nghiên cứu sử dụng cao chiết thảo dược nâng cao khả năng kháng bệnh do streptococcus agalactiae gây ra trên cá rô phi oreochromis spp

Các loại thảo dược hứa hẹn tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các liệu pháp chữa bệnh trong nuôi trồng th y sản do có nhiều ưu điểm như: phổ biến, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn c



NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢC NÂNG CAO KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH DO

Streptococcus agalactiae GÂY RA TRÊN

CÁ RÔ PHI (Oreochromis spp.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024



NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CAO CHIẾT THẢO DƯỢC

NÂNG CAO KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH DO

Streptococcus agalactiae GÂY RA TRÊN

CÁ RÔ PHI (Oreochromis spp.)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

PGS TS Từ Thanh Dung

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2024

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và PGS.TS Từ Thanh Dung vì sự tận tình hướng dẫn, hỗ trợ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin được chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Ban ch nhiệm c ng tập thể Khoa Khoa học Sinh học và Ph ng Sau đại học thuộc Trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo cùng các cán bộ tại Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ, Phòng Sinh học thực nghiệm, Trại Nghiên cứu Thực nghiệm Th y sản G Vấp thuộc Viện Nghi n cứu Nuôi trồng

Th y sản II đã hỗ trợ và tạo mọi điều iện về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu Đồng thời tôi xin cám ơn anh Đoàn Văn Cường - người

đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin được gửi ời cám ơn đến Ban Giám đốc c ng các đồng nghiệp Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai đã ng hộ, tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể học tập và hoàn thành luận án

Xin chân thành cám ơn những Thầy/Cô, anh chị Khoa Th y sản c a Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh cùng các anh chị em Nghiên cứu sinh ngành Công nghệ sinh học khóa 2016, các em sinh viên đã hỗ trợ động viên tôi hoàn thành các nội dung c a luận án

Tôi vô cùng biết ơn gia đình Chồng và Các con tôi - những người đã luôn yêu thương ở bên cạnh để động viên, hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện Luận án

Xin chân thành cám ơn

Tác giả luận án

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và một phần kết quả thuộc nhiệm vụ khoa học và công nghệ “Nghi n cứu phòng trị bệnh do

liên cầu khuẩn Streptococcus agalactiae bằng thảo dược trên cá rô phi giống (Oreochromis spp.) nuôi tại Thành phố Hồ Chí Minh” được tài trợ kinh phí bởi

Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh (thuộc Sở Khoa học

và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh) cho Trung tâm Quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản Nam Bộ theo Hợp đồng số 26/2018/HĐ-QKHCN Những số liệu, kết quả trong luận án được phép công bố với sự đồng ý c a ch nhiệm đề tài, nhóm tác giả, cộng tác vi n và chưa từng được công bố bởi tác giả khác

Tác giả luận án

NGUYỄN THỊ TRÚC QUYÊN

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 11 năm 2017 đến tháng 12 năm 2022 với

các nội dung gồm: (1) Xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Streptococcus

agalactiae ở điều kiện in vitro c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng; (2) Xác định

ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi

khuẩn gây bệnh S agalactiae trong điều kiện phòng thí nghiệm; (3) Xác định ảnh

hưởng c a cao chiết lên chỉ tiêu máu, một số chỉ tiêu miễn dịch và hình thái ruột

c a cá rô phi; và (4) Khảo sát khả năng kháng khuẩn c a cao chiết vỏ quế và cao

chiết gừng dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính

Cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng được chiết xuất trong dung môi ethanol

96% và methanol 99,8% được ghi nhận à có khả năng diệt vi khuẩn S agalactiae ở điều kiện in vitro trong số 6 loại thảo dược được khảo sát Nghiên cứu trong điều kiện in vivo cho thấy, cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế với các hàm ượng 10 20

và 40 g/kg được bổ sung vào thức ăn trong 8 tuần hông àm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển c a cá rô phi giống B n cạnh đó với thời gian bổ sung 28 ngày

và tiếp tục trong 10 ngày sau hi cá được cảm nhiễm với S agalactiae, các cao chiết tr n đã cho thấy hiệu quả hỗ trợ nâng cao khả năng háng bệnh do S

agalactiae gây ra; đồng thời cao chiết vỏ quế còn giúp gia tăng hả năng hấp thu

chất dinh dưỡng trên cá rô phi giống Hiệu quả bảo vệ cao nhất với vi huẩn S

agalatiae (RPS đạt 51 4%) trên cá được cho ăn hẩu phần có bổ sung cao chiết vỏ

quế với hàm ượng 20 g/ g thức ăn Nghi n cứu cho thấy, hoạt chất cinnamic aldehyde với hàm ượng 100 µg/g thức ăn và 200 µg/g thức ăn có khả năng háng

vi khuẩn S agalactiae Ngoài ra, nghiên cứu đã cho thấy sự hiện diện c a vi khuẩn

S agalactiae mang các yếu tố độc lực quan trọng và thuộc CC283, kiểu trình tự

ST283 tại huyện C Chi, Thành phố Hồ Chí Minh

Các kết quả trong nghiên cứu này đã giúp hẳng định tiềm năng ứng dụng c a cao chiết vỏ quế và cao chiết gừng trong việc nâng cao khả năng háng bệnh do vi

khuẩn S agalactiae gây ra trên cá rô phi giống

ABTRACTS

The study was conducted from November 2017 to December 2022, with the

contents included: (1) Determination of the ability to antagonize pathogenic bacteria

