Xây dựng quy trình định lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử và định lượng hợp chất polyphenol bằng phương pháp Folin Ciocalteu trong củ Sùng thảo (Stachys affinis Lamiaceae) Đề tài khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quy trình vô cơ hóa mẫu để định lượng Fe, Zn, Na, K trong củ Sùng thảo bằng mô hình thiết kế Box – Behnken; thẩm định quy trình định lượng Fe, Zn, Na, K trong củ Sùng thảo bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử. Trình bày khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa quy trình định lượng polyphenol trong củ Sùng thảo bằng mô hình thiết kế Box – Behnken; thẩm định quy trình định lượng polyphenol trong củ Sùng thảo bằng phương pháp Folin Ciocalteu.
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Củ Sùng thảo (Stachys affinis Bunge Lamiaceae) được thu hái vào tháng 5/2019 tại Trung tâm công nghệ sinh học Tp Hồ Chí Minh Củ được làm sạch, sấy đông khô rồi xay thành bột mịn Hàm ẩm của bột được thực hiện theo phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam V [4].
CHẤT CHUẨN, DUNG MÔI, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
- Dung dịch Na, K, Zn chuẩn 1000 àg/ml (Merck)
- Thuốc thử Folin - Ciocalteu (Sigma - Aldrich)
Acid nitric, acid hydrocloric, acid sulfuric, hydro peroxyd, ethanol tuyệt đối, natri carbonat khan (Trung Quốc) đạt tiêu chuẩn phân tích
- Máy quang phổ hấp thu nguyên tử Thermo iCE 3300
- Máy quang phổ UV-Vis TM Evolution 300
- Cân phân tích Sartorius Practum 224 – 1S (4 số lẻ)
- Các trang thiết bị, dụng cụ thủy tinh chính xác trong phòng thí nghiệm.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng các nguyên tố Fe, K, Na, Zn bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử
Mẫu trắng: dung môi pha mẫu
- Chuẩn gốc Fe: Cân 0,4963 g FeSO4.7H2O hòa tan trong bình định mức 100 ml với dung môi được dung dịch có nồng độ 1000 ppm Lọc bỏ 10 ml dung dịch đầu, hút chính xác 1 ml dịch lọc sau, pha loãng với dung môi vừa đủ 100 ml, thu được dung dịch có nồng độ 10 ppm của
- Chuẩn gốc Zn, Na và K: hút 1 ml dung dịch gốc có nồng độ 1000 ppm pha loãng với 100 ml dung môi ta thu được dung dịch có nồng độ 10 ppm
Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 10 ppm, dùng buret pha ra các dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng theo bảng sau:
Bảng 2.1 Cách pha mẫu chuẩn Fe, Na và K
Dung môi vừa đủ (ml) 50
Bảng 2.2 Cách pha mẫu chuẩn Zn
Dung môi vừa đủ (ml) 50
Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng Fe, Zn, Na và K bằng máy F-AAS
Xây dựng đường chuẩn: đo cường độ hấp thu nguyên tử (Fe, Zn, Na, K) các dung dịch chuẩn đã pha để lập đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ vạch phổ và nồng độ của mỗi nguyên tố phân tích Đường chuẩn thu được phải có hệ số tương quan R > 0,99 [10] Đo cường độ hấp thu của dung dịch mẫu thử, dựa vào đường chuẩn và phương trình hồi quy suy ra hàm lượng các nguyên tố trong mẫu thử
Hàm lượng nguyên tố (mg/g) = 𝐶 × 𝐷 × 100
• C: Nồng độ nguyên tố trong mẫu thử suy ra từ đường chuẩn (ppm)
• D: Độ pha loãng mẫu thử
• m: Khối lượng cân mẫu thử (g)
• H: Hàm ẩm của dược liệu (%) Độ ẩm được xác định bởi sự chênh lệch về khối lượng mẫu trước khi sấy và sau khi sấy ở 105 ± 2 °C đến khối lượng không đổi
• m 𝑡𝑟𝑢𝑜𝑐 : Khối lượng dược liệu trước khi sấy (g)
• m 𝑠𝑎𝑢 : Khối lượng dược liệu sau khi sấy (g)
2.3.1.2 Khảo sát dung môi pha mẫu
