bradykinin: Bradykinin là một trong những kinin huyết tương có vai trò quant r ọ n g t r o n g p h ả n ứ n g v i ê m , l à m dãn mạch, tăng tính thấmthành mạch, tăng hóa ứng động bạch cầu.

 Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu PAF: PAF hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính kícht h í c h c h ú n g b á m d í n h v à o t ế b à o n ộ i m ô P A F c ũ n g g â y v ỡ h ạ t , m ở đ ầ u c h o v i ệ c t i ế t c á c e n z y m lygiảivàgiảiphóngsuperoxyd.Mặtkháccònlàmtăngtínhthấmthànhmạch,gây phù Ngoài ra còn có tác dụng co thắt phế quản làm cho cơn hen nặng hơn và cũng tác động lên các tế bào máu gây giảm bạch cầu, tiểu cầu và phóng thích histamin.

 Cytokin: Cytokin là tên gọi một nhóm các phân tử có chức năng truyền đạt thông tin giữa các tế bào thuộc hệ miễn dịch và cả ngoài hệ miễn dịch như sự liền vết thương, quá trình tạo máu, sự hình thành mạch máu mới Có nhiều cytokin khác nhau: IL, yếu tố hoại tử khối u (TNF), interferon (IFN) [13] Các cytokin tác dụng trên tế bào nội mô, nguyên bào sơ can thiệp vào hiện tượng viêm Mặt khác, các IL còn liên kết cơ chế viêm với cơ chế miễn dịch.

 Rối loạn vận mạch: Ngay khi yếu tố gây viêm tác động, tại chỗ lần lượt xảy ra các hiện tượng sau [8], [9]:

Co mạch: Xảy ra rất sớm và rất ngắn, có tính phản xạ, do thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại Sung huyết động mạch: Ban đầu do cơ chế thần kinh và sau đó được duy trì và phát triển bằng cơ chế thể dịch Tại đây có sự giải phóng các enzym từ lysosom của tế bào chết, các hóa chất trung gian có hoạt tính từ tế bào mast và bạchcầu (histamin,bradykinin, prostaglandin, leukotrien…); haycácsảnphẩmhoạtđộng thực bào của bạch cầu (protease, ion H+, K+…); các cytokin (tumor necrosis factor – TNF, interleukin 1, platelet activating factor – PAF…) và nitric oxid (NO) do NO synthetase của các tế bào viêm sinh ra.

Sung huyết tĩnh mạch: Thần kinh vận mạch bị tê liệt, các chất gây dãn mạch ứ lại nhiều hơn tại ổ viêm Vai trò của sung huyết tĩnh mạch là dọn sạch ổ viêm, chuẩn bị cho quá trìnhsửa chữa và cô lậpổviêm,ngăn cản sự lan rộng của tác nhân gâybệnh Ứ máu:thần kinhvận mạch của huyếtquản bịtê liệt, tăng độnhớt máu Bạch cầu bámvàothành mạch làm tăng ma sát, phì đại của tế bào nội mô mạch máu Các chất giãn mạch như NO, histamin,bradykinin…làm tăng tính thấm thành mạch, nước thoát ra ngoài gây chèn ép thành mạch máu, hình thành huyết khối gây tắc mạch (do PAF làm vón tụ tiểu cầu).

 Hìnhthànhdịchviêm: Tạiổviêmcósựthoátnướchuyếttươngrakhỏithànhmạch và ứ đọng ở khoảng gian bào Các yếu tố gây giãn mạch làm nở các nơi tiếp xúc giữa các tếbàonội môthànhnhữngkhoảngtrốngdo tácdụnglên cácthành phầncothắtcủatếbào như actin, myosin, tropomyosin, alpha actinin, vinculin Protein trong huyết tương thoátr a k h ỏ i l ò n g m ạ c h t h e o t h ứ t ự t r ọ n g l ư ợ n g p h â n t ử t ừ n h ỏ đ ế n l ớ n l à a l b u m i n , g l o b u l i n , f i b r i n o g e n D ị c h v i ê m đ ư ợ c t h à n h l ậ p d o [ 8 ] : ( 1 ) S ự t ă n g á p l ự c t h ủ y t ĩ n h d o s u n g h u y ế t v à ứ m á u l à m đẩynước ra khỏithành mạch ở khoang mao mạch và đoạnđầu các tiểu tĩnh mạch; (2) Sự tăng tính thấmthành mạch máu bởi các yếu tố giãn mạch và tăng tính thấm: histamin, leukotrien, các sản phẩm phụ của bổ thể như C3a và C5a.