S agalactiae under in vitro conditions of cinnamon bark (Cinnamomum verum)

and ginger (Zingiber officinale) extracts; (2) Determination of the effect of extract

on growth and ability to protect tilapia against pathogenic bacteria S agalactiae under experimental conditions; (3) Determination of the effect of the extract on

blood and immune parameters, and morphological parameters of tilapia intestine;

and (4) Investigation of antibacterial properties of cinnamon bark and ginger

extracts based on the content of main active ingredients

Ginger and cinnamon bark extracts in ethanol 96% and methanol 99.8% have

ability to against two strains of S agalatiae under in vitro conditions among 6

tested herbs The study under in vivo conditions confirmed that, the addition of ginger and cinnamon extracts with concentrations of 10, 20 and 40 g/kg to the feed gave no effect for the growth and development of tilapia at fingerling stage At the same time, in the period of 28 days and continuing to supplement for 10 days after

fish injected intraperitoneally to S agalactiae, the ginger and cinnamon extracts provided the protective effect in enhancing the fish against to S agalactiae; besides,

cinnamon extract also increased nutrient absorption ability in tilapia fingerlings The addition of cinnamon extract with the concentration of 20 g/kg of feed had the

highest protective effect with S agalatiae (with the RPS value being 51.4%) The results have determined the S agalactiae bactericidal ability of cinnamic aldehyde

with the content of 100 µg/g feed and 200 µg/g feed Moreover, this study has

shown the presence of bacteria S agalactiae CC283, ST283 sequence bringing

important virulence factors in Cu Chi district, Ho Chi Minh city, Vietnam

The results in the study confirmed the potential of cinnamon and ginger

extracts in enhancing the resistance to S agalactiae in tilapia fingerlings

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN……… i

LỜI CAM ĐOAN……… ii

TÓM TẮT……… iii

ABSTRACT……… iv

MỤC LỤC……… v

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT……… ix

DANH MỤC BẢNG……… xi

DANH MỤC HÌNH……… xiii

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN……… 6

1.1 Tổng quan về cá rô phi……… 6

1.1.1 Phân loại khoa học và nguồn gốc……… 6

1.1.2 Đặc điểm sinh học……… 6

1.1.3 Tình hình sản xuất cá rô phi trên thế giới và ở Việt Nam……… 7

1.2 Tổng quan về vi huẩn S agalactiae……… 8

1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa……… 8

1.2.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích ……… 9

1.2.3 Phân nhóm và độc lực c a vi khuẩn S agalactiae……… 10

1.2.3.1 Phân nhóm……… 10

1.2.3.2 Các yếu tố độc lực……… 11

1.2.4 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S agalactiae gây ra……… 13

1.2.4.1 Đối với động vật thủy sản……….… 13

1.2.4.2 Đối với cá rô phi……… 14

1.3 Sử dụng thảo dược phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp và S agalactiae gây ra trên th y sản……… …… 15

1.3.1 Nghiên cứu khả năng háng Streptococcus sp c a thảo dược……… 16

1.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng c a thảo dược n tăng trưởng, sức khỏe

cá……… ……… 18

1.4 Đáp ứng miễn dịch trên cá xương và tác động c a thảo dược lên hình thái biểu mô c a cá……… 20

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch tr n cá xương……… 20

1.4.2 Tác động c a thảo dược lên hình thái biểu mô c a cá……… 20

1.5 Giới thiệu các loại thảo dược sử dụng trong nghiên cứu……… 21

1.6 Phương pháp chiết xuất thảo dược dùng trong nghiên cứu……… 24

1.6.1 Chiết xuất ngấm kiệt……… 24

1.6.2 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ cao……… 25

1.7 Cơ sở lựa chọn các nội dung nghiên cứu……… 26

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 27

2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu……… 27

2.1.1 Thời gian……… 27

2.1.2 Địa điểm……… 27

2.2 Nội dung nghi n cứu……… 27

2.3 Vật iệu nghi n cứu……… 27

2.3.1 Thảo dược……… 28

2.3.2 Nguồn cá bệnh dùng trong nghiên cứu……… 28

2.3.3 Cá dùng trong thí nghiệm in vivo 29

2.3.4 Thức ăn hóa chất, dụng cụ, thiết bị 29

2.4 Phương pháp nghi n cứu……… … 30

2.4.1 Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnh S agalactiae ở điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược……… 30

2.4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S agalactiae……… 30

2.4.1.2 Khảo sát khả năng kháng S agalactiae của cao chiết dạng thô……… 32

2.4.1.3 Xác định giá trị MIC và MBC của cao chiết dạng thô……… 36

2.4.2 Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S agalactiae……… 37

2.4.2.1 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên tăng trưởng……… 37

2.4.2.2 Xác định giá trị LD 50 và các yếu tố độc lực……… 39

2.4.2.3 Xác định ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng bảo vệ cá rô phi…… 41

2.4.3 Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi……… 44

2.4.3.1 Bố trí thí nghiệm……… 44

2.4.3.2 Thu mẫu……… 45

2.4.3.3 Phân tích tế bào máu và các chỉ tiêu miễn dịch……….… 46

2.4.3.4 Phân tích chỉ tiêu hình thái mô ruột cá……… 47

2.4.4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và hảo sát tính háng huẩn c a cao chiết thảo dược dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính……… 48

2.4.4.1 Xác định hàm lượng hoạt chất 6-gingerol và cinnamic aldehyde…… 48

2.4.4.2 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của các hoạt chất chính……… 51

2.4.4.3 Xác định MIC và MBC của cao chiết theo hàm lượng chất chính…… 51

2.5 Xử lý số liệu……… 52

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 53

3.1 Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnh S.agalactiae ở điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược……… ……… 53

3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu……… 53

3.1.2 Sàng lọc khả năng háng S agalactiae c a dịch chiết……… 54

3.1.3 Khảo sát khả năng háng S agalactiae c a các cao chiết dạng thô……… 57

3.1.4 Xác định giá trị MIC và MBC c a cao chiết gừng và quế……… 61

3.1.5 Xác định loại thảo dược và dung môi phù hợp……… 63

3.2 Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S agalactiae……… 64

3.2.1 Xác định ảnh hưởng c a cao chiết n tăng trưởng c a cá………… 64

3.2.2 Xác định giá trị LD50 và các yếu tố độc lực……… 68

3.2.2.1 Xác định giá trị LD 50 ……….……… 68

3.2.2.2 Xác định các yếu tố độc lực ……… 70

3.2.3 Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên khả năng bảo vệ cá ………… 77

3.2.3.1 Tỷ lệ sống và các chỉ tiêu tăng trưởng……… 77

3.2.3.2 Biểu hiện bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm……… 78

3.3 Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, miễn dịch và hình thái ruột c a cá rô phi……… 84

3.3.1 Xác định ảnh hưởng lên chỉ tiêu máu và các chỉ tiêu miễn dịch………… 84

3.3.1.1 Mật độ hồng cầu và bạch cầu……… 84

3.3.1.2 Hoạt tính thực bào……… 93

3.3.2 Xác định ảnh hưởng lên hình thái mô ruột cá……… 95

3.4 Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn c a cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính……… 105