Dung môi pha mẫu, cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS Các acid, nồng độ khác nhau sẽ cho các kết quả khác nhau Ảnh hưởng này thường gắn liền với loại anion của acid Các acid càng khó bay hơi càng làm giảm nhiều cường độ vạch phổ Nói chung, các acid làm giảm cường độ vạch phổ theo thứ tự: HClO4 < HCl < HNO3 < H2SO4
< H3PO4 < HF, nghĩa là acid HClO4, HCl và HNO3 gây ảnh hưởng nhỏ nhất
Bên cạnh đó anion ClO4 – gây hiệu ứng dương, tức là làm tăng cường độ vạch phổ của nguyên tố phân tích trong một số trường hợp ở một vùng nồng độ nhất định và các dung môi pha mẫu trong phương pháp AAS thường được sử dụng ở nồng độ loãng Do đó, đề tài chọn 3 acid với các nồng độ như sau làm dung môi pha mẫu: HNO3 1%, HCl 0,1 N, và H2SO4 0,1 N [12]
Dung dịch HNO 3 1%: Pha loãng 15 g acid nitric với nước vừa đủ 1000 ml
Dung dịch HCl 0,1 N: Pha loãng 8,5 ml acid hydrocloric với nước vừa đủ 1000 ml
Dung dịch H 2 SO 4 0,1 N: Cho cẩn thận 5,4 ml acid sulfuric vào đồng thể tích nước, thêm nước vừa đủ 1000 ml
Tiến hành vô cơ hóa mẫu bằng phương pháp vô cơ hóa khô - ướt kết hợp theo mục 2.3.1.3, pha loãng mẫu với 3 loại dung môi rồi định lượng bằng máy quang phổ AAS, so sánh kết quả hàm lượng Fe, Zn, Na và K, từ đó lựa chọn ra dung môi thích hợp nhất
2.3.1.3 Khảo sát phương pháp vô cơ hóa mẫu
Xử lí mẫu là giai đoạn rất quan trọng trong phân tích Nếu xử lí mẫu không tốt thì kết quả phân tích sẽ sai Ngoài ra chúng ta cần quan tâm đến các yếu tố khác như: nhân sự, thời gian, dung môi, hóa chất, trang thiết bị nhằm đưa ra một phương pháp tối ưu, hiệu quả Mẫu là bột dược liệu có nhiều chất hữu cơ, phương pháp vô cơ hóa khô cần nhiều thời gian tiến hành và khó vô cơ hóa hoàn toàn, do đó đề tài chọn phương pháp vô cơ hóa ướt và vô cơ hóa khô – ướt kết hợp
Phương pháp 1: Vô cơ hóa ướt với acid HNO 3 đđ và H 2 O 2 đđ
Cân khoảng 0,5 g bột Sùng thảo vào cốc nung 50 ml Thêm 5 ml dd HNO3 đậm đặc vào cốc Đun trên bếp điện ở nhiệt độ 200 °C, thỉnh thoảng lắc nhẹ tránh để mẫu bám lên thành cốc, đun đến cắn ẩm, khí nâu thoát ra hết Thêm 1 ml dd H2O2 và tiếp tục đun cho đến cắn ẩm
Phương pháp 2: Vô cơ hóa khô – ướt kết hợp
Cân khoảng 0,5 g bột Sùng thảo vào cốc nung 50 ml Thêm 2 ml dd HNO3 đậm đặc vào cốc Đun trên bếp điện ở nhiệt độ 200 °C cho đến khi đen hết toàn bộ mẫu Cho cốc vào lò, nung ở nhiệt độ 450 °C đến khi mẫu chuyển sang màu trắng (khoảng 5 - 6 h)
Sau khi vô cơ hóa, pha loãng mẫu với DMPM đã chọn ở mục 2.1.3.2 như sơ đồ 2.1 rồi tiến hành đo nồng độ Fe, K, Na và Zn bằng máy AAS So sánh kết quả hàm lượng của 4 nguyên tố, từ đó lựa chọn ra phương pháp vô cơ hóa thích hợp nhất
Lưu ý : Trong quá trình đun phải thực hiện trong tủ hút và cẩn thận khi lấy mẫu từ lò nung
Hình 2.1 Sơ đồ pha loãng mẫu sau khi vô cơ hóa 2.3.1.4 Tối ưu hóa quy trình vô cơ hóa mẫu
Qua khảo sát sơ bộ cho thấy: với phương pháp vô cơ hóa ướt, các yếu tố có thể ảnh hưởng đến hàm lượng các nguyên tố là nhiệt độ đun, nồng độ hoặc thể tích dung dịch HNO3 và H2O2 Với phương pháp vô cơ hóa khô - ướt kết hợp, các yếu tố có thể ảnh hưởng là nồng độ hoặc thể tích HNO3, nhiệt độ và thời gian nung Do đó, đề tài chọn các yếu tố để tối ưu hóa như sau:
Bảng 2.3 Các yếu tố khảo sát theo mô hình Box-Behnken
Nếu chọn pp vô cơ hoá ướt Nếu chọn pp vô cơ hoá khô - ướt kết hợp
Yếu tố Biến số Yếu tố Biến số
Nồng độ HNO3 16% – 32% – 64% Nồng độ HNO3 16% – 32% – 64%
Nhiệt độ đun 100 – 200 – 300 °C Nhiệt độ nung 450 – 550 – 650 °C
Thể tích H2O2 1,0 – 1,5 – 2,0 ml Thời gian nung 4h30 – 5h30 – 6h30