Viêmmạn

Một cách chủ quan, người ta phân biệt viêm cấp hay viêm mạn tùy thuộc vào thời gian kéo dài, có nghĩa là viêm mạn khi nào phản ứng viêm kéo dài trên hai tuần mà không cần xem xét nguyên nhân Ta có thể phân biệt hai trường hợp:

 Viêm mạn theo sau viêm cấp do đáp ứng viêm không thành công, ví dụ còn tồn tại vi khuẩn hay dị vật trong vết thương làm cho phản ứng viêm kéo dài.

 Viêm mạn có thể khởi phát ngay từ đầu ví dụ với vài loại vi khuẩn có vỏ lipid dày khiến các tế bào thực bào khó tiêu hủy chúng, chúng có thể tồn tại và tiếp tục kích thích phản ứng viêm như lao, phong, giang mai Có những trường hợp viêm mạn do có kích thích kéo dài bởi hóa chất hoặc tác nhân vật lý như hít bụi, chỉ khâu…. Đặc điểm của viêm mạn là sự thâm nhiễm (infiltration) của đại thực bào và tế bàol y m p h o K h i đ ạ i t h ự c b à o k h ô n g c ó k h ả n ă n g b ả o v ệ t ú c c h ủ c h ố n g l ạ i s ự t ổ n t h ư ơ n g m ô , c ơ t h ể s ẽ t ạ o t h à n h v ò n g v â y c ô l ậ p n ơ i b ị n h i ễ m , l ú c đ ó c ó s ự t h à n h l ậ p u h ạ t U h ạ t b ắ t đ ầ u khiđạithựcbàobiệthóathànhtếbàodạngbiểumô(epithelialcell), làcáctếbà o không có khả năng thực bào nhưng có thể bắt giữ các mảng nhỏ Các đại thực bào khác hợp lại thành các tế bào khổng lồ (giant cell), khiến chúng có khả năng thực bào những mảngtohơn.Bảnthân uhạtđượcbaobọc bởi môsợi(sợicollagen),giữauhạtcó thể hóa hyalin hoặc tích tụ chất vôi (CaCO3, Ca3(PO4)2) [43].

Cácthuốckhángviêm

Cácthuốckhángviêmkhôngsteroid(NSAID)

Tác dụng điều trị chủ yếu của NSAID là ức chế tổng hợp prostaglandin (PG) thông quaứ c c h ế e n z y m đ ầ u t i ê n t ổ n g h ợ p P G l à c y c l o o x y g e n a s e ( C O X )

E n z y m n à y b i ế n a c i d a r a c h i d o n i c (AA)thànhchấttrunggiankhôngbềnvữnglàPGGvà PGH, PGGvà PGHlà tiền chất của thromboxan A2 (TXA2) và nhiều PG khác [10] Có hai loại COX là COX-1 và COX-2 [49].

Trong quá trình viêm, các COX-2 tổng hợp PGH2 là một chất không bền, sau đó chuyển thành PG viêm như PGE2 và PGI2 Các PG góp phần gây giãn mạch, tăng tính thấmt h à n h m ạ c h vàgâyđau [10].CácNSAIDhoạtđộngtrêncơchếứcchếCOX-1vàCOX-2, từ đó ức chế tổng hợp PG Mặt khác, các thuốc này còn đối kháng với enzym phân hủy protein, ngăn cản quá trình biến đổi protein làmbền vững màng lysosomvà đối kháng tác dụng của các chất trung gian hóa học như bradykinin, histamin, serotonin, ức chế hóa hướng động bạch cầu, từ đó ức chế sự di chuyển của bạch cầu đến ổ viêm [9].