3.4.1 Xác định hàm ượng hoạt chất chính……… 105

3.4.1.1 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiết gừng……… 106

3.4.1.2 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong cao chiết vỏ quế……… 109

3.4.1.3 Xác định hàm lượng hoạt chất chính trong thức ăn thí nghiệm……… 113

3.4.2 Khả năng háng S agalactiae c a cao chiết theo hoạt chất chính……… 114

3.5 Hiệu quả nâng cao khả năng háng S agalactiae c a cao chiết 116

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 121

4.1 Kết luận……… 121

4.2 Đề nghị……… 122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ……… 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 124 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth

CAMP Christie–Atkins–Munch-Peterson

CC Clonal complex

CFU Co ony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

CPS Capsular polysaccharide

DĐTQ Dược điển Trung Quốc

DĐVN Dược điển Việt Nam

DMSO Dimethyl sulfoxide

DO Hàm ượng oxy hòa tan

DWG Tăng trọng khối ượng theo ngày

ĐVT Đơn vị tính

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ

chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) FCR Feed Conversion Ratio (hệ số biến đổi thức ăn)

HBSS Hank's Balanced Salt Solution

LD50 Lethal dose, 50% (liều gây chết 50% vật thí nghiệm, liều vi

khuẩn gây chết cá)

MBC Minimum Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối

thiểu) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MLST Multi-locus sequence typing (Giải trình tự gen đa điểm)

MP/ME Muscularis propria/ Muscu aris externa (Độ dày lớp đệm niêm

mạc)

NT Nghiệm thức

PA Phagocytic activity (Hoạt tính thực bào)

PBS Phosphate Buffered Saline (Nước muối đệm photphat)

RBC Red Blood Cell (Tế bào hồng cầu)

RES Respiratory burst (Hoạt tính chống oxy hóa)

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RPS Relative percentage survival (Tỷ lệ sống tương đối)

SGR Specific Growth Rate (Tốc độ tăng trưởng tương đối theo khối

ượng)

ST Sequence Types (Loại trình tự)

VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers (Hiệp

hội Chế biến và Xuất khẩu Th y sản Việt Nam)

VH Villus height (Chiều cao nhung mao)

VW Villus width (Chiều rộng nhung mao)

WBC White Blood Cell (Tế bào bạch cầu)

WG Weight Gain (Tăng trọng khối ượng)

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm gen độc lực c a vi khuẩn S agalactiae……… 12

Bảng 2.1 Các loại thảo dược được dùng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.2 Các ch ng vi khuẩn S agalactiae dùng trong nghiên cứu 29

Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng c a thức ăn d ng trong thí nghiệm ……… 29

Bảng 2.4 Hàm ượng ẩm (%) c a các loại bột thảo dược thí nghiệm………… 33

Bảng 2.5 Các nghiệm thức c a thí nghiệm xác định ảnh hưởng c a việc bổ

sung cao chiết vào thức ăn n tăng trưởng c a cá rô phi……… 39

Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm xác định liều gây chết LD50……… 40

Bảng 2.7 Số ượng và thời điểm thu mẫu ruột cá làm tiêu bản mô học……… 47

Bảng 2.8 Ti u chuẩn hóa nguy n iệu gừng và quế……… 49

Bảng 3.1 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các

giếng tẩm dịch chiết thảo dược sau 48 giờ tiếp xúc với vi khuẩn SA-12.1 và

Bảng 3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa

giấy tẩm cao chiết thảo dược sau 48 giờ tiếp xúc với vi khuẩn 58

Bảng 3.3 Kết quả xác định giá trị MIC và MBC c a cao chiết gừng và vỏ quế

dạng thô đối với các ch ng vi khuẩn trong dung môi ethanol và methanol…… 62

Bảng 3.4 Các giá trị chất ượng nước trong thí nghiệm xác định tính an toàn

c a cao chiết thảo dược hi bổ sung vào thức ăn……… 64

Bảng 3.5 Tăng trưởng c a cá trong thí nghiệm……… 65

Bảng 3.6 Kết quả xác định LD50 c a các ch ng vi huẩn… 69

Bảng 3.7 Trình tự gen các ocus để xác định iểu trình tự c a ch ng

Bảng 3.8 Các gen độc lực tìm thấy trong ch ng S agalactiae SA-2.1-CC…… 76

Bảng 3.9 Các giá trị chất ượng nước trong thí nghiệm xác định hiệu quả bảo

vệ cá rô phi c a cao chiết thảo dược hi bổ sung vào thức ăn……… 77

Bảng 3.10 Khối ượng và tỷ ệ sống c a cá sau 28 ngày thí nghiệm ………… 78

Bảng 3.11 Tỷ ệ chết tích ũy c a cá sau hi cảm nhiễm với vi huẩn S agalctiae……… 81

Bảng 3.12 Hiệu quả bảo vệ c a cao chiết gừng và cao chiết vỏ quế với cá rô phi hi được cảm nhiễm vi khuẩn S agalactiae……… 82

Bảng 3.13 Diện tích nhung mao (103 µm2) c a ruột cá cho ăn thức ăn bổ sung cao chiết vỏ quế……… 103

Bảng 3.14 Kết quả ti u chuẩn hóa nguy n iệu gừng……… 106

Bảng 3.15 Kết quả phân tích hàm ượng 6-Gingero ……… 109

Bảng 3.16 Kết quả tiêu chuẩn hóa nguyên liệu quế……… 110

Bảng 3.17 Kết quả phân tích hàm ượng cinnamic a dehyde……… 112

Bảng 3.18 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) tạo thành xung quanh các đĩa giấy tẩm cao chiết thảo dược theo hàm ượng hợp chất chính sau 48 giờ tiếp xúc với vi khuẩn SA-2.1-CC……… 115

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Cá rô phi vằn (O niloticus)……… 7

Hình 1.2 Vi huẩn Streptococcus agalactiae……… 9

Hình 1.3 Quá trình tách chiết thảo dược bằng phương pháp ngấm iệt …… 25

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất thảo dược thí nghiệm in vitro……… 31

Hình 2.2 Dịch chiết gốc thu được sau quá trình tách chiết……… 33

Hình 2.3 Cao chiết thảo dược sử dụng trong thí nghiệm……… 33

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định khả năng bảo vệ cá rô phi ……… 42