Sau khi chọn được phương pháp xử lý mẫu ở mục 2.3.1.3, bố trí thí nghiệm theo mô hình tối ưu hóa Box – Behnken, pha mẫu rồi tiến hành đo nồng độ Fe, K, Na và Zn bằng máy AAS
Sử dụng phần mềm Modde 5.0 để kiểm tra kết quả và lựa chọn quy trình tối ưu nhất
Sau đó tiến hành định lượng các nguyên tố theo các điều kiện mà phần mềm đã dự đoán Kiểm tra kết quả của quy trình có lặp lại không Nếu kết quả có sự lặp lại thì sử dụng các điều kiện này thẩm định quy trình định lượng
Hòa tan mẫu vô cơ hóa với DMPM vào BĐM 50 ml
Hút 2 ml vào BĐM 20 ml Hút 1 ml vào BĐM 100 ml Đo Fe Đo Zn Đo Na Đo K
2.3.1.5 Thẩm định quy trình định lượng Fe, Zn, Na và K trong củ Sùng thảo
Quy trình định lượng Fe, Zn, Na và K trong củ Sùng thảo được thẩm định theo hướng dẫn của ICH, AOAC và phụ lục 8 Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc [2], [16], [23]
Mẫu trắng, mẫu chuẩn: chuẩn bị mẫu giống như ở mục 2.3.1.1
Mẫu thử: chuẩn bị mẫu giống như ở mục 2.3.1.4
Mẫu thử thêm chuẩn: mẫu thử được thêm vào một lượng chất chuẩn nhất định của nguyên tố cần phân tích (mẫu độ đúng 100 %)
Tiến hành đo cường độ phổ hấp thu của các mẫu
Xác định có các nguyên tố Fe, Zn, Na và K trong mẫu chuẩn và mẫu thử
Mẫu trắng không có tín hiệu của bất cứ nguyên tố nào
Khi thêm 1 lượng chất chuẩn vào mẫu thử, cường độ hấp thu nguyên tố tăng lên so với trước khi thêm chuẩn [2].
Pha dãy tuyến tính: Tương tự cách pha mẫu chuẩn tại mục 2.3.1.1
Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đường biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và cường độ hấp thụ của 4 nguyên tố
Y = aX + b Trong đó: X: Nồng độ (ppm); Y: Độ hấp thu (Abs)
Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy
Yêu cầu: Tính tuyến tính được đánh giá qua giá trị R > 0,99 [16] Độ lặp lại
Mẫu thử: chuẩn bị mẫu theo quy trình sau khi tối ưu hóa ở mục 2.3.1.4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG Fe, Zn, Na, K BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ
3.1.1 Độ ẩm của dược liệu
Khối lượng dược liệu trước khi sấy: mtruoc = 2,0318 (g)
Khối lượng dược liệu sau khi sấy: msau = 1,9152 (g)
3.1.2 Khảo sát dung môi pha mẫu
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của HNO3 1 %, HCl 0,1 N và H2SO4 0,1 N đến độ hấp thu được thể hiện qua bảng 3.1
Bảng 3.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của DMPM đến độ hấp thu của mẫu
Nguyên tố Mẫu HNO 3 1 % H 2 SO 4 0,1 N HCl 0,1 N
Kết quả thu được cho thấy độ hấp thu của các nguyên tố khi sử dụng HNO3 0,1%, HCl 0,1 N và H2SO4 0,1 N có sự khác biệt rõ ràng Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng của các nguyên tố khi được pha với HNO3 0,1% cao hơn so với 2 acid còn lại và giá trị RSD cũng ổn định hơn Vì vậy đề tài chọn acid HNO3 0,1% để làm dung môi pha mẫu
3.1.3 Khảo sát phương pháp vô cơ hóa
Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp vô cơ hóa ướt và vô cơ hóa khô-ướt kết hợp như mô tả ở mục 2.3.1.3 và đo độ hấp thu của 4 nguyên tố Fe, Zn, Na, K bằng máy quang phổ AAS Kết quả hàm lượng 4 nguyên tố đo được của 2 phương pháp vô cơ hóa được trình bày theo bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát phương pháp vô cơ hóa Phương pháp vô cơ hóa
Dựa vào thực nghiệm cho thấy, có sự khác biệt giữa phương pháp vô cơ khô – ướt kết hợp và vô cơ hóa ướt sử dụng HNO3 và H2O2 Hàm lượng các nguyên tố thu được từ phương pháp vô cơ khô – ướt kết hợp đều cao hơn và ổn định hơn so với vô cơ hóa ướt Dung dịch sau khi vô cơ khô – ướt kết hợp trong và sạch hơn rất nhiều so với phương pháp còn lại
