Nghiên cứu tác dụng điều trị tổn thương gan của cao toàn phần lá đắng Vernonia amygdalina Delile trên chuột nhắt trắng gây độc bởi paracetamol Trình bày quy tình thu hái và chiết xuất cao toàn phần lá cây lá đắng; nghiên cứu tác dụng điều trị tổn thương gan của cao toàn phần lá đắng trên chuột nhắt trắng gây độc bằng paracetamol; xác định chức năng gan; đánh giá đại thể gan
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
3.1.1 Nguyên liệu và động vật thử nghiệm
Cây Lá đắng được thu hái vào tháng 12 năm 2020 tại thành phố Biên Hoa, tỉnh Đồng Nai Cây được PGS TS Trương Thị Đẹp định danh với tên khoa học là
Vernonia amygdalina Delile thuộc họ Cúc (Asteraceae) Dược liệu được rửa sạch, tách lấy lá, phơi âm can và xay thành bột dược liệu thô Dược liệu được rây qua rây có đương kính mắt rây 2mm [11].
Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh thuộc chủng Swiss albino có trọng lượng 20-25 g được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột được nuôi ổn định 7 ngày tại phong thí nghiệm Dược lý, Khoa Dược trương Đại học Lạc Hồng trước khi tiến hành thử nghiệm Chuột được nuôi trong những bocal nhựa có nắp lưới inox được thiết kế đặc biệt cho phép chuột dễ dàng tiếp xúc với thức ăn và nước uống.
3.1.2 Hóa chất và thuốc thử
Nước muối sinh lý 0,9% (Việt Nam)
Dung môi chiết: cồn 70% (Việt Nam)
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Cân kỹ thuật Sartorius TE412, Đức
Cân phân tích Sartorius PRACTUM224-1S, Đức
Bể siêu âm Elma S180 H Elmasonic, Đức
Kim tiêm 1 ml/cc Vinahankook
Máy đo sinh hóa Clindiag SA-20 (Đức)
Máy ly tâm Mini centrifuge C1008-G (Việt Nam) dược liệu đã được làm ẩm vào bình ngấm kiệt, cho cồn 70% vào ngập 2-3 cm so với dược liệu, xa hết bọt khí, ngâm dược liệu trong 24 giơ và tiến hành rút dịch chiết 40-60 giọt/phút Tổng dịch chiết thu được sẽ đem cô đặc trên bếp cách thủy Sau đó, độ ẩm cao toàn phần được thực hiện theo phương pháp “Xác định mất khối lượng do làm khô” Phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam V [4].
Hình 3.1 Quy trình chiết cao toàn phần
3.2.2 Đánh giá mô hình gây độc tính trên gan chuột bằng paracetamol
3.2.2.1 Phương pháp gây tổn thương gan chuột bằng paracetamol
Chuột sau khi nuôi ổn định một tuần đạt khối lượng 20-25 g được lấy máu đuôi ly tâm thu huyết thanh xét nghiệm chỉ số AST, ALT ban đầu trước khi tiến hành thử nghiệm (ngày 0).
Vào ngày 1, những chuột có chỉ số AST và ALT bình thương sẽ được cho uống paracetamol liều 300 mg/kg để gây tăng men gan trong 14 ngày, thơi gian cho chuột uống vào 9h00 hằng ngày, điều kiện cho uống là 0,1 ml/10 g; đồng thơi, chọn ngẫu nhiên 8 con chuột làm lô sinh lý và cho uống nước cất.
Vào ngày thứ 15, lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột để đo AST và ALT Những chuột có chỉ số AST và ALT hoặc chỉ có ALT tăng 1,5 lần so với chỉ số AST và ALT ban đầu (ngày 0) sẽ được chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2.2 Thử nghiệm đánh giá tính kha dụng của mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol
Từ những chuột đã được chọn và lô sinh lý ban đầu, tiến hành chia thành các lô sau:
Lô sinh lý (n = 8): cho uống nước cất 14 ngày
Lô bệnh (n = 10): cho uống paracetamol 300 mg/kg trong 14 ngày
Lô silymarin (n = 6): cho uống paracetamol 300 mg/kg (9h00) và silymarin 70 mg/kg (15h00) trong 14 ngày.