Hình 2.5 Các giai đoạn c a thí nghiệm xác định khả năng bảo vệ cá rô phi… 43

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ tiêu miễn dịch và mô học ruột… 44

Hình 2.7 Các chỉ tiêu khảo sát hình thái mô học ruột c a cá thí nghiệm…… 48

Hình 2.8 Quy trình chiết xuất thảo dược để khảo sát tỷ lệ dung môi chiết xuất tối ưu……… 50

Hình 3.1 Xác định đặc tính sinh hóa c a ch ng SA-12.1 với test kit API 32 Strep……… 54

Hình 3.2 Vòng kháng khuẩn tạo ra bởi các dịch chiết đối với ch ng SA-12.1 56 Hình 3.3 V ng háng huẩn tạo ra bởi cao chiết vỏ quế trong methanol và bởi kháng sinh Doxycycline đối với ch ng SA-12.1……… 59

Hình 3.4 Tăng trưởng hối ượng c a cá sau 8 tuần thí nghiệm……… 66

Hình 3.5 Cá bình thường và cá có biểu hiện bệnh ý ……… 79

Hình 3.6 Tỷ ệ cá chết tích ũy theo ngày sau cảm nhiễm……… 80

Hình 3.7 Mật độ hồng cầu và bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 85

Hình 3.8 Tỷ lệ các loại bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 86

Hình 3.9 Mật độ hồng cầu và bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết

vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 88

Hình 3.10 Tỷ lệ các loại bạch cầu c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ

quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác……… 89

Hình 3.11 Chỉ số hoạt tính thực bào c a các nghiệm thức bổ sung cao chiết

gừng và cao chiết vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 93

Hình 3.12 Diện tích nhung mao ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết

gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 97

Hình 3.13 Độ dày ớp cơ ni m mạc ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết

gừng ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 98

Hình 3.14 Diện tích nhung mao ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết vỏ

quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 99

Hình 3.15 Độ dày ớp cơ ni m mạc ruột cá các nghiệm thức bổ sung cao chiết

vỏ quế ở các thời điểm cảm nhiễm hác nhau……… 100

Hình 3.16 Hình ảnh mô học ruột cá trong nghiên cứu……… 102

Hình 3.17 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính các cao ỏng gừng với tỷ ệ

hác nhau đối chiếu nguy n iệu và chuẩn 6- gingero ……… 107 Hình 3.18 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính cao đặc gừng tỷ ệ 1:20……… 108

Hình 3.19 Sắc í đồ dịch chiết cao gừng tỷ lệ 1:20 bằng HPLC……… 109

Hình 3.20 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính các cao ỏng vỏ quế với tỷ ệ

hác nhau đối chiếu nguy n iệu và chuẩn cinnamic a dehyde……… 111

Hình 3.21 Sắc ý đồ sắc ý ớp mỏng định tính cao đặc vỏ quế tỷ ệ 1:30…… 112

Hình 3.22 Sắc ý đồ dịch chiết cao quế và dịch chiết thức ăn bằng HPLC… 112

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết

Nuôi trồng th y sản được xác định à một trong những ĩnh vực phát triển nhanh nhất trong ngành sản xuất thực phẩm (Bondad-Reantaso và ctv, 2005) Việt Nam cũng đã xác định th y sản là ngành kinh tế mũi nhọn từ những năm đầu thập niên 90 và trong giai đoạn 2015-2022, mặc d đối mặt với hông ít hó hăn thách thức nhưng sản ượng nuôi th y sản vẫn không ngừng tăng n, từ 3,53 triệu tấn (năm 2015) lên 5,19 triệu tấn (năm 2022) (VASEP, 2023a) Trong các oài cá nước

ngọt, cá rô phi (Oreochromis spp.) à oài được nuôi phổ biến thứ hai trên thế giới,

chỉ sau những loài cá chép (Fitzsimmons, 2005) Cá rô phi được nuôi thương mại

tr n hơn 100 quốc gia và trở thành loài mang lại giá trị kinh tế cao trong nuôi trồng

th y sản (Webster và Lim, 2006) Sản ượng cá rô phi nuôi trên thế giới tăng từ 5,67 triệu tấn năm 2015 (FAO 2017) lên 6,4 triệu tấn vào năm 2022 (VASEP, 2023b) Ở Việt Nam, cá rô phi là một trong những đối tượng nuôi phổ biến và đã được xác định là sản phẩm th y sản ch lực c a nước ta sau tôm nước mặn, lợ và cá tra (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2016) Theo đó định hướng đến năm 2030, diện tích nuôi cá rô phi cả nước đạt 33.000 ha (tăng 1 5 ần so với năm 2015 à 21.000 ha), sản ượng đạt 300.000 tấn (tăng gấp 2 lần so với năm 2015 trong đó 50

- 60% sản ượng đ tiêu chuẩn xuất khẩu)

Trong nuôi trồng th y sản, dịch bệnh là kết quả c a một quá trình tương tác phức tạp giữa mầm bệnh, các yếu tố môi trường điều kiện vật ch , thói quen chăm

sóc vật nuôi … (Boerlage và ctv, 2017) Bệnh do Streptococcus sp gây ra được báo

cáo lần đầu tiên trên cá hồi nuôi tại Nhật Bản vào năm 1958 (Hoshina và ctv 1958)

và là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế đáng ể cho ngành nuôi trồng th y

sản (Abraham và ctv, 2019) Cá rô phi có thể bị nhiễm Streptococcus sp do một số

lý do, bao gồm cả tình trạng căng thẳng (stress) (Liao và ctv, 2020) Vi khuẩn

Streptococcus agalactiae là tác nhân gây ra bệnh lồi mắt, xuất huyết trên cá

rô phi - một bệnh gây chết nhanh, tỷ lệ chết cao ở tất cả các giai đoạn phát triển c a

cá, gây thiệt hại kinh tế rất nghiêm trọng cho người nuôi; và là một trong hai loài vi

khuẩn chính ảnh hưởng đến việc sản xuất cá rô phi trên thế giới (loài còn lại là S

iniae) (Lingam và ctv, 2021) Sử dụng kháng sinh là giải pháp phổ biến để kiểm

soát bệnh do S agalactiae gây trên cá rô phi, tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh có

thể dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh c a các ch ng vi khuẩn (Zhang và ctv,