Ngoài ra, phương pháp vô cơ khô - ướt kết hợp còn có ưu điểm thao tác dễ làm, an toàn, ít bị văng bắn acid ra ngoài trong quá trình đun, sử dụng ít acid đậm đặc hơn
Vì vậy, đề tài lựa chọn phương pháp vô cơ hóa khô - ướt kết hợp để xử lý mẫu
3.1.4 Tối ưu hóa điều kiện vô cơ hóa mẫu
Tiến hành xác định thông số tối ưu của 3 yếu tố: thời gian, nồng độ acid HNO3 và nhiệt độ theo phương pháp vô cơ hóa khô – ướt kết hợp Các yếu tố khảo sát được bố trí thực nghiệm theo mô hình Box – Behnken, kết quả được thể hiện ở các bảng và hình sau
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tối ưu hóa theo mô hình Box – Behnken
Hình 3.1 Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu nguyên tố Fe
Q 2 : Hệ số tương quan nội (âm khi mô hình bố trí thí nghiệm xấu)
R 2 : Hệ số tương quan (phải > 0,9, càng gần 1 mô hình dự đoán tốt)
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy các giá trị Q 2 = 0,889 và R 2 = 0,985 [7] Suy ra mô hình bố trí thí nghiệm tốt, dễ dự đoán
Giá trị P nhỏ hơn 0,05 Suy ra mô hình phù hợp thí nghiệm
Hình 3.2 Các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính nguyên tố Fe
Các hệ số p > 0,05 được đánh ghi thành màu đỏ và sẽ loại bỏ ra khỏi phương trình Phương trình bề mặt đáp ứng đối với hàm lượng nguyên tố Fe được thiết lập như sau:
• Y: Hàm lượng nguyên tố Fe
Hình 3.3 Đường biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng Fe
Thời gian nung là 330 phút thì hàm lượng Fe cao nhất, khi tăng hay giảm thời gian thì hàm lượng Fe giảm
Nhiệt độ nung là 650 °C cho hàm lượng cao nhất, khi nung ở nhiệt độ thấp hơn mẫu không được vô cơ hết, cắn còn nhiều ảnh hưởng nhiều đến kết quả đo
Nồng độ acid càng tăng thì hàm lượng Fe càng tăng, hàm lượng Fe cao nhất khi nồng độ acid là khoảng 55%, ở nồng độ acid từ 40 – 64% thì sự thay đổi nồng độ ảnh hưởng không đáng kể đến hàm lượng Fe
Hình 3.4 Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu nguyên tố Zn
Q 2 : Hệ số tương quan nội (âm khi mô hình bố trí thí nghiệm xấu)
R 2 : Hệ số tương quan (phải > 0,9, càng gần 1 mô hình dự đoán tốt)
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy các giá trị Q 2 = 0,775 và R 2 = 0,928 [7] Suy ra mô hình bố trí thí nghiệm tốt, dễ dự đoán
Giá trị p nhỏ hơn 0,05 Suy ra mô hình phù hợp thí nghiệm
Hình 3.5 Đánh giá các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính nguyên tố Zn Các hệ số p > 0,05 được đánh ghi thành màu đỏ và sẽ loại bỏ ra khỏi phương trình
Phương trình bề mặt đáp ứng đối với hàm lượng nguyên tố Zn được thiết lập như sau:
• Y: Hàm lượng nguyên tố Zn
Hình 3.6 Đường biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng Zn
Thời gian nung là 330 phút thì hàm lượng Zn cao nhất, khi tăng hay giảm thời gian thì hàm lượng Zn giảm
Nhiệt độ nung là 540 °C cho hàm lượng thấp, khi nung ở nhiệt độ cao hơn mẫu được vô cơ hết và cho ra hàm lượng cao hơn
Hàm lượng Zn cao nhất khi nồng độ acid là 40%, và nồng độ acid càng tăng hay giảm thì hàm lượng Zn càng giảm
Hình 3.7 Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu nguyên tố Na
Q 2 : Hệ số tương quan nội (âm khi mô hình bố trí thí nghiệm xấu)
R 2 : Hệ số tương quan (phải > 0,9, càng gần 1 mô hình dự đoán tốt)
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy các giá trị Q 2 = 0,865 và R 2 = 0,985 [7] Suy ra mô hình bố trí thí nghiệm tốt, dễ dự đoán
Giá trị p nhỏ hơn 0,05 Suy ra mô hình phù hợp thí nghiệm
Hình 3.8 Đánh giá các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính nguyên tố Na