Ngày 29, tiến hành hy sinh chuột bằng CO2, lấy máu tim ly tâm thu huyết thanh, định lượng aminotransferase (AST, ALT), creatinin và protein toàn phần; đồng thơi lấy gan chuột ở các lô thí nghiệm để xác định khối lượng và quan sát đại thể nhu mô gan.
3.2.3 Nghiên cứu tác dụng điều trị tổn thương gan của cao toàn phần Lá đắng trên mô hình gây độc gan chuột bằng paracetamol
Tiến hành gây tăng men gan bằng paracetamol liều 300 mg/kg trong 14 ngày và chọn lựa chuột như mục 3.2.2.1 Từ những chuột tăng men gan đã được chọn và lô sinh lý ban đầu sẽ được phân bổ vào các lô như sau:
Lô sinh lý (n = 8): cho uống nước cất 14 ngày
Lô bệnh (n = 10): cho uống paracetamol 300 mg/kg trong 14 ngày
Lô silymarin (n = 6): cho uống paracetamol 300 mg/kg (9h00) và silymarin 70 mg/kg (15h00) trong 14 ngày.
Lô Lá đắng (n = 7): uống paracetamol 300mg/kg (9h00) và uống cao toàn phần Lá đắng 2000 mg/kg (15h00) trong 14 ngày.
Ngày 29, tiến hành hy sinh chuột bằng CO2, lấy máu tim ly tâm thu huyết thanh,định lượng aminotransferase (AST, ALT), creatinin và protein toàn phần; đồng phần trong huyết thanh bằng hệ thống phân tích hóa sinh tự động AU680 (Beckman Coulter) như sau: Máu chuột được ly tâm ở tốc độ 10.000 vong/phút trong 10 phút để thu huyết thanh Kết qua phân tích các chỉ tiêu huyết thanh được đọc bằng máy xét nghiệm sinh hóa tự động AU680 của hãng Beckman Coulter.
L-Aspartat + α-ketoglutarat Oxalo acetat + L-glutamat
Oxalo acetat + NADH + H + L-Malat + NAD +
Mẫu thử: huyết thanh không tán huyết (trong suốt, có màu vàng nhạt).
Dung dịch thuốc thử đo AST:
‒ Thuốc thử 1 (R1): dung dịch đệm TRIS pH 7.8 (30°C) 80,00 mmol/L,
L-Aspartat 200,00 mmol/L, MDH ≥ 0,5 U/mL, LDH ≥ 1,6 U/mL.
‒ Thuốc thử 2 (R2): NADH 0,18 mmol/L, α-ketoglutarat 12 mmol/L.
Dung dịch thuốc thử đo ALT:
‒ Thuốc thử 1 (N1): LDH ≥ 1,7 U/mL, dung dịch đệm TRIS pH 7,5 (25 o C) 70,00 mmol/L, L-Alanin 410,00 mmol/L.
‒ Thuốc thử 2 (N2): NADH 0,30 mmol/L, α-ketoglutarat 18 mmol/L.
Pha hỗn hợp thuốc thử (chỉ với mẫu thử là huyết thanh): Trộn 5 thể tích thuốc thử 1 với 1 thể tích thuốc thử 2 và để ổn định trước khi sử dụng.
Cho vào ống nghiệm 500 àl thuốc thử và 50 àl huyết thanh, trộn đều để ủ 30 giây Đo sự thay đổi mật độ quang (∆OD) trong ít nhất 3 phút.
Nếu hoạt độ U/L vượt quá 280 ở 340 nm, và đương đồ thị hiện trên máy không tuyến tớnh, làm lại thớ nghiệm với huyết thanh pha loóng Pha loóng 20 àl mẫu huyết thanh với 200 àl dung dịch NaCl 0,9%, nhõn kết qua cho 11.
Chỉ số protein toàn phần được xác định bằng phương pháp đo màu dựa trên phản ứng Biuret:
Protein + Cu 2+ Phức hợp Cu-Protein
Cương độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein toàn phần có trong mẫu.
