Tổng hợp và khảo sát tác động kháng viêm một số dẫn xuất flavonoid

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ðẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM TRUNG TÂM KH & CN DƯỢC SÀI GÒN BÁO CÁO NGHIỆM THU TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT TÁC ðỘNG KHÁNG VIÊM MỘT SỐ DẪN XUẤT FLAVONOID (Quyển 2) TRẦN THÀNH ðẠO VÕ PHÙNG NGUN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2010 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Flavonoid ñược quan tâm nghiên cứu nhờ phân bố rộng rãi chúng tự nhiên nhờ hoạt tính sinh học phong phú chúng Các chất flavonoid hữu ích điều trị tính q mẫn trường hợp hen suyễn, chất bảo vệ hệ tim mạch tốt ñiều trị ung thư doxorubicin tác nhân ức chế steroid sulfatase ñể ñiều trị nhiều bệnh bao gồm ung thư vú, bệnh viêm Flavonoid, ñặc biệt dẫn chất flavon sẵn có tự nhiên có chứa nhóm hydroxyl tự vị trí 5, vịng A, ví dụ wogonin, baicalein, chrysin…được chứng minh chất kháng viêm tốt từ nhiều năm qua Sự quan tâm trở lại ñối với tác dụng kháng viêm flavonoid chất thể ñược tác ñộng ñiều hòa tổng hợp prostaglandin thể, ức chế sinh gốc tự gây viêm NO, tạo bền vững tế bào mast ñể ngăn chặn phóng thích histamine tiền chất gây viêm, ức chế tạo thành leucotrien gây viêm,… Với mục tiêu phát dẫn chất flavon tổng hợp tìm hiểu ảnh hưởng nhóm chức OH phenol tự vị trí vịng A tác dụng kháng viêm flavon, số nhóm dẫn chất flavon khơng mang nhóm chứa oxygen vị trí 7, mang nhóm oxygen vị trí 5, nhóm flavon mang nhóm oxygen vị trí nhóm flavon mang nhóm oxygen tổng hợp xác định hoạt tính kháng viêm in vitro in vivo I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Synthesis and Anti-inflammatory Activities of some Flavonoids and Related Compounds as Anti-inflammatory Agents Flavonoids are of considerable interest because of their widespread occurrence in nature as well as their profound biological activities They are useful as antianaphylactic agents for the treatment of asthma, as potential cardio protective agents in doxorubicin anti-tumor therapy or as steroid sulfatase inhibitors for the possible treatment of a number of diseases including breast cancer as well as inflammatory diseases Flavonoids, especially naturally occurring flavones possessing phenol groups at 5- and 7-position of A-ring, for example, wogonin, baicalein, chrysin…have been known to possess anti-inflammatory activity for four decades Interest in the antiinflammatory activities of flavonoids has recently revived when many of these compounds were found to modulate prostaglandin synthase synthesis As an attempt to discover novel synthetic flavones as well as to identify the effects of phenol groups at 5- and/or 7-position of A-ring on anti-inflammatory activity, flavone derivatives with serial deletion and methylation of the phenol groups on the A-ring and/or substitution of the B-ring were synthesized and evaluated their antiinflammatory actives both in vitro and in vivo tests II MỤC LỤC Trang I PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ lược phản ứng viêm 1 Giới thiệu sơ lược flavonoid 4 Giới thiệu sơ lược chalcon Giới thiệu sơ lược flavon 10 II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 1.1 1.2 Nội dung 1: Tổng hợp chalcon Phản ứng ngưng tụ Claisen Schmidt tổng hợp chalcon Phương pháp xác ñịnh cấu trúc chalcon tổng hợp 13 13 15 1.3 1.4 Yêu cầu sản phẩm chalcon tổng hợp Kết tổng hợp chalcon 16 17 1.4.1 Tổng hợp chalcon vịng A khơng 1.4.2 Tổng hợp chalcon vịng A nhóm chứa nitơ 17 18 1.4.3 Tổng hợp pyridinylchalcon (vòng A nhân dị vòng pyridin) 19 1.4.4 Tổng hợp furanylchalcon (vòng A nhân dị vòng furan) 1.4.5 Tổng hợp 2’-hydroxychalcon 20 21 1.4.6 Tổng hợp 2’-hydroxy-4’-methoxychalcon 1.4.7 Tổng hợp 2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcon 22 23 1.5 Kết phân tính tính chất lý hóa chalcon tổng hợp 24 2.1 2.2 Nội dung 2: Tổng hợp flavon Nguyên liệu tổng hợp Phản ứng tổng hợp flavon 42 42 42 2.2.1 Phản ứng oxi hóa đóng vịng chalcon 42 2.2.2 Phản ứng khử hóa alkoxyflavon điều chế hydroxyflavon 2.2.3 Phản ứng vị trí C6 C8 chrysin (5,7-dihydroxyflavon) 43 43 2.2.4 Phản ứng alkyl hóa OH phenol chrysin rutin 2.2.5 Phản ứng ester hóa OH phenol chrysin rutin 44 44 2.3 Kết tổng hợp flavon 2.3.1 Tổng hợp dẫn chất flavon vòng A khơng nhóm 45 47 2.3.2 Tổng hợp dẫn chất 7-methoxyflavon 2.3.3 Tổng hợp dẫn chất 5,7-dimethoxyflavon 47 48 2.3.4 Tổng hợp dẫn chất chrysin 49 2.3.5 Tổng hợp dẫn chất rutin 49 III 2.4 2.5 Phương pháp xác ñịnh cấu trúc flavon tổng hợp Kết phân tích tính chất lý hóa flavon tổng hợp 50 53 3.1 Nội dung 3: Khảo sát tác ñộng kháng viêm in vitro ðối tượng nghiên cứu 68 68 3.2 Phương pháp khảo sát tác ñộng kháng viêm in vivo 70 3.3 Kết khảo sát tác ñộng kháng viêm in vitro 73 4.1 4.2 Nội dung 4: Khảo sát tác ñộng kháng viêm in vivo ðối tượng nghiên cứu Phương pháp khảo sát tác ñộng kháng viêm in vivo 75 76 77 4.3 4.4 Kết tác ñộng kháng viêm in vivo dạng cream 5% Kết tác ñộng kháng viêm in vivo dạng cream 2,5% 80 88 Nội dung 5: So sánh tác ñộng kháng viêm flavonoid với ketoprofen ibuprofen ðối tượng khảo sát 101 5.2 Kết tác ñộng kháng viêm dạng cream 2,5% mẫu thử với ketoprofen ibuprofen 101 5.3 Biểu ñồ so sánh tác ñộng kháng viêm chất CH32, CH35, CH49, FL2 FL3 với ketoprofen, ibuprofen 104 III KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ Kết luận 108 108 PL1 ðề nghị Phụ lục 1: Thực nghiệm tổng hợp 109 PL1-1 PL.2 Phụ lục 2: Danh mục % PGE2 chất thu thập từ tài liệu PL2-1 PL.3 PL.4 PL.5 Phụ lục 3: Biểu ñồ so sánh tác dụng kháng viêm chất thử Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR Phụ lục 5: Phổ IR PL3-1 PL4-1 PL5-1 5.1 IV 101 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT AChE COX-1 COX-2 CH1…CH50 CH1-1 … CH50-1 CH1-2 … CH50-2 DMSO FL1… FL50 FL1-1 … FL50-1 FL1-1 … FL50-1 MeOH DDQ DBU IC50 IL-6 IR Spectra LOX -OMOM PLA2 NMR NSAIDs iNO synthase PEG2 SAR TNF-α UV THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT acetyl cholineseterase cyclooxygenase-1, enzyme cyclooxygenase týp cyclooxygenase-2, enzyme cyclooxygenase týp mã số dẫn chất chalcon tổng hợp mã số lô thử nghiệm chalcon lần nồng độ 5% mã số lơ thử nghiệm chalcon lần nồng ñộ 2,5% dimethylsulfoxid mã số dẫn chất flavon tổng hợp mã số lô thử nghiệm flavon lần nồng độ 5% mã số lơ thử nghiệm flavon lần nồng ñộ 2,5% methanol 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinon 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en inhibitory concentration, nồng ñộ ức chế 50% interleukin-6 (cytokin tiền viêm) infrared spectra = phổ hồng ngoại lypooxygenase methoxymethoxy phospholipases A2 Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) non steroidal anti-inflammatory drugs, thuốc kháng viêm không steroid inducible nitric oxide synthase, enzyme cảm ứng tạo NO prostaglandin E2 structure - activity relationships (liên quan cấu trúc tác dụng) tumor necrosis factor-alpha, yếu tố kích hoạt phản ứng viêm cấp ultra violet = tử ngoại V DANH SÁCH SƠ ðỒ SỐ TÊN SƠ ðỒ TRANG Phản ứng ngưng tụ Claisen Schmidt dùng tổng hợp chalcon 14 Tổng hợp chalcon vịng A khơng 17 Tổng hợp chalcon với vịng A mang nhóm chứa nitơ 18 Tổng hợp pyridinylchalcon (vòng A dị vòng pyridin) 19 Tổng hợp furanylchalcon (vòng A dị vòng furan) 20 Tổng hợp dẫn chất 2’-hydroxychalcon 21 Tổng hợp dẫn chất 2’-hydroxy-4’-methoxychalcon 22 Tổng hợp dẫn chất 2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcon 23 Phản ứng oxi hóa đóng vòng chalcon tạo thành flavon 42 10 Phản ứng khử hóa benzyloxychalcon tổng hợp hydroxyflavon 43 11 Phản ứng khử hóa methoxyflavon dùng tổng hợp hydroxyflavon 43 12 Phản ứng tổng hợp dẫn chất chrysin (5,7-dihydroxyflavon) 45 13 Phản ứng tổng hợp dẫn chất rutin 46 VI DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TR ðiều kiện hiệu suất tổng hợp chalcon vòng A khơng mang nhóm ðiều kiện hiệu suất tổng hợp chalcon vịng A mang nhóm chứa niơ ðiều kiện hiệu suất tổng hợp pyrydinylchalcon (vòng A dị vòng pyridin) ðiều kiện hiệu suất tổng hợp furanylchalcon (vòng A dị vòng furan) ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất 2’-hydroxychalcon ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất 2’-hydroxy-4’-methoxychalcon ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất 2’-hydroxy-4’,6’-dimethoxychalcon ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất flavon vịng A khơgn ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất 7-methoxyflavon ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất 5,7-dimethoxyflavon ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất chrysin ðiều kiện hiệu suất tổng hợp dẫn chất rutin Danh mục dẫn chất chalcon khảo sát % ức chế PGE2 Danh mục dẫn chất flavon khảo sát % ức chế PGE2 Kết % ức chế tạo thành PGE2 dẫn chất chalcon tổng hợp Kết % ức chế tạo thành PGE2 dẫn chất flavon tổng hợp Danh mục dẫn chất chalcon thử nghiệm kháng viêm in vivo nồng ñộ 5% Danh mục flavon thử nghiệm kháng viêm in vivo nồng ñộ 5% ðộ phù chân chuột (%) trình thử nghiệm gây viêm dung dịch carageenin 1% cho sử dụng tá dược, cream chất thử 5%, cream ketoprofen 2,5% ñể ñiều trị ðộ phù chân chuột (%) trình thử nghiệm gây viêm dung dịch carageenin 1% cho sử dụng tá dược, cream chất thử 5% cream ketoprofen 2,5% ñể ñiều trị ðộ phù chân chuột (%) trình thử nghiệm gây viêm dung dịch carageenin 1% ñiều trị với tá dược, cream chất thử 5% cream ketoprofen 2,5% ñể ñiều trị ðộ phù chân chuột (%) trình thử nghiệm gây viêm dung dịch carageenin 1% cho sử dụng tá dược, kem chất thử CHALCON 2,5%, cream ketoprofen 2,5% ñể ñiều trị ðộ phù chân chuột (%) trình thử nghiệm gây viêm dung dịch carageenin 1% cho sử dụng tá dược, kem chất thử dẫn chất FLAVON 2,5%, kem ketoprofen 2,5% ñể ñiều trị ðộ phù chân chuột (%) trình thử nghiệm gây viêm dung dịch carageenin 1% cho sử dụng tá dược, kem chất thử dẫn chất FLAVON 2,5%, kem ketoprofen 2,5% ñể ñiều trị 17 19 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 19 20 21 22 23 44 45 45 46 46 65 66 70 71 75 76 81 85 87 97 25 Tên ký hiệu lô thử chất dùng khảo sát tác ñộng kháng viêm so sánh với ketoprofen ibuprofen nồng ñộ 2,5% 101 26 ðộ phù chân chuột (%) lô C1-C3, F1-F2 qua thời điểm khảo sát 103 VII DANH SÁCH HÌNH SỐ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 TÊN HÌNH ẢNH Sinh tổng hợp prostaglandin thuốc ức chế Vai trò enzym COX-1 COX-2 Khung diphenyl propan (C6-C3-C6) dẫn chất flavonoids Khung chalcon Khung benzo- γ-pyron flavon Mô tả ñộ phù chân chuột gây viêm (A) ñược ñiều trị (B) Máy ño ñộ phù chân chuột ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô CH32-2 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ CH33-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô CH35-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô CH42-2 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ CH45-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô CH46-2 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ CH47-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô CH48-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL2-2 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL3-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL6-2 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL36-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL38-2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô thử nghiệm C1 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô thử nghiệm C2 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ thử nghiệm C3 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô thử nghiệm C1, C2, C3 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô thử nghiệm F1 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ thử nghiệm F2 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô thử nghiệm F1, F2 VIII TR 10 77 78 91 91 92 92 93 93 94 94 98 98 99 99 100 104 104 105 105 106 106 107 THÔNG TIN CHUNG Tên ñề tài: “Tổng hợp khảo sát tác ñộng kháng viêm số dẫn xuất flavonoid” Chủ nhiệm ñề tài: PGS.TS Trần Thành ðạo PGS.TS Võ Phùng Ngun Cơ quan chủ trì: Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Dược Sài gòn (Sapharcen) Khoa Dược, ðại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 41 ðinh Tiên Hồng, Q.1, Thành phố Hồ Chí Minh ðiện thoại: (08) 8295696 Fax: (08) 8225435 E-mail: lequannghiem@saigonnet.vn Thời gian thực ñề tài: Tháng 11 năm 2008 ñến tháng 11 năm 2009 ðã ñược gia hạn ñến tháng 10 năm 2010 (Phụ lục hợp đồng, ngày 03/02 năm 2010) Kinh phí duyệt: 400.000.000,0 ð (Bốn trăm triệu ñồng) Mục tiêu: Tổng hợp số flavonoid (gồm nhóm chalcon flavon) ña dạng cấu trúc, tạo thư viện mẫu flavonoid tổng hợp dùng sàng lọc chất có tác dụng kháng viêm tốt, để phát triển thành thuốc kháng viêm Nội dung: (Theo ñề cương ñã duyệt) Tổng hợp xác ñịnh cấu trúc, ñộ tinh khiết flavonoid tổng hợp * 50 dẫn xuất chalcon * 50 dẫn chất flavon Nghiên cứu tác ñộng kháng viêm in vitro mơ hình tế bào RAW 264.7 * Khảo sát 40 dẫn chất chalcon * Khảo sát 40 dẫn chất flavon IX 1.6.4 ðiều chế 5,7-dimethoxyflavon (FL30) Trong bình cầu đáy trịn dung tích (100 ml) cho vào g chrysin 40 ml aceton Hỗn hợp ñặt vào phận cách thuỷ 60 0C máy khuấy từ gắn sinh hàn hồi lưu 30 phút Thêm vào hỗn hợp 2,6 ml (CH3)2SO4 2,2 g K2CO3, phản ứng giờ, theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng dung mơi khai triển CHCl3: MeOH (20:1) Sau để nguội nhiệt độ phịng, dung dịch sau phản ứng lọc, dịch lọc đem cách thuỷ, để nguội, làm lạnh sản phẩm kết tinh màu vàng, lọc lấy tủa Kết tinh aceton 2-3 lần thu sản phẩm kết tinh, sấy 60 0C 1.7 ðiều chế dẫn chất chrysin nhóm vịng A (C6 C8) 1.7.1 ðiều chế 6,8-dibromo-5,7-dihydroxyflavon (6,8-dibromochrysin) FL39 Cho g chrysin vào bình cầu đáy trịn dung tích 100 ml, thêm 50 ml aceton 10 ml nước ðặt hỗn hợp máy khuấy từ, gắn sinh hàn hồi lưu khuấy 15 phút nhiệt độ phịng Thêm từ từ vào hỗn hợp g KBr 12 g oxon (tỉ lệ mol chrysin : KBr : oxon khoảng : 2,5 : 2,5) Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng (TLC: thin layer chromatography) với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (20 : 1) Hỗn hợp sau phản ứng ñược thêm vào 20 ml dung dịch NaHCO3 bão hịa để loại màu brom thừa sinh Làm bay dung môi áp suất giảm, sau lọc rửa tủa nước lạnh Tủa ñược sấy 60 0C tinh chế sắc ký cột nhanh, dùng silicagel với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (20 : 1) PL1- 1.7.2 ðiều chế 6,8-iodo-5,7-dihydroxyflavon (6,8-diiodochrysin) FL40 Tiến hành tương tự FL39, dùng NaI thay cho KBr 1.7.3 ðiều chế 6,8-dimethylthio-5,7-dihydroxyflavon (FL41) Trong bình cầu đáy trịn dung tích (100 ml) thêm 3,34 g FeCl3 (20 mmol) 10 ml dimethyl disulfid (DMDS) vào hỗn hợp 2,04 g chrysin (8 mmol) 40 ml toluen Hỗn hợp ñặt vào phận cách dầu ñặt máy khuấy từ, gắn sinh hàn hồi lưu ñun khoảng 14 105 0C, theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng Sau để nguội đến nhiệt độ phịng, dung dịch sau phản ứng cho vào khoảng 20 ml HCl 10% tiếp tục khuấy nhiệt độ phịng Hỗn hợp sau phản ứng lắc với dicloromethan lần lần 15 ml sau bốc dung mơi Sản phẩm kết tinh lại methanol Sấy 60 0C 1.7.4 ðiều chế 8-nitro-5, 7-dihydroxyflavon (FL42) Trong bình cầu đáy trịn dung tích (100 ml) cho vào g chrysin 40 ml acid acetic băng Hỗn hợp ñặt vào phận cách thuỷ 60 0C máy khuấy từ gắn sinh hàn hồi lưu 30 phút Thêm từ từ vào hỗn hợp 6ml HNO3 ñậm ñặc tiếp tục khuấy giờ, theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng dung môi khai triển CHCl3: MeOH (20:1) Sau để nguội nhiệt độ phịng, dung dịch sau phản ứng thêm nước sản phẩm tủa, lọc lấy tủa Tủa ñược kết tinh lại MeOH, sấy 60 0C thu ñược 1,2 g sản phẩm hiệu suất 60% PL1- 1.8 ðiều chế flavon dẫn xuất từ rutin 1.8.1 ðiều chế 3-hydroxy-3’,4’,5,7-tetramethoxyflavon (FL46) OCH3 OH HO O OH O-Rutinose OH O 1) (CH3)2SO4, K2CO H3CO O OCH3 OH 2) HCl H3CO O Cho g rutin vào bình cầu đáy trịn dung tích 250 ml, thêm 100 ml aceton Thêm tiếp vào bình g K2CO3, 2,5 ml (CH3)2SO4 (tỉ lệ mol khoảng gấp lần rutin) ðun hồi lưu theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (5 : 1) Hỗn hợp sau phản ứng ñược làm lạnh lọc Lấy dịch lọc, bay dung môi áp suất giảm, sau ñó thêm vào 70 ml ethanol ml HCl ñậm ñặc (cho từ từ nhiệt ñộ lạnh) ðun hồi lưu hỗn hợp 70 0C Làm nguội, lọc rửa tủa nước lạnh Tủa ñược sấy 60 0C thu ñược 1,1 g sản phẩm, hiệu suất 63% 1.8.2 ðiều chế 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavon (FL47) Cho 50 g rutin vào bình cầu dung tích 1000 ml, thêm 500 ml acid hydrocloric 1N ðặt hỗn hợp máy khuấy từ, gắn sinh hàn hồi lưu ñun 90 0C Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (5 : 1) Hỗn hợp sau phản ứng ñược ñể nguội Lọc rửa tủa nước cất ñến pH khoảng 6,5 Kết tinh lại sản phẩm ethanol – nước sấy sản phẩm 60 0C thu ñược 21g sản phẩm, hiệu suất 85% PL1- 1.8.3 ðiều chế 3,3’,4’,5,7-pentamethoxyflavon (FL48) Cho g quercetin vào bình cầu đáy trịn dung tích 100 ml 50 ml aceton Thêm tiếp vào bình 10 g K2CO3, ml (CH3)2SO4 (tỉ lệ mol khoảng gấp lần quercetin) ðun hồi lưu theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (5:1) Hỗn hợp sau phản ứng ñược làm bay dung môi áp suất giảm, lọc rửa tủa nước lạnh Kết tinh methanol Sấy 60 0C 1.8.4 ðiều chế 3,3’,4’,7-tetraacethoxy-5-hydroxyflavon (FL49) OAc OH HO AcO O OH OH OH O O OAc anhydrid acetic H2SO4 OAc OH O Cho vào bình cầu đáy trịn dung tích 250 ml, g quercetin 150 ml anhydrid acetic Làm lạnh hỗn hợp phản ứng cho vào từ từ vài giọt acid sulfuric ñậm ñặc, màu phản ứng chuyển từ vàng nhạt sang vàng cam Hỗn hợp ñược tiếp tục ñun cách thủy 90 0C máy khuấy từ Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3 : MeOH (5 : 1) ðể nguội hỗn hợp phản ứng sau lọc rửa tủa nước lạnh Kết tinh methanol Sấy sản phẩm 60 0C 1.8.5 ðiều chế 3,3’,4’,7-tetramethoxy-5-hydroxyflavon (FL50) Cho vào bình cầu đáy trịn dung tích 2500 ml, g quercetin 200 ml aceton Thêm tiếp vào bình 10 g K2CO3 khan 2,4 ml dimethyl sulfat ðun hồi lưu theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng sau giờ, dùng hệ dung môi cloroform-methanol PL1- (50-1) ñể triển khai sắc ký Hỗn hợp phản ứng bay áp suất giảm, lọc thu tủa Kết tinh 2-3 lần methanol Sấy sản phẩm 60 0C PL1- 10 PHỤ LỤC Bảng PL2-1 Danh mục dẫn chất CHALCON có giá trị % ức chế PGE2 > 60% thu thập từ tài liệu tham khảo khơng có danh mục thử % ức chế PGE2 (nội dung 3) STT 10 Chalcon tổng hợp 2’-hydroxy-2,3,4’-trimethoxychalcon* 2’-hydroxy-3,4,4’-tetramethoxychalcon* 2’-hydroxy-4,4’-dimethoxychalcon* 2’-hydroxy-2-cloro-4-methoxychalcon* 2’-hydroxy-3,4,5,4’,6’-pentamethoxychalcon* 2’-hydroxy-2,4,5 ,4’,6’-pentamethoxychalcon* 2’-hydroxy-2,5,4’,6’-tetramethoxychalcon* 2’-hydroxy -2,3,4’,6’-tetramethoxychalcon* 2’-hydroxy -3,4 ,4’,6’-tetramethoxychalcon* 2’-hydroxy -2,4,4’,6’-tetramethoxychalcon* Ký hiệu chất CH41 CH42 CH43 CH44 CH45 CH46 CH47 CH48 CH49 CH50 % Ức chế PGE2 99,45 97,23 78,65 89,93 99,12 94,67 89,56 86,54 102,45 91,35 * dẫn chất chalcon có giá trị % ức chế PGE2 > 60% ñã khảo sát trước tác giả TT ðạo [31], [32], [33] a nồng độ thử nghiệm: 10µM Bảng PL2-2 Danh mục dẫn chất FLAVON có giá trị % ức chế PGE2 > 60% thu thập từ tài liệu tham khảo khơng có danh mục thử % ức chế PGE2 (nội dung 3) STT 10 Chalcon tổng hợp 2’,3’-dimethoxyflavon* 3’,4’-dimethoxyflavon* 2’,4’-dimethoxyflavon* 4’-methylthioflavon* 3’,4’,5’,7-tetrahydroxyflavon* 2’,3’,5,7-tetramethoxyflavon* 2’,5’,5,7-tetramethoxyflavon* 2’,3’,4’, 5,7-pentamethoxyflavon* 3’,4’,5,5’,7-pentamethoxyflavon* 3’-benzyloxy-4’,5,7-trimethoxyflavon* Ký hiệu chất FL2 FL3 FL4 FL6 FL19 FL31 FL33 FL35 FL36 FL37 % Ức chế PGE2a 79,87 89,15 98,56 76,25 97,65 87,78 89,72 91,51 94,56 101,45 * dẫn chất chalcon có giá trị % ức chế PGE2 > 60% khảo sát trước tác giả TT ðạo [31], [32], [33] a nồng độ thử nghiệm: 10µM PL2-1 PHỤ LỤC III Biểu ñồ minh họa tác ñộng kháng viêm chất thử nghiệm (cream 5% 2,5%) khơng có tác ñộng tác ñộng yếu so với ketoprofen 2,5% Độ phù chân chuột (%) 100 Trắng Chứng KC FL1-1 80 60 * # 40 # * * 20 # * ** *** Sau ngày ngaøy ngaøy ngaøy ngaøy ngaøy Thời điểm khảo sát Hình 28 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL1-1: dẫn chất FL1 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm chậm yếu so với ketoprofen (cream 2,5%) Hình 29 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL4-1: dẫn chất FL4 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 30 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL5-1: dẫn chất FL5 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) Độ phù chân chuột (%) 100 Trắng Chứng KC FL7-1 80 # 60 # * *# # 40 * **# * 20 **# * ** *** Sau ngày ngày Thời điểm khảo sát Hình 31 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL7-1: dẫn chất FL7 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 32 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL10-1: dẫn chất FL10 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) Hình 33 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL11-1: dẫn chất FL11 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm chậm, không ổn ñịnh yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 34 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lơ FL12-1: dẫn chất FL12 (cream 5%) cho tác động kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) Hình 35 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL13-1: dẫn chất FL13 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 36 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL14-1: dẫn chất FL14 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm chậm yếu so với ketoprofen (2,5%) Hình 37 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lơ FL15-1: dẫn chất FL15 (cream 5%) cho tác động kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 38 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL16-1: dẫn chất FL16 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) Hình 39 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL19-1: dẫn chất FL19 (cream 5%) cho tác động kháng viêm khơng ổn ñịnh yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 40 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL20-1: dẫn chất FL20 (cream 5%) cho tác động kháng viêm khơng ổn định yếu so với ketoprofen (2,5%) Hình 41 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lơ FL21-1: dẫn chất FL21 (cream 5%) cho tác động kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 42 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô FL31-1: dẫn chất FL31 (cream 5%) cho tác động kháng viêm khơng ổn định yếu so với ketoprofen (2,5%) Hình 43 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lơ FL32-1: dẫn chất FL32 (cream 5%) cho tác động kháng viêm khơng ổn định yếu so với ketoprofen (2,5%) PL3- Hình 44 ðộ phù chân chuột (%) thời điểm khảo sát lơ FL33-1: dẫn chất FL33 (cream 5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (2,5%) 90 trắng chứng ketoprofen CH48-2 Độ phù chân chuột (%) 80 70 60 50 40 ** ** *** ** *** *** 30 ** * * *** 20 *** 10 sau 3h ngaøy ngaøy ngaøy ngaøy ngaøy *** ngaøy Hình 45 ðộ phù chân chuột (%) thời ñiểm khảo sát lô CH48-2: dẫn chất CH48 (cream 2,5%) cho tác ñộng kháng viêm yếu so với ketoprofen (cream 2,5 %) PL3-