Các hệ số p > 0,05 được đánh ghi thành màu đỏ và sẽ loại bỏ ra khỏi phương trình Phương trình bề mặt đáp ứng đối với hàm lượng nguyên tố Na được thiết lập như sau:
• Y: Hàm lượng nguyên tố Na
Hình 3.9 Đường biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng Na
Thời gian nung là 390 phút thì hàm lượng Na cao nhất, khi giảm thời gian thì hàm lượng Na thay đổi không đáng kể
Nhiệt độ càng cao thì hàm lượng Na càng cao, vì khi nung ở nhiệt độ cao mẫu được vô cơ hết, hàm lượng nguyên tố cao hơn
Nồng độ acid càng tăng thì hàm lượng Na càng tăng, hàm lượng Na cao nhất khi nồng độ acid là 57%, và từ 57% trở lên thì sự thay đổi nồng độ acid dẫn đến sự thay đổi hàm lượng của Na không đáng kể
Hình 3.10 Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu nguyên tố K
Q 2 : Hệ số tương quan nội (âm khi mô hình bố trí thí nghiệm xấu)
R 2 : Hệ số tương quan (phải > 0,9, càng gần 1 mô hình dự đoán tốt)
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy các giá trị Q 2 = 0,790 và R 2 = 0,967 [7] Suy ra mô hình bố trí thí nghiệm tốt, dễ dự đoán
Giá trị P nhỏ hơn 0,05 Suy ra mô hình phù hợp thí nghiệm
Hình 3.11 Các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính nguyên tố K
Các hệ số p > 0,05 được đánh ghi thành màu đỏ và sẽ loại bỏ ra khỏi phương trình Phương trình bề mặt đáp ứng đối với hàm lượng nguyên tố K được thiết lập như sau:
Hình 3.12 Đường biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng K
Thời gian nung là 330 phút thì hàm lượng K cao nhất, khi tăng hay giảm thời gian nung thì hàm lượng K giảm
Nhiệt độ nung là 460℃ cho hàm lượng cao nhất, sau đó càng tăng nhiệt độ thì hàm lượng K càng giảm
Nồng độ acid thích hợp là 37% cho ra hàm lượng K cao nhất, khi tăng hay giảm Nồng độ acid thì hàm lượng K giảm
Tối ưu hóa các điều kiện vô cơ hóa mẫu bằng phần mềm Modde 5.0
Hình 3.13 Các thông số tối ưu dự đoán bởi phần mềm MODDE 5.0
Từ kết quả được dự đoán bởi công cụ Prediction Optimizer MODDE 5.0, xác định được các điều kiện tối ưu như sau:
Với các điều kiện tối ưu như trên hàm lượng nguyên tố K chưa được tối ưu Do đó, tiến hành tìm điều kiện tối ưu để định lượng đồng thời 3 nguyên tố Fe, Zn, Na và điều kiện tối ưu để định lượng nguyên tố K riêng
Hình 3.14 Dự đoán điều kiện tối ưu của nguyên tố Fe, Zn, Na Tiến hành dùng công cụ Prediction Optimizer MODDE 5.0, xác định được các điều kiện tối ưu để định lượng đồng thời 3 nguyên tố Fe, Zn và Na như sau:
• Nồng độ acid: 53% Điều kiện trên được chọn để định lượng đồng thời 3 nguyên tố Fe, Zn và Na Và với các điều kiện tối ưu như trên hàm lượng nguyên tố Fe, Zn và Na được dự đoán là Fe 0,0884 (mg/g),
Tiến hành dùng công cụ Prediction Optimizer MODDE 5.0, xác định được các điều kiện tối ưu của các nguyên tố K như sau:
Hình 3.15 Các thông số tối ưu dự đoán của nguyên tố K Với các điều kiện tối ưu như trên hàm lượng nguyên tố K được dự đoán là 17,9541 (mg/g)
Kết luận: như vậy sau khi tiến hành tối ưu hóa với mô hình Box-Behnken bằng phần mềm
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TOÀN PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP FOLIN – CIOCALTEU
3.2.1 Khảo sát quy trình định lượng polyphenol toàn phần
Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại
Hình 3.20 Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại Động học phản ứng
Hình 3.21 Phổ động học phản ứng của mẫu chuẩn và thử
Nhận xét: Bước sóng hấp thu cực đại của mẫu thử và mẫu chuẩn ở khoảng 750 nm Khi khảo sát động học, sau 120 phút ở bước sóng 750 nm thì độ hấp thu không thay đổi nhiều và chất bắt đầu ổn định Như vậy để mẫu ổn định chọn thời gian ủ mẫu là 120 phút