Mẫu thử: huyết thanh không tán huyết (trong suốt, có màu vàng nhạt hoặc trắng). Dung dịch thuốc thử: Kali iodua 15 mmol/L, kali sodium tartrat 100 mmol/L, sodium hydroxide 100 mmol/L, đồng sulfat 6 mmol/L.
Dung dịch protein chuẩn 4 g/dL.
Cho vào 3 ống nghiệm các thuốc thử sau:
Dung dịch chuẩn 4 g/dL (àl) - 20 -
Trộn đều, ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 25 °C-37 °C Đọc mật độ quang (OD) của ống chuẩn và ống thử so với ống trắng.
Chỉ số creatinin được xác định bằng phương pháp động học:
Trong môi trương kiềm, creatinin tạo với ion picrat một phức có màu vàng cam. Tốc độ tạo thành phức màu này tỉ lệ thuận với nồng độ creatinin trong mẫu đo.
Mẫu thử: huyết thanh không tán huyết (trong suốt, có màu vàng nhạt hoặc trắng). Thuốc thử:
‒ Thuốc thử A: Natri hydroxid 187,8 mmol/L, phosphat 7,5 mmol/L.
‒ Thuốc thử B: Acid picric 15,7 mmol/L.
Dung dịch creatinin chuẩn 2 mg/dL (176,8 àmol/L)
Pha thuốc thử: trộn 1 thể tích thuốc thử A với 1 thể tích thuốc thử B.
Cho vào ống nghiệm 500 àl thuốc thử và 75 àl huyết thanh, trộn đều, ủ trong 30 giây sau đó đọc mật độ quang OD1 của mẫu chuẩn và mẫu thử Sau 1 phút đọc tiếp mật độ quang OD2 của mẫu chuẩn và mẫu thử Tính ∆OD của từng mẫu.
�ℎ�ẩ�× �(mg/dL) Trong đó, n=2 là nồng độ mẫu chuẩn (2 mg/dL)
3.2.5 Đánh giá đại thể gan
Các mẫu gan được xác định khối lượng, chụp anh quan sát đại thể.
3.2.6 Phương pháp phân tích kết quả
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
BÀN LUẬN
Từ lâu, trong dân gian, ngươi dân sử dụng Lá đắng như một vị thuốc quen thuộc để hỗ trợ điều trị các bệnh khác nhau như đái tháo đương, tăng huyết áp, béo phì, đau lưng, mất ngủ, viêm da, mụn nhọt, trứng cá, Ở châu Phi, ngươi ta con sử dụng Lá đắng như một loại rau xanh ăn hằng ngày và dùng dịch chiết làm thuốc bổ Không chỉ từ thực tế, trên thế giới đã có nhiều thực nghiệm và nghiên cứu chứng minh các tác dụng dược lý của cây Lá đắng như tăng huyết áp, giam đau, kháng viêm, đái tháo đương type 2, nhưng con hạn chế về nghiên cứu tác dụng bao vệ gan gây tổn thương do paracetamol [23], [35], [37], [39] Bộ phận dùng lá chứa nhiều hợp chất và chất dinh dương hơn so với các bộ phận dùng con lại và có ưu điểm là vẫn đam bao cây phát triển, không cần phá hủy cây khi thu hái, mùa thu hái không bị hạn chế vào một số thơi điểm nhất định [34] Vì vậy, đề tài ưu tiên chọn bộ phận lá làm đối tượng nghiên cứu.
Paracetamol là thuốc hạ sốt, giam đau thông thương, được sử dụng phổ biến mà không cần kê đơn Ở liều điều trị thông thương, paracetamol không gây độc gan
Khối lượng chuột giữa các lô tại thơi điểm bắt đầu thử nghiệm đồng đều với nhau. Sau 4 tuần của thử nghiệm, khối lượng chuột ở các lô sinh lý, lô silymarin và lô Lá đắng đều có xu hướng tăng Ở lô bệnh, khối lượng chuột tăng sau 2 tuần đầu và giam sau 2 tuần tiếp theo Kết qua cho thấy paracetamol có anh hưởng đến sự tăng trưởng của chuột thí nghiệm sau bốn tuần.