2018, 2020) àm tăng tỷ lệ mầm bệnh kháng kháng sinh Bên cạnh đó do vi khuẩn

có thể phát triển khả năng đề kháng với bất kỳ loại kháng sinh nào nên điều quan trọng là phải sử dụng kháng sinh và các chất thay thế đúng phương pháp Mặt khác, tình trạng sử dụng kháng sinh hông chính xác ( hông ph hợp với ch ng vi huẩn gây bệnh hoặc hông đúng iều ượng iệu trình) có thể ảnh hưởng xấu đến chất ượng và an toàn thực phẩm (Zhang, 2021) Do đó hiện nay, một trong những xu hướng được xem là bền vững và hợp lý về mặt kinh tế (Maulu và ctv, 2021) trong việc kiểm soát dịch bệnh trên th y sản là sử dụng thảo dược có nguồn gốc từ thiên

nhiên để phòng trị bệnh do vi khuẩn trong đó có vi khuẩn S agalactiae trên cá rô

phi Việc bổ sung 0 5% tỏi vào hẩu phần ăn cho cá rô phi ai trong 4 tuần có tác dụng nâng cao miễn dịch c a cá thí nghiệm (Ndong và ctv 2007) Tr n cá rô phi vằn thực hiện bổ sung kim ngân và nấm linh chi vào chế độ ăn trong vòng ba tuần, với ba khẩu phần gồm: 1% kim ngân, 1% nấm linh chi và hỗn hợp chứa 0,5% mỗi loại cho thấy giúp cải thiện tình trạng miễn dịch và khả năng háng bệnh c a cá thí

nghiệm khi tiếp xúc với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Yin và ctv, 2008); tinh dầu c a hương nhu trắng (Ocimum gratissimum) and gừng (Zingiber officinale) giúp cải thiện phản ứng miễn dịch chống ại S agalactiae (Brum và ctv, 2017)

Các loại thảo dược hứa hẹn tiềm năng trở thành nguồn cung cấp các liệu pháp chữa bệnh trong nuôi trồng th y sản do có nhiều ưu điểm như: phổ biến, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn cao, có khả năng ích thích hệ miễn dịch tự nhiên c a vật ch (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2009), khả năng phân h y sinh học và an toàn hơn so với kháng sinh, thân thiện với môi trường và không gây nên hiện tượng đề kháng thuốc (Jeney và ctv, 2015) Trong các phương pháp sử dụng

thảo dược trên th y sản gồm bổ sung vào thức ăn ngâm cá trong dịch chiết, tiêm dịch chiết vào xoang bụng cá (Stratev và ctv, 2018) thì phương pháp bổ sung chiết xuất thảo dược vào thức ăn cho cá có nhiều ưu điểm (tính kinh tế cao, không gây stress cho th y sản nuôi, sử dụng được trên bất kỳ giai đoạn nuôi nào c a th y sản …) và là cách hiệu quả nhất (Galindo-Villegas và Hosokawa, 2004; Isnani và ctv, 2021) Tuy nhiên không phải lúc nào việc bổ sung này cũng giúp đối tượng nuôi nâng cao hệ miễn dịch hoặc đạt được sự tăng trưởng tốt nhất (Galindo-Villegas

và Hosokawa, 2004; Ndong và ctv, 2007)

Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng thảo dược để phòng trị bệnh nói chung và

do vi khuẩn S agalactiae nói ri ng đang dần được quan tâm, tuy nhiên công trình

nghiên cứu sử dụng thảo dược như à một giải pháp để nâng cao sức đề kháng, khả

năng ph ng bệnh trên cá rô phi ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốn về số ượng Nghiên cứu này được tiến hành nhằm chọn ra loại cao chiết thảo dược có hiệu quả

kháng vi khuẩn S agalactiae gây bệnh trên cá rô phi và đánh giá ảnh hưởng c a

thảo dược n tăng trưởng, khả năng nâng cao miễn dịch … hi được bổ sung vào khẩu phần ăn c a cá

Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu giải pháp sử dụng cao chiết từ thảo dược bổ sung vào thức ăn như

là giải pháp hiệu quả phòng, trị bệnh trên cá rô phi, thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh

Mục tiêu cụ thể

Xác định được loại thảo dược và loại dung môi phù hợp để tạo ra cao chiết có

khả năng háng hiệu quả với vi khuẩn S agalactiae ở điều kiện in vitro

Đánh giá hiệu quả bổ sung cao chiết thảo dược vào thức ăn n tăng trưởng, tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch hông đặc hiệu và khả năng háng bệnh do vi

khuẩn S.agalactiae gây ra trên cá rô phi giống

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định khả năng háng vi huẩn gây bệnh S agalactiae ở điều kiện in vitro c a một số dịch chiết và cao chiết thảo dược

Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên tăng trưởng và khả năng

bảo vệ cá rô phi kháng lại vi khuẩn gây bệnh S agalactiae ở điều kiện in vivo

Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng c a cao chiết lên các chỉ tiêu máu, chỉ tiêu

miễn dịch và hình thái biểu mô ruột c a cá rô phi

Nội dung 4: Xác định hàm ượng hoạt chất chính và khảo sát tính kháng khuẩn

c a cao chiết thảo dược dựa tr n hàm ượng hoạt chất chính

Ý nghĩa

Kết quả c a nghiên cứu đóng góp thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho hướng nghiên cứu sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh cho động vật th y sản Nghiên cứu có tính ứng dụng thực tiễn cao, cung cấp một giải pháp phòng trị bệnh trên cá

rô phi hiệu quả thay thế cho việc sử dụng hóa chất, kháng sinh

Đối tƣợng nghiên cứu

Dịch chiết và cao chiết từ các loại thảo dược gồm: cây diếp cá (Houttuynia

cordata), c hành tím (Allium ascalonicum), lá kinh giới (Elsholtzia ciliata), vỏ

thân quế (Cinnamomum verum), c gừng (Z officinale) và c riềng (Alpinia

officinarum)

Ch ng vi khuẩn S agalactiae được phân lập từ cá rô phi (Oreochromis spp.)

có dấu hiệu bệnh lý thu tại huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai và huyện C Chi, thành phố Hồ Chí Minh (được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng th y sản II)