3.2.2 Tối ưu hóa quy trình định lượng polyphenol
Kết quả tối ưu hóa quy trinh fđịnh lượng polyphenol theo mô hình Box – Behnken được thể hiện ở các bảng và hình sau:
Bảng 3.14 Kết quả bố trí thực nghiệm các điều kiện khảo sát theo mô hình Box - Behnken
Thể tích Na2CO3 (ml)
% Ethanol Độ hấp thu mẫu chuẩn Độ hấp thu mẫu thử
Hình 3.22 Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu nguyên tố
Q 2 : hệ số tương quan nội (âm nếu mô hình bố trí thí nghiệm xấu, càng gần 1 mô hình dự đoán càng tốt)
R 2 : hệ số tương quan (phải > 0,9, càng gần 1 mô hình dự đoán càng tốt)
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy: Q 2 = 0,919; R 2 = 0,994 [7] Suy ra mô hình bố trí thí nghiệm tốt, dễ dự đoán
Giá trị P = 0,000 < 0,05 Suy ra mô hình phù hợp với thực nghiệm
Hình 3.23 Kết quả đánh giá các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính
Nhận xét kết quả đánh giá các hệ số của phương trình hồi quy tuyến tính:
Các hệ số p > 0,05 sẽ được đánh dấu màu đỏ và loại bỏ khỏi phương trình
Phương trình bề mặt đáp ứng đối với Hàm lượng được thiết lập như sau:
• Y: hàm lượng (hàm lượng mẫu thử)
• X1: FCR (thể tích thuốc thử)
• X2: Na2CO3 (thể tích Na2CO3)
Hình 3.24 Đường biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng polyphenol Nhận xét:
Thể tích thuốc thử FCR ở 6 ml cho hàm lượng polyphenol cao nhất Khi tăng thể tích lên thì hàm lượng polyphenol không đổi
Thể tích Na2CO3 ở 1,5 ml cho hàm lượng cao nhất, khi tăng thể tích càng tăng thì hàm lượng polyphenol có xu hướng giảm dần
Nồng độ EtOH ở 25% thì hàm lượng polyphenol cao nhất, khi nồng độ tăng dần thì hàm lượng polyphenol giảm dần
Hình 3.25 Các thông số tối ưu dự đoán bởi phần mềm MODDE 12.0
Từ kết quả được dự đoán bởi công cụ Predicition Optimizer trong MODDE 12.0, xác định được các điều kiện tối ưu như sau:
• Thể tích Na2CO3: 1,5 ml
Quy trình định lượng tối ưu như sau:
Bảng 3.15 Quy trình định lượng polyphenol tối ưu
Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu thử thêm chuẩn Mẫu trắng Acid gallic
Lắc đều để yên trong bóng tối 5 phút ở nhiệt độ phòng
Nước cất Vừa đủ 10 ml
Lắc đều, để yên trong tối 120 phút ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thu ở bước sóng 750 nm
3.2.3 Thẩm định quy trình định lượng polyphenol toàn phần:
Tính tương thích hệ thống
Tiến hành đo 6 lần độ hấp thu của mẫu chuẩn Tính giá trị RSD Kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.16 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống
Kết luận: Quy trình định lượng polyphenol toàn phần đạt chỉ tiêu tính tương thích hệ thống
Hình 3.26 Phổ UV – Vis đánh giá độ đặc hiệu
Nhận xét: Đỉnh hấp thu của cả 3 mẫu chuẩn, thử và thử thêm chuẩn gần tương đương nhau
Khi thêm chất đối chiếu vào mẫu thử cho thấy độ hấp thu ở bước sóng 739 nm trong mẫu thử tăng lên rõ rệt so với lúc chưa thêm chất đối chiếu
Mẫu trắng không cho đỉnh hấp thu ở bước sóng hấp thu cực đại 750nm [2]
Kết luận: Quy trình định lượng polyphenol toàn phần đạt chỉ tiêu độ đặc hiệu
Kết quả khảo sát tính tuyến tính được thể hiện ở các hình và bảng sau:
Bảng 3.17 Kết quả khảo sát tính tuyến tính
STT Phần trăm so với nồng độ định lượng (%)
Nồng độ acid gallic tương ứng (𝝁g/ml) Độ hấp thu mẫu chuẩn
Hình 3.27 Biểu đồ đường chuẩn khảo sát tính tuyến tính