Trong nghiên cứu này, lô bệnh và lô silymarin sử dụng paracetamol với liều 300 mg/kg đương uống trên chuột nhắt trắng trong 2 tuần đã làm tăng chỉ AST, ALT so với lô sinh lý Sau 4 tuần, chỉ số AST, ALT ở lô bệnh tiếp tục tăng so với lô sinh lý. Điều này chứng tỏ paracetamol đã gây tổn thương tế bào gan, làm giai phóng enzym vào máu Lô điều trị bằng silymarin làm giam chỉ số AST, ALT so với lô bệnh và không khác biệt so với lô sinh lý Như vậy, mô hình gây độc tính trên gan chuột bằng paracetamol được xây dựng thành công.
Trong nghiên cứu này, chọn liều Lá đắng giam 5 lần so với liều Dmax Dùng cao toàn phần Lá đắng liều 2000 mg/kg 2 tuần sau khi gây độc bằng paracetamol có tác dụng làm giam rõ rệt hoạt độ AST và ALT so với lô bệnh; tương đương với lô silymarin. Creatinin trong cơ thể có nguồn gốc ngoại sinh (do thức ăn cung cấp) và nội sinh (gan tổng hợp) Creatin bị thoái hóa trong các cơ thành creatinin, chất này được đưa trở lại tuần hoàn rồi được thai trừ qua thận và không được tái hấp thu Vì vậy, giá trị creatinin phan ánh chức năng thận [7] Trong nghiên cứu này, hàm lượng creatinin của lô bệnh, lô silymarin, lô Lá đắng đều thấp hơn so với lô sinh lý cho thấy chức năng thận bình thương Tuy nhiên, có thể có tình trạng suy dinh dương hoặc bệnh cơ do paracetamol làm tổn thương gan, từ đó gây anh hưởng đến hàm lượng creatinin huyết thanh.
Protein toàn phần trong máu bao gồm albumin và các globulin Protein toàn phần được tổng hợp ở gan [7] Do vậy, sự thay đổi hàm lượng protein toàn phần trong huyết thanh giúp đánh giá chức năng sinh lý của gan Trong nghiên cứu này, hàm lượng protein toàn phần của lô bệnh tăng so với lô sinh lý; hàm lượng protein toàn phần của lô silymarin giam so với lô bệnh và không khác biệt so với lô sinh lý; lô
Lá đắng có hàm lượng protein toàn phần tương đương lô silymarin Điều này chứng tỏ silymarin và cao toàn phần Lá đắng có tác dụng khôi phục chức năng tổng hợp protein toàn phần ở gan do paracetamol làm tổn thương.
Quan sát đại thể nhu mô gan cho thấy kết qua tương ứng với sự thay đổi enzym gan.
Lô sinh lý có nhu mô gan trơn, nhẵn, màu sáng, đỏ đều Ở lô bệnh, quan sát thấy gan phù nề, sung huyết, bề mặt gan không nhẵn, có nhiều chấm xuất huyết và một vài mang xơ so với lô sinh lý Lô silymarin và lô Lá đắng tương đương nhau, mức độ tổn thương gan giam rõ rệt so với lô bệnh, tuy nhiên vẫn con viêm gan ở mức độ nhẹ.
Tỷ lệ khối lượng gan/chuột ở lô sinh lý, lô bệnh và lô silymarin tương đương nhau và thấp hơn so với lô Lá đắng Do đó, paracetamol và silymarin không làm anh hưởng đến khối lượng gan chuột, cao toàn phần Lá đắng làm tăng khối lượng gan chuột. Như vậy, cao toàn phần Lá đắng liều 2000 mg/kg có tác dụng điều trị tổn thương gan gây bởi paracetamol Kết qua cho thấy cao toàn phần Lá đắng liều 2000 mg/kg có hiệu qua hạ men gan tương đương silymarin liều 70 mg/kg - thuốc đối chứng thương dùng trong nghiên cứu về gan Tuy nhiên, hiệu qua làm giam men gan vẫn chưa đạt được đến chỉ số men gan sinh lý.