Những đóng góp mới của luận án

Nghiên cứu đã hẳng định được hiệu quả c a hai loại nguyên liệu thảo dược

gồm vỏ quế (C verum) và gừng (Z officinale) khi bổ sung vào thức ăn dưới dạng cao chiết trong việc hỗ trợ nâng cao khả năng kháng bệnh do vi khuẩn S agalactiae

gây ra trên cá rô phi giống

Nghiên cứu đã xác định hàm ượng hoạt chất cinnamic aldehyde chứa trong vỏ

quế (100 µg và 200 µg) có khả năng háng vi huẩn S agalactiae

Nghiên cứu đã xác định sự hiện diện tại huyện C Chi, Thành phố Hồ Chí

Minh c a ch ng vi khuẩn S agalactiae gây bệnh trên cá rô phi, thuộc CC283, kiểu

trình tự ST283 và mang các yếu tố độc lực quan trọng; đóng góp th m cơ sở dữ liệu

về kiểu trình tự c a các ch ng vi khuẩn phân lập được tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cá rô phi

1.1.1 Phân loại khoa học và nguồn gốc

Cá rô phi (Oreochromis spp.) thuộc bộ Perciformes, họ Cichlidae và là tên

chung được dùng cho ba chi cá được phân loại dựa trên tập tính sinh sản và nuôi giữ con (Beveridge và McAndrew, 2012)gồm: Oreochromis, Sarotherodon và Tilapia;

bao gồm hơn 70 oài trong đó có ít nhất tám oài được đưa vào nuôi (GISD, 2023) Hiện nay, cá rô phi chiếm khoảng 3,5% tổng sản ượng nuôi trồng th y sản toàn

cầu Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) à oài được nuôi phổ biến nhất (Gupta

và Acosta 2004), thịnh hành nhất vào năm 1960 - 1980 Cá rô phi vằn từ Nhật Bản được du nhập vào Thái Lan năm 1965 và từ Thái Lan chúng được đưa đến Philippines; được đưa vào Brazi vào năm 1971 và từ Brazi được đưa đến Hoa Kỳ vào năm 1974 Năm 1978 cá rô phi vằn được đưa vào Trung Quốc (FAO, 2009) Ở

Việt Nam cá rô phi sẻ (Oreochromis mossambicus) à oài rô phi đầu ti n được

người Pháp mang đến vào năm 1953 đến năm 1973 thì cá rô phi vằn được nhập vào

từ Đài Loan và trở thành oài rô phi nuôi chính tại Việt Nam hiện nay (Đỗ Đoàn

Hiệp và L Đình Xuân, 2006) Bên cạnh cá rô phi vằn, cá rô phi đỏ (Oreochromis

sp.) cũng à đối tượng nuôi phổ biến ở khu vực Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông

Cửu Long sau khi được nhập từ Ma aysia vào năm 1985 (Phạm Hồng Quân, 2013)

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Cá rô phi tăng trưởng tối đa ở nhiệt độ từ 25 đến 30°C (Meyer 2002) Khả

năng chịu nhiệt độ nước và độ mặn rất hác nhau giữa các oài Cá rô phi vằn (O

niloticus) chịu ạnh ém nhất và thích hí hậu nhiệt đới hơn cận nhiệt đới Cá rô phi

xanh (O aureus) có thể chịu được nhiệt độ thấp tới 8-9°C nên có nhiều hả năng

sinh sống ở các quốc gia có sự thay đổi nhiệt độ theo m a rõ rệt (Gupta và Acosta, 2004) Cá rô phi à oài ăn tạp ăn thực vật ph du thực vật th y sinh động vật hông xương sống nhỏ động vật đáy mảnh vụn và màng vi huẩn i n quan đến mảnh vụn Cá nuôi ao thành thục sinh dục sau 5-6 tháng và sinh sản bắt đầu hi nhiệt độ nước đạt 24°C Con cái trưởng thành đẻ trứng trong ổ, sau hi được con đực thụ tinh con cái ập tức thu trứng vào miệng để ấp cho đến hi túi noãn hoàng được hấp thụ ( hoảng 1 đến 2 tuần t y thuộc vào nhiệt độ nước) Số ượng trứng tỷ

ệ thuận với trọng ượng cơ thể c a con cái và ít hơn so với hầu hết các oài cá nuôi trong ao khác Nếu quá trình sinh sản không bị ìm hãm (do thời tiết ạnh), con cái

có thể sinh sản i n tục Cá rô phi có thể sống âu hơn 10 năm và đạt trọng ượng trên 5 kg (FAO, 2009)

Hình 1.1 Cá rô phi vằn (O niloticus) (Linnaeus, 1758) (Nguồn: FAO, 2009)

1.1.3 Tình hình sản xuất cá rô phi trên thế giới và ở Việt Nam

Cá rô phi thích nghi tốt với môi trường nuôi nhân tạo tăng trọng nhanh ở điều kiện tối ưu và sinh sản trong trang trại mà không cần quản lý hoặc cơ sở hạ tầng đặc biệt (Meyer, 2002) Nuôi cá rô phi à oại hình phổ biến nhất trong nuôi trồng th y sản tr n thế giới với sản ượng hoảng 3 5 triệu tấn và được báo cáo trong ít nhất

135 quốc gia và v ng ãnh thổ tr n tất cả các châu ục (FAO, 2014) Hơn 90% cá rô phi nuôi được sản xuất ở các nước đang phát triển ch yếu ở châu Á với hai oài

chính là cá rô phi vằn (O niloticus) và cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) ai giữa O

mossambicus và O niloticus (Boerlage và ctv, 2017) Một số quốc gia có sản ượng

nuôi cá rô phi lớn có thể kể đến như: Trung Quốc (quốc gia nuôi trồng và chiếm hơn 30% sản ượng cá rô phi toàn cầu năm 2015) Indonesia Ai Cập Phi ippines

Thái Lan và Việt Nam (FAO, 2017) Cá rô phi là một trong 15 loài nuôi th y sản chính trên toàn thế giới cả trong nước ngọt và nước mặn/lợ; sản ượng nuôi nước ngọt toàn cầu tăng từ 1.001,5 ngàn tấn (2000) lên 4.407,2 ngàn tấn (2020) và sản ượng nuôi nước mặn/lợ tăng từ 1,6 ngàn tấn (2000) lên 107,4 ngàn tấn (2020), lần ượt chiếm 9% và 1,3% trong tổng sản ượng năm 2020 (FAO 2022)