 Dẫnxuấtacidenolic(oxicam):Piroxicam,tenoxicam,meloxicam.

 Dẫnxuấtcủaacidpropionic:Ibuprofen,naproxen,ketoprofen,fenoprofen.

Tác dụng không mong muốn của các thuốc kháng viêm không steroid chủ yếu liên quan đến tác dụng ức chế tổng hợp PG [9].

Trêntiêuhóa:Gây loétdạdày tátràngdothuốcứcchếtổnghợp P G E 1 vàPGE2làm giảm sản xuất các yếu tố bảo vệ dạ dày.

Trên máu: Thuốc làm ức chế kết tập tiểu cầu và giảm prothrombin gây kéo dài thời gianđ ô n g m á u

Trênt h ậ n : T h u ố c ứ c c h ế t ổ n g h ợp P G E 2 v à P G I 2 l à m giảmlưu l ư ợ n g m á u đ ế n t h ậ n, g i ả m s ức l ọ c c ầu t h ậ n, g iả m t h ả i l à m ứ n ư ớ c, tă n g k a l i m á u v à v iê m t h ậ n k ẽ.

Trênhôhấp:ThuốcứcchếenzymCOXnênacidarachidonicchuyểnhóatheoconđường tạo ra LT gây co thắt phế quản.

Trên tim mạch: NSAIDgâyứ dịch,phù,tăng huyếtáp;thuốc ức chế chọnlọc COX-2làm tăng nguy cơ đột quy [10].

Phospholipid Các tác nhân gây viêm màng tế bào

Thuốckhángviêmsteroid(Glucocorticoid)

Glucocorticoid kích thích receptor nội bào điều hòa hoạt động gen dẫn đến thành lập lipocortin là chất ức chế phospholipase A2 nên ngưng sản xuất các yếu tố gây viêm như leukotrien, thromboxan, prostaglandin [10] Ngoài ra, glucocorticoid còn ức chế mạnh sự di chuyển bạch cầu về ổ viêm; ức chế giải phóng các enzym tiêu thể, ion superoxid (gốct ự d o ) , g i ả m h o ạ t t í n h c á c y ế u t ố h ó a h ư ớ n g đ ộ n g , c á c c h ấ t h o ạ t h ó a c ủ a p l a s m i n o g e n , c o l l a g e n a s e , e l a s t a s e … ; l à m giảmhoạt động thực bào của đại thực bào, bạch cầu đa nhân, giảm sản xuất cytokin [9].

Hình1.2.Vịtrítácdụngcủaglucocorticoidvàthuốckhángviêm không steroid trong tổng hợp PG

 Tácđộngtrungbình:Prednison,prednisolon,methylprednisolon,triamcinolon.

Mộtsốmôhìnhnghiêncứutácdụngkhángviêm

Môhìnhgâyviêmcấpvàbáncấp

Phản ứng viêm thường xuất hiện bốn triệu chứng điển hình là sưng, nóng, đỏ, đau Trong thực nghiệm, người ta dùng các chất hóa học để tạo ra các triệu chứng viêm tương tự trên lâm sàng để nghiên cứu tác dụng của thuốc Thuốc làm giảm các triệu chứng này được xem là có tác động kháng viêm Trong các phương pháp thì gây phù là phương pháp thường hay được sử dụng nhất [9].