Nhận xét: Hệ đố tương quan R = 0,9998 > 0,998 [2] Có sự liên quan tuyến tính giữa độ hấp thu và nồng độ chuẩn acid gallic Phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0102x – 0,0056 Khoảng tuyến tớnh của dung dịch chuẩn acid gallic 20,32 – 101,6 (àg/ml)
Kết luận: Quy trình định lượng polyphenol toàn phần đạt tính tuyến tính Độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp lại được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ lặp lại
Lượng cân mẫu (g) Độ hấp thu mẫu chuẩn Độ hấp thu mẫu thử
Kết luận: Quy trình định lượng polyphenol toàn phần đạt chỉ tiêu độ lặp lại y = 0.0102x - 0.0056 R² = 0.9998
0 20 40 60 80 100 120 Độ chính xác trung gian
Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian
Lượng cân mẫu (g) Độ hấp thu mẫu chuẩn Độ hấp thu mẫu thử
Kết quả RSD định lượng của từng ngày lần lượt là 1,90% và 2,35 đạt yêu cầu < 6% [16] Tiến hành phân tích bằng công cụ “Anova: Single Factor” của Excel:
- Đặt Ho là không khác biệt có ý nghĩa thống kê Ha là khác biệt có ý nghĩa thống kê
- Giá trị F = 2,161231 < Fcrit = 4,964603 Chọn Ho tức là hàm lượng mẫu thử 2 ngày định lượng không khác biệt có ý nghĩa thống kê Vậy quy trình định lượng không đạt độ chính xác trung gian. Độ đúng
Kết quả khảo sát độ đúng được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ đúng
Lượng thêm vào (%) Độ hấp thu của mẫu
Hàm lượng trong mẫu (àg)
Nhận xét: Tỷ lệ hồi phục đều nằm trong giới hạn cho phép 92,0 – 105,0% [16] RSD đều nhỏ hơn 6%
Kết luận: Quy trình định lượng polyphenol toàn phần đạt chỉ tiêu độ đúng
Kết luận chung: Quy trình định lượng polyphenol đạt tất cả chỉ tiêu thẩm định về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng.
BÀN LUẬN
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHÉP PHÂN TÍCH
4.1.1 Khảo sát dung môi pha mẫu
Dung môi pha mẫu là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS Các loại acid, ở các nồng độ khác nhau sẽ cho các kết quả khác nhau Ảnh hưởng này thường gắn liền với loại anion của acid Các acid càng khó bay hơi càng làm giảm nhiều cường độ vạch phổ
Nói chung, các acid làm giảm cường độ vạch phổ theo thứ tự: HClO4 < HCl < HNO3 < H2SO4
< H3PO4 < HF, nghĩa là acid HClO4, HCl và HNO3 gây ảnh hưởng nhỏ nhất
Bên cạnh đó anion ClO4 – gây hiệu ứng dương, tức là làm tăng cường độ vạch phổ của nguyên tố phân tích trong một số trường hợp ở một vùng nồng độ nhất định và các dung môi pha mẫu trong phương pháp AAS thường được sử dụng ở nồng độ loãng Do đó, đề tài chọn 3 acid với các nồng độ như sau làm dung môi pha mẫu: HNO3 1%, HCl 0,1 N, và H2SO4 0,1 N [12] Kết quả thu được cho thấy độ hấp thu của các nguyên tố khi sử dụng HNO3 0,1%, HCl 0,1 N và H2SO4 0,1 N có sự khác biệt rõ ràng Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng của các nguyên tố khi được pha với HNO3 0,1% cao hơn so với 2 acid còn lại và giá trị RSD cũng ổn định hơn Vì vậy, đề tài chọn acid HNO3 0,1% để làm dung môi pha mẫu
4.1.2 Khảo sát phương pháp vô cơ hóa
Xử lí mẫu là giai đoạn rất quan trọng trong phân tích Nếu xử lí mẫu không tốt thì kết quả phân tích sẽ sai Ngoài ra chúng ta cần quan tâm đến các yếu tố khác như: nhân sự, thời gian, dung môi, hóa chất, trang thiết bị nhằm đưa ra một phương pháp tối ưu, hiệu quả Mẫu là bột dược liệu có nhiều chất hữu cơ, phương pháp vô cơ hóa khô cần nhiều thời gian tiến hành và khó vô cơ hóa hoàn toàn, do đó đề tài chọn phương pháp vô cơ hóa ướt và vô cơ hóa khô – ướt kết hợp