Việt Nam à nước sản xuất nuôi trồng th y sản ớn thứ 4 thế giới, sau Trung Quốc Ấn Độ và Indonesia Tại Việt Nam diện tích nuôi cá rô phi ngày càng mở rộng và gia tăng về sản ượng Năm 2015 diện tích nuôi cá rô phi hoảng 25.400 ha với sản ượng 182.000 tấn sản phẩm (Boerlage và ctv, 2017) Theo quy hoạch phát triển nuôi cá rô phi định hướng đến năm 2030, cá rô phi được xác định là sản phẩm

ch lực sau tôm nước mặn, lợ và cá tra (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2016) với diện tích nuôi cá rô phi cả nước đạt 40.000 ha (tăng 1 6 lần so với năm 2015 à 25.400 ha) và 1,8 triệu m3 lồng nuôi trên hệ thống sông và hồ chứa lớn; sản ượng đạt 400.000 tấn (tăng 2,2 lần so với năm 2015 là 182.000 tấn) trong đó 45 - 50% sản ượng đ tiêu chuẩn xuất khẩu B n cạnh đó Việt Nam à nước xuất hẩu th y sản

ớn thứ ba thế giới ể từ năm 2014 (FAO, 2018 và 2022) Năm 2020 giá trị hàng hóa th y sản xuất hẩu c a Việt Nam đạt 8 5 tỷ USD, chiếm 5 6% tổng giá trị toàn cầu (FAO, 2022) Thời gian qua từ một oài cá ch yếu ti u thụ nội địa cá rô phi đã trở thành một trong các đối tượng xuất hẩu với số ượng thị trường tăng từ 8 n 68 nước ch yếu gồm Mỹ Co ombia và EU (Boerlage và ctv, 2017)

1.2 Tổng quan về vi khuẩn S agalactiae

1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa

Streptococcus agalactiae (hay i n cầu nhóm B – Group B Streptococcus,

GBS) à một oài thuộc chi Streptococcus, ần đầu ti n được phân biệt với các i n

cầu huẩn hác bởi Lancefie d (1933) sau hi được phân ập từ sữa và b bị vi m

vú Đây à một oại vi huẩn Gram dương, có dạng hình cầu hoặc hình trứng với ích thước đường ính từ 0 5 đến 2,0 µm, hông di động hông sinh nha bào ỵ

hí t y tiện âm tính với oxidase và catalase (Amal và Zamri-Saad, 2011)

Hình 1.2 Vi khuẩn S agalactiae

(Nguồn: https://www.cdc.gov/streplab/groupb-strep/index.html)

1.2.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

Vi huẩn S agalactiae được truyền từ cá bệnh sang cá hỏe thông qua con

đường hấp thụ ại qua đường miệng phân có chứa vi huẩn được cá bệnh thải ra môi trường (Ama và Zamri-Saad 2011) hoặc tiếp xúc trực tiếp với cá bệnh hoặc cá chết cũng như tiếp xúc gián tiếp qua nước trong các hệ thống nuôi (Boerlage và

ctv, 2017) Bệnh i n cầu huẩn ở cá do S agalactiae gây ra có đặc điểm à nhiễm

tr ng huyết và viêm màng não (Mian và ctv, 2009) Khi cá bị nhiễm vi huẩn S

agalactiae sẽ xuất hiện một số dấu hiệu như: cơ thể sẫm màu giảm ăn hả năng bắt

mồi kém, phản ứng chậm với tiếng động bơi mất phương hướng, bất thường (xoắn

ốc xoay v ng) và tập trung trên mặt nước, tuy nhiên không phải tất cả cá bị nhiễm bệnh đều có biểu hiện bất thường (Yanong, 2002); mắt lồi đục và xuất huyết, những trường hợp bệnh nặng mắt có thể bị rơi ra hỏi hốc mắt, bên trong có chứa dịch màu vàng; xuất huyết tr n thân hoặc ở gốc vây, xương nắp mang; các nội quan gan, thận và tỳ tạng sưng to mềm nhũng và xuất huyết; bụng trương to (Musa và ctv, 2009)

Streptococcus spp sản sinh các loại enzyme ngoại bào (fibrinolysin,

hyaluronidase, DNase, ) và các độc tố ngoại bào (streptolysine O, streptolysine S, ) giúp vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống máu và các cơ quan b n trong cơ thể

Trên bề mặt Streptococcus spp tồn tại chất gọi à protein M i n quan đến sự đề

kháng quá trình thực bào c a bạch cầu trung tính (Phạm Hồng Sơn 2008) Ở giai đoạn cấp tính, vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống máu và tất cả các cơ quan nội tạng (Chang và P umb 1996) do đó hi tiến hành mổ cá bệnh sẽ thấy b n trong cơ thể xuất hiện nhiều vùng bị hoại tử, tỳ tạng tăng n về thể tích, gan nhạt, xuất huyết

não (Wanman và ctv, 2005) Trên cá rô phi vằn nhiễm S agalactiae mãn tính, quan

sát trong phần cơ nằm sát phần xương sống thấy có sự xuất hiện c a các khối u

(màu vàng nâu hoặc màu đỏ sẫm) (Siti-Zahrah và ctv, 2004)

1.2.3 Phân nhóm và độc lực của vi khuẩn S agalactiae

vi khuẩn S agalactiae còn có thể phân nhóm theo kiểu gen (sequence types, ST,

kiểu trình tự gen), bằng cách xác định phân loại nhỏ hơn dưới loài bằng giải trình tự gen đa điểm (multi-locus sequence typing, MLST) (Kannika và ctv, 2017) Mặc dù

S agalactiae có 1.349 oại trình tự tr n toàn thế giới (PubMLST, 2019) nhưng các

ST được tìm thấy từ S agalactiae được phân ập từ cá chỉ bao gồm sáu oại: ST7,

ST260, ST261, ST283, ST491 và ST500 (Delannoy và ctv, 2013; Kayansamruaj và ctv, 2019) Cho đến nay các ch ng phân ập được từ cá uôn được phát hiện thuộc

về ba phức hợp ch ng ri ng biệt (c ona comp ex CC) mỗi phức hợp c n i n ết với một iểu huyết thanh hác nhau gồm CC7 với iểu huyết thanh Ia (CC7/Ia)