Mô hình này có thể sử dụng nhiều chất gây viêm khác nhau như carrageenan, kaolin,dextran, formalin, dung dịch lòng trắng trứng, men bia….Khi tiêm các chất này vào bàn chân chuột sẽ kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, PG…gây phù Thuốc có khả năng làm giảm độ sưng phù được xem là có tác dụng kháng viêm.Carrageenan là một loại polysaccharid tạo gel và nhớt được chiết xuất từ một loài tảo đỏ lớpRhodophyceae.LoàitảonàyphổbiếnởĐạiTâyDươnggầnAnh,châuÂuvàBắc

Mỹ.Carrageenan khôngcó giátrịdinhdưỡng,đượcsử dụngtrongphụgiathựcphẩmlàm chất làm dày, tạo keo, sử dụng trong các thí nghiệm dược làm tác nhân gây viêm Carrageenan được sử dụng làm chất gây phù trong thử nghiệm mô hình kháng viêm trên động vật thử nghiệm để đánh giá hiệu quả kháng viêm của các thuốc thử nghiệm Đầu tiên,cơchếlàmphóngthíchcácserotoninvà histamin,sauđócácchấttrunggianhóahọc khác được giải phóng là PG, enzym COX và các kinin [9].

Mô hình này sử dụng các chất kích thích như oxazolon, dầu Ba đậu, capsaicin, xylen… bôi lên tai chuột làm giải phóng chất trung gian hóa học như histamin gây phù [9].

Viêm màng phổi là một hiện tượng viêm rỉ dịch Trong thí nghiệm trên động vật, có thể gây viêm màng phổi bằng các chất kích thích như histamin, bradykinin, PG, carrageenan, turpentin haytinh dầu thông làm thoát dịch viêm và sau đó tiến hành hút hết dịch rỉ màng phổi để xác định thể tích dịch rỉ [9].

Tia UV, tia X được chiếu lên vùng da chuột đã cạo sạch lông, sau đó đánh giá mức độ viêm dựa trên diện tích ban đỏ [9].

1.5.1.5 Mô hình sàng lqc chất kháng viêm thông qua thụ thể toll like 4 (TLR4) trên màng tế bào macrophage chuột Ở mô hình sàng lọc chất kháng viêm sử dụng thụ thể TLR4, tế bào macrophage chuột sẽ được xử lý với dịch chiết thực vật và sau đó được gây cảm ứng viêm bằng LPS (phối tử đặchiệucủaTLR4).Việcđo mức độảnhhưởngcủacác cytokinđượcgiảiphóngra làIL- 6, TNF-α và IL-10 sẽ cho phép kết luận dịch chiết thực vật có chứa chất kháng viêm tiềm năng và chất này có khả năng tác dụng kháng viêm theo con đường thụ thể TLR4 [7].

Môhìnhgâyviêmmạntính

Ngườitacó thể gâysự tạothành môhạt bằng cách cấydưới da động vậtnhữngvật lạnhư amianhaychấtkíchứngkhônghấpthuđượcnhưtinhdầuThông,dầuBađậu.Sauđóbóc tách túi u hạt và cân để đánh giá mức độ viêm [9].

Gây viêm đa khớp thực nghiệm bằng dung dịch tá chất Complete Freund's adjuvant( C F A ) t i ê m v à o b à n c h â n c h u ộ t ( c h u ộ t đ ư ợ c g â y m ê b ằ n g t h i o p e n t a n ) s a u đ ó đ o đ ộ p h ù t h ể t í c h c h â n đ ể đ á n h g i á m ứ c đ ộ v i ê m [ 9 ]

Cây Lá đắng được thu hái vào tháng 8 năm 2019 tại thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai. Câyđược PGS TS Trương Thị Đẹp định danh với tên khoa học làVernonia amygdalinaDelile thuộc họ Cúc (Asteraceae) Dược liệu được rửa sạch, tách lấy lá, phơi âm can và xaythành bột dược liệu thô Dược liệu được râyqua râycó đường kính mắt rây2 mm [9].

Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh thuộc chủngSwiss albinocó trọng lượng 20-30 g được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế (Nha Trang) Chuột được nuôi ổnđ ị n h 7 n g à y t ạ i p h ò n g t h í n g h i ệ m D ư ợ c l ý , K h o a D ư ợ c t r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c L ạ c H ồ n g t r ư ớ c k h i t i ế n h à n h t h ử n g h i ệ m C h ú n g đ ư ợ c n u ô i t r o n g n h ữ n g b o c a l n h ự a c ó n ắ p l ư ớ i i n o x đ ư ợ c t h i ế t k ế đ ặ c b i ệ t c h o p h é p c h u ộ t d ễ d à n g t i ế p x ú c v ớ i t h ứ c ă n v à n ư ớ c u ố n g

 Dung môi chiết: cồn 70% (Việt Nam),n-hexan, cloroform, ethyl acetat,n-butanol (Trung Quốc).

Thực hiện theo phương pháp “Xác định mất khối lượng do làm khô” Phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam V [3].

Thực hiện theo phương pháp “Xác định tro toàn phần” Phụ lục 9.8 Dược điển Việt NamV

Dùng phản ứng hóa học đặc trưng để xác định các nhóm hợp chất trong cao toàn phần và các cao phân đoạn Lá đắng [1].

Cân 5 kg bột khô dược liệu, chiết ngấm kiệt bằng cồn 70%, cô dịch chiết trên bếp cách thủythu được cao toàn phần Hòa cao vớinước, lắc phân bố vớicác dung môicó độ phân cực tăng dầnn-hexan, cloroform, ethyl acetat,n-butanol Bay hơi dung môi để được các cao tương ứng: caon-hexan, cao cloroform, cao ethyl acetat,n-butanol, phần dịch nước sau khi lắc vớin-butanol đem cô thu được cao nước.

Cao ethyl acetat Dịch chiết ethyl acetat

Làm ẩm và chiết với cồn 70%

Bay hơi cồn trên bếp cách thủy

2.2.4 Khảo sát tác dụng kháng viêm của các cao phân đoạn Lá đắng trên mô hìnhg â y p h ù c h â n c h u ộ t b ằ n g c a r r a g e e n a n

2.2.4.1 Quytrìnhđothểtíchchânchuột Đo độ phù bàn chân chuột bằng máy Plethysmometer 37140 của hãng Ugo Basile, Italy. Pha dung dịch đo bằng cách pha loãng 10 ml dung dịch dẫn điện được cung cấp kèmtheo máy trong 1 lít nước cất, lắc đều và để ổn định.

Cho dung dịch đo đã pha vào cốc chứa Bật máy và chờ 2-3 phút cho máy ổn định Điều chỉnh mực nướcdung dịchđo bằng cách xoaychốt cho mực nước trongcốc đo nằmtrong khoảng 2 vạch đánh dấu màu đỏ trên cốc đo.

Hiệu chỉnh máy bằng cách nhúng dụng cụ hiệu chỉnh có thể tích chuẩn xác định (0,5 ml) vào cốc đo và chỉnh màn hình cho đến khi hiển thị về số 00,00.

Tiến hành đo thể tích bàn chân trái chuột bằng cách nhúng chân chuột vào cốc đo (mực nướcđếnkhuỷuchân) vàđọc sốtrên mànhìnhhiểnthị.Saukhiđoxongthìrửa máybằng nước cất nhiều lần đến khi số trên màn hình hiển thị không thay đổi và tắt máy.

Pha dung dịch carrageenan 1% trong dung dịch nước muối sinh lý 0,9% Để yên dung dịch carrageenan 1% trong 1 giờ cho carrageenan trương nở và ổn định Chuột được gây viêm bằng cách tiêm dưới da (SC) vào gan bàn chân trái sau 0,025 ml dung dịch carrageenan 1% được pha trong dung dịch sinh lý [9], [11].

Hình2.2.TiêmSCganbànchânchuột Hình2.3.Đothểtíchchânchuộtvới máyPlethysmometer37140

Các số liệu được trình bày dưới dạng số trung bình (Mean) ± SD (Standard Deviation – Độlệchchuẩn).SựkhácbiệtgiữacáclôđượcphântíchbằngphépkiểmMann – Whitney với phần mềm Minitab 19,0 ở độ tin cậy95% (p < 0,05) Đồ thị được vẽ theo giá trị trung bình ± SD bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 [9].

Chọn chuột có khối lượng tương đối đồng đều với nhau Đo thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm Mỗi chuột sẽ được gây viêm bằng dung dịch carrageenan 1% pha trong NaCl 0,9% Đo thể tích bàn chân chuột 3 giờ sau khi gây viêm Những chuột có độ sưng phù chân tăng trên 50% so với thể tích châns i n h l ý b a n đ ầ u s ẽ đ ư ợ c c h ọ n v à p h â n b ổ n g ẫ u n h i ê n v à o c á c l ô n h ư s a u :

 LôIbu7,5(n=8):ibuprofenliều7,5mg/kg(po)[34].

 LôcaoTP(n=8):caotoànphầnliều1000mg/kg(po)[9].

Các lô chuột được cho uống với điều kiện 0,1 ml/10 g, ibuprofen và cao toàn phần được pha trong nước cất.

Theo dõi độ sưng phù chân chuột ở các lô thử nghiệm sau khi cho uống thuốc và cao 30 phút mỗingày, vào mộtgiờ nhấtđịnh(8giờ sáng), ở nhiệt độ phòng (25 – 30 o C),trong6 ngày liên tiếp [9], [11].

Chọn chuột có khối lượng tương đối đồng đều với nhau Đo thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm Mỗi chuột sẽ được gây viêm bằng dung dịch carrageenan 1% pha trong NaCl 0,9% Đo thể tích bàn chân chuột 3 giờ sau khi gây viêm Những chuột có độ sưng phù chân tăng trên 50% so với thể tích chân ban đầu sẽ được chọn và phân bổ ngẫu nhiên vào các lô như sau:

 Lôn-hex(n=8):caon-hexanliều30mg/kg(po).

 LôCF(n=8):caochloroformliều30mg/kg(po).

 LôEA(n=9):caoethylacetatliều30mg/kg(po).

 Lôn-bu(n=8):caon-butanolliều80mg/kg(po).

 Lônước(n=8):caonướcliều800mg/kg(po).

Các lô chuột được cho uống với điều kiện 0,1 ml/10 g, ibuprofen và các cao phân đoạn được pha trong nước cất, với liều cho uống dựa vào hiệu suất chiết phân đoạn từ cao toàn phần liều 1000 mg/kg.

Theo dõi độ sưng phù chân chuột ở các lô thử nghiệm sau khi cho dùng thuốc và cao 30 phút mỗingày, vào mộtgiờ nhấtđịnh(8giờ sáng), ở nhiệt độ phòng (25 – 30 o C), trong6 ngày liên tiếp [9], [11].

Thực hiện trên mẫu lá dược liệu Lá đắng đã thu hái, dựa theo Phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam V [3], tiến hành trên 03 mẫu, lấy kết quả trung bình, kết quả được ghi nhận trong bảng dưới đây.

Thực hiện trên mẫu lá dược liệu Lá đắng đã thu hái, dựa theo phụ lục 9.8 Dược điển Việt Nam V [3], tiến hành trên 03 mẫu, lấy kết quả trung bình, kết quả được ghi nhận trong bảng dưới đây.

Dịch chiết cồn (70 lít) Bột Lá đắng (5kg)

Cô trên bếp cách thủy

Đốitượngnghiêncứu

Hóachấtvàthuốcthử

 Dung môi chiết: cồn 70% (Việt Nam),n-hexan, cloroform, ethyl acetat,n-butanol (Trung Quốc).

Thiếtbịvàdụngcụthửnghiệm

Phươngphápnghiêncứu

Xácđịnhđộtinhkhiếtcủadượcliệu