Từ những kết qua nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng sử dụng Lá đắng với mục đích điều trị tổn thương gan Cây tương đối an toàn và có hiệu qua hạ men gan tương đương với thuốc điều trị men gan phổ biến trên thị trương Từ đó, mở ra hướng nghiên cứu mới san xuất ra các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu phù hợp với nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe của ngươi dân.
27,34 %) bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70%
‒ Đánh giá lại mô hình gây tổn thương gan chuột bằng paracetamol liều 300 mg/kg trong 2 tuần và điều trị bằng silymarin liều 70 mg/kg có hiệu qua
‒ Nghiên cứu tác dụng điều trị tổn thương gan trên chuột nhắt trắng gây độc bởi paracetamol cho thấy ở liều 2000 mg/kg cao toàn phần Lá đắng có tác động phục hồi tổn thương gan tương đương với silymarin liều 70 mg/kg khi so sánh ở các chỉ số AST, ALT, protein toàn phần và đại thể nhu mô gan.
Do thơi gian nghiên cứu có hạn, cùng với các điều kiện chưa thuận lợi nên một số nội dung không thể thực hiện như: không đủ hóa chất, thiết bị, máy móc, tình hình dịch COVID phức tạp không thể mua thêm chuột, Vì vậy, hy vọng đề tài có thể tiếp tục với các hướng sau:
‒ Nghiên cứu tác động điều trị viêm gan của cao toàn phần Lá đắng bằng mô hình viêm gan cấp tính, ở mức liều thấp hơn và làm thêm các nội dung như: tiêu ban mô bệnh học, nồng độ MDA (malonyl dialdehyd), nồng độ LDH và bilirubin để đánh giá cấu trúc vi thể gan, mức độ tổn thương gan và tổn thương ở những cơ quan khác
‒ Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao toàn phần Lá đắng trên mô hình cấp vàmạn tính
‒ Khảo sát tác động bảo vệ và điều trị tổn thương gan của các cao phân đoạn Lá đắng
‒ Nghiên cứu hoạt tính dược lý khác của cao toàn phần và cao phân đoạn Lá đắng nhưhạ đường huyết, hạ lipid huyết, kháng khuẩn, kháng kísinh trùng,
[1] Bộ môn Mô phôi, trương Đại học Y Hà Nội (2004), Mô học, Nhà xuất ban Y học, Hà Nội, tr.429-441.
[2] Bộ môn sinh lý, Trương đại học Y Hà Nội (2011),Sinh lý bệnh- miễn dịch, nhà xuất ban Y học, Hà Nội, tr.212-225.
[3] Bộ môn sinh lý học – Trương Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh (2008),
Sinh lí học Y khoa,Nhà xuất ban Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.335-340.
[4] Bộ Y tế (2018),Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất ban Y học , Hà Nội.
[5] Đào Văn Phan (2012),Các thuốc giảm đau chống viêm, Nhà xuất ban Y học,
[6] Hồ Thị Thúy Linh (2016), Khảo sát thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa từ cây Lá đắng Vernonia amygdalina Delile, Luận văn thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh.
[7] Nguyễn Đạt Anh, khoa cấp cứu Bạch Mai (2013), Các xét nghiệm thường quy ứng dụng trong thực hành lâm sàng, nhà xuất ban y học, Hà Nội, tr 96-101.
[8] Phạm Thị Ngọc Anh, Trần Ngọc Kim Cương, Đoàn Văn Viên, Ngô Văn Cương (2020), “Khao sát tác động giam đau và kháng viêm của cây lá đắng (vernonia amygdalina del.) trên chuột nhắt trắng”, Tạp chí Khoa học Lạc Hồng, 9, 024-028.
[9].Phí Thị Cẩm Miện, Trần Văn Thái , Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hương, Đỗ Thị Thao (2017), “Đánh giá tác dụng bao vệ gan của dịch chiết chùm ngây (moringa oleifera) trên chuột gây tổn thương gan bằng carbon tetrachloride (CCl4)”,Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam,15(2), 225-233
[10] Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh, bệnh viện bình dân (2017),Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị,tập 3, tr.79. tr.180-191.