Dựa vào thực nghiệm cho thấy, có sự khác biệt giữa phương pháp vô cơ khô – ướt kết hợp và vô cơ hóa ướt sử dụng HNO3 và H2O2 Hàm lượng các nguyên tố thu được từ phương pháp vô cơ khô – ướt kết hợp đều cao hơn và ổn định hơn so với vô cơ hóa ướt Dung dịch sau khi vô cơ khô – ướt kết hợp trong và sạch hơn rất nhiều so với phương pháp còn lại
Ngoài ra, phương pháp vô cơ hóa khô - ướt kết hợp còn có ưu điểm thao tác dễ làm, an toàn, ít bị văng bắn acid ra ngoài trong quá trình đun, sử dụng ít acid đậm đặc hơn
Vì vậy, đề tài lựa chọn phương pháp vô cơ hóa khô - ướt kết hợp để xử lý mẫu
Qua khảo sát sơ bộ cho thấy: với phương pháp vô cơ hóa ướt, các yếu tố có thể ảnh hưởng đến hàm lượng các nguyên tố là nhiệt độ đun, nồng độ hoặc thể tích dung dịch HNO3 và H2O2 Với phương pháp vô cơ hóa khô - ướt kết hợp, các yếu tố có thể ảnh hưởng là nồng độ hoặc thể tích HNO3, nhiệt độ và thời gian nung Do đó, đề tài chọn các yếu tố để tối ưu hóa như sau: thời gian nung, nhiệt độ nung, nồng độ acid HNO3 Tiến hành tối ưu hóa các yếu tố trên bằng phần mềm MODDE và thu được kết quả như sau:
Nguyên tố Fe, Zn, Na
Nồng độ acid thấp không đủ mạnh để phá vỡ cấu trúc của dược liệu, thời gian vô cơ kéo dài, nhưng kết quả lại không được cao Nồng độ càng cao việc vô cơ hóa mẫu trở nên dễ dàng hơn, tuy nhiên việc sử dụng acid đđ dễ gây nguy hiểm đến người thực hiện Vì vậy cần cẩn thận trong suốt quá trình làm
Thời gian nung mẫu ngắn dẫn đến quá trình vô cơ mẫu chưa triệt để, mẫu còn nhiều cắn trong suốt quá trình nung Khi tăng thời gian lên thì hàm lượng mẫu càng cao
Với các điều kiện tối ưu như trên hàm lượng nguyên tố Fe, Zn và Na được dự đoán là 0,0884 (mg/g), Zn 0,0661 (mg/g), Na 3,4014 (mg/g) Tuy nhiên theo điều kiện này thì K chưa được tối ưu, do đó, điều kiện trên được chọn để định lượng đồng thời 3 nguyên tố Fe, Zn và Na Tiến hành dùng công cụ Prediction Optimizer MODDE 5.0, xác định được các điều kiện tối ưu của các nguyên tố K như sau:
Với các điều kiện tối ưu như trên hàm lượng nguyên tố K được dự đoán là 17,95 (mg/g)
4.1.4 Thẩm định quy trình định lượng
Quy trình định lượng Fe, Zn, Na và K trong củ Sùng thảo được thẩm định theo hướng dẫn của ICH, AOAC và phụ lục 8 Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc Quy trình đạt các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại và chính xác trung gian, độ đúng (không đạt độ lặp lại với nguyên tố Na).
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TOÀN PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP FOLIN-CIOCALTEU
4.2.1 Khảo sát các quy trình định lượng polyphenol
Với mục đích chiết xuất được lượng hợp chất polyphenol cao nhất, đề tài đã tham khảo các nghiên cứu khác, đồng thời khảo sát quy trình định lượng polyphenol và thu được kết quả như sau:
Bước sóng hấp thu cực đại: 750nm
Thời gian ổn định phản ứng: 120 phút
Sau khi khảo sát sơ bộ cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol chiết được Thể tích thuốc thử FCR 10% và thể tích Na2CO3 15% cũng ảnh hưởng đến phản ứng Nếu thể tích Na2CO3 nhiều hơn thể tích thuốc thử FCR sẽ làm dung dịch sau phản ứng bị kết tủa và nếu ít hơn sẽ không đủ để phản ứng, làm dư thuốc thử FCR dẫn đến kết quả độ hấp thu không chính xác
Do đó, tiến hành xác định thông số tối ưu của 3 yếu tố: Nồng độ ethanol, thể tích thuốc thử FCR 10% và thể tích Na2CO3 15% Tiến hành tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất bằng phần mềm tối ưu MODDE 12.0 Kết quả thu được như sau:
• Thể tích Na2CO3: 1,5 ml
4.2.3 Thẩm định quy trình định lượng
Quy trình định lượng polyphenol đạt tất cả chỉ tiêu thẩm định về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng.