BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY LAN MỘT LÁ NERVILIA ARAGOANA Ngành CÔNG NGHỆ SINH[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ CÂY LAN MỘT LÁ NERVILIA ARAGOANA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần Thị Ngọc Mai Sinh viên thực : Trịnh Kim Thảo MSSV: 1311100686 Lớp: 13DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan cơng trình nghiên cứu em Các số liệu kết nêu đồ án thật chƣa có cơng bố cơng trình khác TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Trịnh Kim Thảo Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Ngọc Mai – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM, ngƣời tận tình dìu dắt, hƣớng dẫn bảo em suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Mai Đình Trị - Trƣởng phịng Hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, ngƣời trực tiếp quản lí, giúp đỡ em suốt q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp em xin cảm ơn đến anh chị cơng tác đơn vị nhiệt tình bảo để em hồn thành tốt đồ án nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ TPHCM nhƣ nhà trƣờng tạo điều kiện tốt cho em đƣợc học tập nghiên cứu để hồn thành đồ án Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Phƣơng Vy, ngƣời hỗ trợ cho em nhiều kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đồ án Xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, anh chị nghiên cứu phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Cơng nghệ TPHCM tận tình hỗ trợ, giúp đỡ vƣợt qua khó khăn để hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn ngƣời thân yêu gia đình dành cho tơi quan tâm, chia sẻ, động viên, khích lệ suốt thời gian học tập nghiên cứu để tơi hồn thành đồ án Do thời gian thực có hạn, kiến thức cịn nhiều hạn chế nên đồ án thực chắn không tránh khỏi sai sót định Em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy để em có thêm kinh nghiệm tiếp tục hoàn thiện đồ án tốt nghiệp TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Trịnh Kim Thảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề .1 Tình hình nghiên cứu nƣớc .2 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu 5.2 Phạm vi nghiên cứu .3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .5 1.1 Tổng quan Lan (Nervilia aragoana) 1.1.1 Phân loại khoa học phân bố 1.1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.1.2 Phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Giá trị dƣợc liệu 1.1.5 Các nghiên cứu giới Lan (Nervilia aragoana) 11 1.2 Tổng quan phƣơng pháp chiết xuất 12 1.2.1 Các trình xảy chiết xuất .12 1.2.1.1 Sự hòa tan 13 1.2.1.2 Sự khuếch tán 13 1.2.1.3 Quá trình thẩm tích 14 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết xuất 15 1.2.2.1 Nguyên liệu 15 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2.2 Dung môi .16 1.2.2.3 Kỹ thuật chiết 17 1.2.3 Các phƣơng pháp chiết .18 1.2.3.1 Phƣơng pháp ngâm 18 1.2.3.2 Chiết phƣơng pháp ngấm kiệt 20 1.2.3.3 Các phƣơng pháp chiết khác 21 1.3 Tổng quan hoạt tính kháng oxy hóa .21 1.3.1 Giới thiệu chung .21 1.3.1.1 Khái niệm stress oxy hóa 21 1.3.1.2 Sự hình thành gốc tự oxy thể 22 1.3.1.3 Sự phòng vệ thể chống lại gốc tự 24 1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa 26 1.3.2.1 Flavonoid .26 1.3.2.2 Terpenoid 28 1.1.3 Các phƣơng pháp xác định tác dụng chống oxi hóa 29 1.1.3.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA 29 1.1.3.2 Các phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 30 1.4 Tổng quan hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 32 1.4.1 Khái niệm chung 32 1.4.2 Cơ chế đối kháng 33 1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thƣờng gặp .33 1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) 33 1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) .34 1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus 36 1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium 37 1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 38 1.4.4 Các phƣơng pháp thử hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm in vitro 40 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 42 ii Đồ án tốt nghiệp 2.1.1 Thời gian nghiên cứu .42 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 42 2.2 Vật liệu nghiên cứu .42 2.2.1 Nguồn mẫu .42 2.2.2 Vi sinh vật thị .42 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 42 2.3.1 Thiết bị .42 2.3.2 Dụng cụ 43 2.3.3 Hóa chất 43 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 43 2.4.1 Phƣơng pháp thu xử lý mẫu 43 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết thu nhận cao chiết 44 2.4.2.1 Phƣơng pháp chiết ngâm dầm .44 2.4.2.2 Phƣơng pháp chiết máy Soxhlet 45 2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa phƣơng pháp DPPH 47 2.4.4 Đánh giá khả kháng khuẩn, kháng nấm phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar method) 49 2.4.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 51 2.4.6 Phƣơng pháp xử lí số liệu .53 2.5 Bố trí thí nghiệm 53 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi cao chiết N aragoana 60 3.2 Kết khảo sát trình chiết phân đoạn từ cao chiết N aragoana 61 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana .63 3.4 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết cao phân đoạn N aragoana 68 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cao phân đoạn N aragoana 68 3.4.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn N aragoana .70 3.5 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cao phân đoạn chủng vi sinh vật gây bệnh 75 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 Kết luận .78 4.2 Kiến nghị .79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO : Dimethyl sulfoxide DPPH : 1,1 diphenyl – – picrylhydrazyl EA : Ethyl Acetate EtOH : Ethanol MeOH : Methanol MIC : Minimum Inhibitory Concentration : Nồng độ ức chế tối thiểu PDA : Potato Dextro Agar PE : Petroleum ether TSA : Tryptic Soy Agar TSB : Tryptone Soya Broth v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao chiết Ethanol .63 Bảng 3.2 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn PE 64 Bảng 3.3 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn EA .65 Bảng 3.4 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH cao phân đoạn nƣớc 66 Bảng 3.5 Giá trị I % ức chế gốc tự DPPH Vitamin C 67 Bảng 3.6 Kết so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết cao phân đoạn chủng vi sinh gây bệnh .74 Bảng 3.7 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cao phân đoạn chủng vi sinh vật gây bệnh .76 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Ảnh Nervilia aragoana .7 Hình 1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 34 Hình 1.3 E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc µm .35 Hình 1.4 Nấm mốc Aspergillus 37 Hình 1.5 Nấm sợi Fusarium .38 Hình 1.6 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 39 Hình 2.1 Mẫu bột N aragoana 44 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 54 Hình 2.3 Mẫu bột chiết hệ thống Soxhlet 56 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao chiết N aragoana .60 Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn từ cao chiết N aragoana 62 Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn % ức chế cao Ethanol 63 Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn % ức chế cao phân đoạn PE 64 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn % ức chế cao phân đoạn EA 65 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn % ức chế cao phân đoạn nƣớc 66 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn % ức chế mẫu Vitamin C 67 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn đối chứng kháng sinh Ampicillin vi khuẩn Escherichia coli .69 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn cao chiết, cao phân đoạn đối chứng kháng sinh Ampicillin vi khuẩn S.aureus 70 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Aspergillus niger 71 Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Fusarium solani .72 Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm cao chiết, cao phân đoạn đối chứng thuốc Ketoconazole chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum .73 vii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây dƣợc liệu từ lâu đƣợc xem sở để điều trị bệnh truyền nhiễm khác y học cổ truyền, loạt hợp chất đƣợc biết đến mang tính chất điều trị Các hợp chất có nguồn gốc thực vật có tầm quan trọng lớn dƣợc phẩm ứng dụng điều trị thƣờng có tác dụng phụ khơng gây độc Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Theo kết điều tra Viện Dƣợc Liệu gần đƣợc ghi nhận đƣợc 3948 lồi thực vật nấm lớn có cơng dụng làm thuốc, 52 lồi tảo biển, 408 lồi động vật 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Việt Nam Kết cho thấy nguồn dƣợc liệu nƣớc ta phong phú Con số tăng thêm, sâu điều tra cụ thể số nhóm động - thực vật tiềm Stress oxy hóa, gây gốc oxy, đuợc cho nguyên nhân bệnh thối hóa khác nhƣ ung thƣ, xơ vữa động mạch, loét dày Chất chống oxy hoá hợp chất giúp ức chế nhiều phản ứng oxy hóa gây gốc tự nhƣ nhƣ oxy đơn, superoxide, gốc peroxy, hydroxyl gốc tự peroxy nitrate, ngăn ngừa trì hỗn thiệt hại cho tế bào mơ Mặc dù có số chất chống oxy hố tổng hợp hợp chất nhƣ butylated hydroxyl anisole (BHA) butyl hóa toluene hydroxyl (BHT), thƣờng đƣợc sử dụng thực phẩm chế biến, nhiên nhiều nghiên cứu báo cáo hợp chất có tác dụng phụ [21] Bên cạnh loại thuốc chống nấm, kháng oxy hóa đƣợc tổng hợp đƣờng hóa học đƣợc bày bán tràn lan thị trƣờng khơng rõ độc hại tình trạng tiêu thụ lạm thuốc kháng sinh Việt Nam ngày gia tăng Một nghiên cứu Bộ Y tế thời gian gần rằng, việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh ngƣời dân Việt Nam thành thị 88%, nông thôn lên tới 91%, bệnh viện tuyến trung ƣơng sử dụng thuốc kháng sinh nhiều bệnh viện địa phƣơng Mà ngƣợc lại, tỉ lệ sử dụng kháng sinh bệnh Đồ án tốt nghiệp viện tuyến trung ƣơng chiếm gần 30% chi phí điều trị bệnh viện tuyến tỉnh 35%, tuyến huyện 45%, quan tâm đến y học cổ truyền tăng lên Theo WHO đƣa cảnh báo đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh nguyên nhân gây tử vong cho 10 triệu ngƣời toàn cầu Đáng báo động hơn, số quốc gia có tình trạng kháng thuốc kháng sinh nghiêm trọng Việt Nam số nƣớc đứng đầu Để tìm giải pháp cho vấn đề sản xuất thuốc kháng kháng sinh, thuốc chống nấm, chống oxy hóa đồng thời giảm chi phí sản xuất tiêu dùng dƣợc liệu, nhà khoa học bắt đầu tiềm kiếm nghiên cứu lồi có chứa hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc Để làm đƣợc điều việc cần phải xác định hoạt tính trị liệu độc tính số loài thực vật trƣớc dùng làm thuốc điều cần thiết Với sở khoa học ý nghĩa thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài: “Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết cao phân đoạn từ Lan (Nervilia aragoana)” nhằm nâng cao giá trị sử dụng góp phần vào kho tàng thuốc đặc hữu Việt Nam Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc Tại Việt Nam chƣa tìm thấy tài liệu nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi Lan lá, nhiên số nƣớc giới có nghiên cứu liên quan đƣợc công bố: - Năm 2009, K Himakar Reddy, P.V.G.K Sharma, cộng so sánh hoạt tính chống nấm chống oxy hoá từ chiết xuất Ethyl acetate toàn Nervilia aragoana Gaud (Orchidaceae) với chiết xuất Ethanol Atlantica monophylla Linn (Rutaceae) [21] - Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T P, cộng sự, nghiên cứu xác định thành phần hóa học có thân rễ Nervilia aragoana phƣơng pháp quang phổ [16] - Năm 2013, Elizabeth Thomas cộng nghiên cứu đặc điểm, tác dụng dƣợc lý Lan [18] Đồ án tốt nghiệp - Năm 2013, EK Dilipkurma GR Janardhana công bố kết nghiên cứu hoạt tính tái tạo tận, tuyến tụy bình thƣờng hóa lƣợng đƣờng máu từ chiết xuất Nervilia aragoana đối tƣợng chuột [15] Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả kháng oxy hóa cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50) - Khảo sát khả kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Nội dung nghiên cứu - Đánh giá ảnh hƣởng phƣơng pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi cao chiết Nervilia aragoana Xác định hiệu suất chiết phƣơng pháp tách chiết - Xác định tỷ lệ thu hồi cao phân đoạn sau trích ly cao chiết Nervilia aragoana - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự từ cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50) từ cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana chủng vi khuẩn nấm gây bệnh Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thực nghiên cứu đối tƣợng Nervilia aragoana, tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn kháng nấm từ cao chiết cao phân đoạn loài 5.2 Phạm vi nghiên cứu Mẫu Nervilia aragoana đƣợc tách chiết từ dung môi Ethanol sau thu cao chiết tiến hành trích ly cao chiết với loại dung môi khác từ phân Đồ án tốt nghiệp cực đến phân mạnh: Petroleum ether, Ethyl acetate, nƣớc Sau cao chiết cao phân đoạn thu đƣợc tiến hành khảo sát khả kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH (1,1-dihenyl-2-picrylhydrazyl); khả kháng khuẩn vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus; khả kháng nấm chủng nấm gây bệnh nhƣ: Fusarium solani, Aspergillus niger, Neoscytalidium dimidiatum Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Lan (Nervilia aragoana) 1.1.1 Phân loại khoa học phân bố 1.1.1.1 Phân loại khoa học Hệ thống phân loại Nervilia aragoana [34] Kingdom Plantae Division Angiospermae Class Monocotyledoneae Order Asparagales Family Orchidaceae Subfamily Epidendroideae Tribe Gastrodieae Subtribe Nervilliinae Genus Nervilia Species Nervilia aragoana GAUD Nervilia bao gồm số loài sau: Nervilia aragoana Commons ex Gaudich (Trân châu xanh, Thanh thiên quỳ xanh), Nervilia fordii (Hance) Schltr (Trân châu, Thanh thiên quỳ, Lan lá, Lan cờ), Nervilia plicata (Andrews) Schltr (Trân châu xếp, Thanh thiên quỳ xếp) [2], [35] Một số tên gọi khoa học khác Nervilia aragoana: Aplostellis aragoana (Gaudichaud-Beaupré) Ridley; Aplostellis flabelliformis (Lindley) Ridley; Epipactis carinata Roxburgh; Nervilia carinata (Roxburgh) Schlechter; Nervilia flabelliformis (Lindley) Tang & Wang; Nervilia scottii (Reichenbach f.) Schlechter; Nervilia tibetensis Rolfe; Nervilia yaeyamensis Hayata; Pogonia carinata (Roxburgh) Lindley; Pogonia gracilis Blume; Pogonia flabelliformis Lindley; Pogonia nervilia Blume; Pogonia scottii Reichenbach f [36], [37], [38], [39] Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2 Phân bố N aragoana loài hoa phong lan sống mặt đất (địa lan) đƣợc tìm thấy chủ yếu khu rừng rậm rạp ẩm ƣớt Ấn Độ [40], [41] Nó chủ yếu đƣợc tìm thấy khu rừng Darjeeling Himalaya trồng độ cao 400 – 1000 m [28] Nó đƣợc báo cáo có dãy McIlwraith Queensland, Australia, từ độ cao – 150 mét Vì chủ yếu đƣợc tìm thấy Ấn Độ, Malaysia, bắc Thái Lan, Lào, Miến Điện, Indonesia New Guinea Ở nƣớc ta Lan mọc kẽ đá, nơi rợp vùng núi đá vôi nơi ẩm vùng chân núi Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Hồ Bình, Ninh Bình Cây mọc khe núi, nơi thấp ẩm ƣớt, dƣới bóng to Miền núi phía bắc gồm: Văn Uyên, Cao Lộc, Đồng Mỏ, Hữu Lũng, Trùng Kháng, Quảng Uyên (Cao Bằng) Gần xuất tỉnh: Lao Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Hà Tây, Hồ Bình, Sơn La, Lai Châu… Lồi cho hoa vào khoảng độ tháng – Thu hái vào mùa thu, rửa sạch, phơi khô, vò nhẹ phơi lại Phơi vò ngày – lần khơ hẳn Cũng thu hái toàn quanh năm, dùng tƣơi hay phơi khơ Hiện lồi bị suy giảm nghiêm trọng chặt phá rừng hủy hoại nơi cƣ trú đối tƣợng săn tìm khai thác "tuyệt diệt" Nervilia aragoana nằm danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý (nhóm 2) Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng mục đích thƣơng mại Vì cần có biện pháp xây dựng khu bảo tồn nhân giống Lan vƣờn quốc gia di chuyển lƣợng sống lồi khu vực bảo tồn chăm sóc 1.1.2 Đặc điểm thực vật [17] Cây thân thảo cao dƣới 20 cm, mọc đất, có củ chìm, thân rễ trịn to 15 mm, hoa không đồng thời (cho hoa trƣớc đến lá) Cuống cao 10 – 15 cm Lá màu xanh, đơi có chấm màu tía sẫm, khơng có lơng, dài 12 cm, rộng 16 cm, hình tim rộng, mép lƣợn sóng, thùy gốc nhiều phủ lên Cụm hoa cao tới 30 cm, cán mang vài bẹ nhỏ, dài 1,5 cm, hẹp Cuống bầu dài Đồ án tốt nghiệp – 10 mm Lá đài cánh hoa hẹp, xoè, màu xanh nhợt, dài – 2,5 cm Môi ngắn đài, màu trắng có gân màu xanh tía nhạt; thùy bên nhỏ, hình tam giác, đứng, đỉnh xịe; thùy hình trứng có mép cong, có lơng gân Cây tái sinh chồi hạt Mọc rải rác rừng thƣa, độ cao 200 – 500 m Hình 1.1 Ảnh Nervilia aragoana [42] 1.1.3 Thành phần hóa học Bhogaonkar cộng cho biết thành phần hóa học N aragoana cách sử dụng xét nghiệm nhận dạng thông thƣờng Kết nghiên cứu N aragoana có chứa hợp chất alkaloids, flavonoid, triterpenoid, khoáng chất, acid amin Lá đƣợc báo cáo chứa flavonoid, glycosid cyanogenic, terpenoid tannin [25], [27] Beena Radhakrishnan báo cáo thành phần hóa học lồi kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) vết chất khác đƣợc phát có chiết xuất cao Methanolic N aragoana cách soi đèn UV phun thuốc thử màu Các tác giả báo cáo phân tích thành phần hóa học chất chiết xuất từ thân, rễ phƣơng pháp xác định thành phần hóa học khác Phân tích từ chiết xuất nƣớc rễ cho thấy diện flavonoid, glycoside, sterol tannin Và phân tích từ chiết xuất nƣớc cho thấy có mặt flavonoids, glycosides tannin Họ ghi nhận diện alkaloid có thành phần hóa học lồi [14] Đồ án tốt nghiệp Tohru cộng báo cáo acid béo khác chiết xuất khác tồn khơ Các chiết xuất ether tồn đƣợc phân tích GC – MS sau methyl hóa báo cáo có chứa acid béo nhƣ methyl palmitate, methyl lenolate methyl lenolinate Phần trung tính chiết xuất ethereal đƣợc báo cáo chứa phytol, glyceride hỗn hợp, hai chất kết tinh tạo thành hỗn hợp rƣợu triterpene Hỗn hợp đƣợc xác định có chứa cycloeucalenol acetate, dihydrocyclonervilol acetate, dihydrocycloeucalenol acetate (Sau acetyl hóa), hai triterpene cyclonervilol cyclohomonervilol theo phân tích GC – MS [32] Lồi báo cáo có chứa 24 – Isopropenyl cholesterol [29] Các chiết xuất methanolic đƣợc báo cáo chứa lƣợng lớn L – norelucine cách so sánh trực tiếp với mẫu thực phƣơng pháp phân tích acid amin Phần hịa tan chiết xuất methanolic đƣợc báo cáo có chứa hợp chất giống nhƣ chiết xuất ethereal [32] Các cấu trúc hóa học thành phần hóa học đƣợc xác định có chiết xuất N aragoana báo cáo Tohru Kikuchi đƣợc đƣa dƣới [32]: CH3 (CH2)3 (CH2 CH=CH)2 (CH2)7 COOCH3 Methyl linolate CH3 (CH2CH=CH)3 CH7 COOCH3 Methyl linolenate Phytol Đồ án tốt nghiệp Cycloeucalenol acetate Dihydroeucalenol acetate Stigmasterol 1.1.4 Giá trị dược liệu Lồi N aragoana có nhiều sử dụng y học cổ truyền y học dân gian Củ phần đƣợc dùng làm thuốc [40] Cây có tác dụng làm mát, thuốc lợi tiểu thuốc bổ Hữu ích chữa đau dày, đau thắt Đồ án tốt nghiệp ngực, đau thắt cổ, bệnh hoại tử [27] Củ đƣợc sử dụng làm thuốc cho điều trị chứng động kinh, bệnh tiểu tiện, tiêu chảy hen suyễn [40, 14] Củ tƣơi đƣợc làm cách đƣợc tin giúp kiểm sốt đói khát [27], [33] N aragoana cịn có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tâm thần, liệt nửa ngƣời, ho nơn mửa [40] Lồi đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc đƣợc nhiều lạc Ấn Độ sử dụng Các lạc phát triển dƣợc phẩm riêng họ kiến thức truyền thống họ việc sử dụng thuốc thực vật từ thử nghiệm phƣơng pháp xƣa N aragoana đƣợc sử dụng lạc Bhilla Maharashtra Bột củ đƣợc đắp trán cho chữa trị bệnh đau đầu [31] Có vài thơng báo củ đƣợc sử dụng để điều trị bệnh kiết lỵ máu tộc cƣ dân cao nguyên Amarkantak, Madhya Pradesh, Ấn Độ Trong phƣơng pháp điều trị bệnh này, ngƣời dân tộc sử dụng củ N aragoana đƣợc báo cáo dùng làm hỗn hợp với mật ong (ml), liều dùng uống hai lần ngày năm ngày [13] Các dùng làm thuốc bảo vệ cho phụ nữ sau sinh [33], [14], [26] Các nƣớc sắc đƣợc sử dụng làm thuốc bổ cho phụ nữ củ đƣợc sử dụng nhƣ chất kích thích tăng lƣợng sữa mẹ [27] Theo Dƣợc học cổ truyền Tàu Việt Nam: Tồn có đƣợc dùng làm thuốc Vị thuốc đƣợc xem là: Vị đắng, tính mát Thân củ có tác dụng tán ứ, tiêu thụng; trấn tinh, thống Toàn nhiệt, giải độc, nhuận phế, khái Đƣợc dùng trị bệnh tâm thần, ho, hạ đàm Làm nƣớc sắc, hay ngâm ruợu trị thƣơng tổn, đau đớn, té ngã [35] Theo tài liệu Trung Quốc thuốc có tác dụng trị lao phổi, làm mát phổi Dùng làm thuốc xoa bóp, đáng gió giải cảm Thƣờng ngâm rƣợu Công dụng, định phối hợp: nƣớc ta đồng bào sử dụng làm thuốc giải độc, ngộ độc nấm Ngƣời ta dùng – phơi khô thái nhỏ, hãm với nƣớc sôi phút chiết nƣớc uống Ngày uống lần Ngƣời ta dùng làm thuốc bồi dƣỡng thể, thuốc bổ mát phổi, chữa lao phổi, ho Ngày dùng 10 – 20 dƣới dạng 10 ... 68 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cao phân đoạn N aragoana 68 3.4.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm cao chiết cao phân đoạn N aragoana. .. 3.3 Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự DPPH cao chiết cao phân đoạn từ N aragoana .63 3.4 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết cao phân đoạn N aragoana. .. hồi cao phân đoạn sau trích ly cao chiết Nervilia aragoana - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự từ cao chiết cao phân đoạn Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50) từ