CC283 với iểu huyết thanh III (CC283/III) và CC552 với iểu huyết thanh Ib (CC552/Ib) (Delannoy và ctv, 2021) Ch ng có iểu huyết thanh Ia (thuộc CC7) có thể được tìm thấy ở cá và ếch với phạm vi phân bố từ Tây Châu Á đến Đông Nam

Á và Trung Quốc; trong hi đó ch ng có iểu huyết thanh Ib (thuộc CC552) cũng được tìm thấy ở cá và ếch nhưng phân bố rộng rãi tr n toàn cầu và xuất hiện ở châu

Mỹ Châu Phi Trung Đông Châu Âu và Úc Kiểu huyết thanh III à duy nhất liên quan đến CC283 tìm thấy cả ở người và các oài biến nhiệt ch yếu xảy ra ở Đông Nam Á (Phuoc và ctv, 2021) Ngoài ra năm 2021 Delannoy và ctv đã ghi nhận

nhiều đợt bùng phát bệnh do S agalactiae CC2/IV ở cá rô phi nuôi tại Bắc Phi

Tại Việt Nam, hiện chỉ mới xác định được kiểu huyết thanh c a các ch ng vi

khuẩn S agalactiae được phân lập từ các mẫu cá rô phi có dấu hiệu xuất huyết và phù mắt tại khu vực miền Nam (tỉnh An Giang Đồng Tháp) là kiểu huyết thanh III,

ST283 (thuộc CC283) và tại Trung Bộ (tỉnh Thừa Thiên – Huế) là Ib, ST1395

(ST1395 là một biến thể c a ST261 và được phân oại à một phần c a CC552)

(Phuoc và ctv, 2021) Tại miền Bắc, hoàn toàn chưa nghi n cứu và xác định được

kiểu huyết thanh c a các ch ng vi khuẩn S agalactiae gây bệnh (Đoàn Thị Nhinh

và ctv, 2022)

1.2.3.2 Các yếu tố độc lực

Vi huẩn S agalactiae cũng giống như nhiều oài gây bệnh hác sở hữu nhiều

yếu tố độc ực yếu tố sinh học phân tử thúc đẩy hả năng ây nhiễm và/hoặc gây

hại cho vật ch Các yếu tố quan trọng tạo n n độc ực c a S agalactiae có thể ể

đến gồm: cấu trúc ớp vỏ CPS ( i n quan đến iểu huyết thanh) yếu tố CAMP,

HAase (hyaluronidase), cylE và một số gen độc lực khác Nghiên cứu c a Lin và ctv

(2011) cho thấy, cấu hình gen độc lực (virulence gene profiles) c a S agalactiae có

thể được xác định bằng đặc điểm iểu gen dựa tr n 14 gen độc ực được tìm thấy ở các ch ng phân ập từ con người và được phân oại thành ba nhóm dựa theo cấu hình (cụ thể ở Bảng 1.1) Trong đó nhóm xâm ấn đóng vai tr quan trọng trong yếu tố sinh bệnh tạo điều iện cho vi huẩn xâm nhập tế bào vật ch ; phổ biến nhất

là gen cfb (CAMP factor) và cylE (β-hemolysin/cytolysin) (Zhang, 2021)

Bảng 1.1 Các nhóm gen độc lực c a vi khuẩn S agalactiae (Lin và ctv, 2011)

1 Bám dính

Chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập cơ thể cá

 Cấu trúc ớp vỏ CPS: mỗi iểu huyết thanh c a ch ng vi huẩn mang các gen độc ực hác nhau (Kanni a và ctv 2017) và sự hiện diện c a các gen độc ực

à một trong hai cơ sở để xác định mức độ độc ực c a một vi huẩn b n cạnh hả năng gây bệnh cho cá thí nghiệm sau hi cảm nhiễm với vi huẩn (Đoàn Thị Nhinh

và ctv 2022) Các nghi n cứu gần đây cho thấy có mối tương quan giữa nhóm gen

độc ực c a vi huẩn S agalactiae với iểu huyết thanh và ết quả ây nhiễm thực

nghiệm (Legario và ctv, 2020)

 Yếu tố CAMP: c n gọi à co-hemolysin, được mã hóa bởi gen cfb Đây à protein ngoại bào 23 5 Da, có chức năng thúc đẩy quá trình sinh bệnh Tác động gây bệnh c a CAMP bao gồm quá trình tự oligome hóa, gắn nó vào thành các protein gắn với g ycosy phosphatidy inosito (GPI) có thể thúc đẩy quá trình y giải

tế bào (Zhang, 2021)

 HAase (hyaluronidase): được mã hóa bởi gen cylB, thúc đẩy sự xâm ấn c a

vi huẩn vào vật ch bằng cách tiết ra HAase để th y phân axit hya uronic thành

axit không bão hòa Vi huẩn S agalactiae sử dụng HAase để chống ại phản ứng

miễn dịch c a vật ch (Zhang, 2021)

 CyIE: các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đây là một yếu tố độc lực ảnh hưởng

đến sự sống sót c a S agalactiae trong đại thực bào (Sagar và ctv, 2013) và thúc

đẩy sự lây nhiễm c acác ch ng ít hoặc không tan huyết nhờ khả năng trốn tránh hệ miễn dịch c a vật ch và không hoạt động bên trong đại thực bào cho đến khiđiều kiện thích hợp để chúng hoạt động trở lại Sự hiện diện c a cyIE trong ch ng S

agalactiae huyết thanh Ia được cho à thúc đẩy sự xâm lấn (Chu và ctv, 2016), hỗ

trợ lây lan nhanh trong máu và các cơ quan c a vật ch bị nhiễm bệnh Trên cá, sự

vắng mặt c a cyIE được coi là một yếu tố tạo nên sự phát triển c a nhiễm trùng mãn tính (Li và ctv 2014) Đối với các ch ng S agalactiae huyết thanh Ib (không gây

tan huyết), dấu hiệu c a một nhiễm trùng mãn tính được thể hiện qua việc quan sát thấy nhiều tế bào đại thực bào chứa vi khuẩn trong não (Legario và ctv, 2020)

1.2.4 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S agalactiae gây ra

1.2.4.1 Đối với động vật thủy sản

Sự bùng phát bệnh do Streptococcus spp gây ra xảy ra ở nhiều loài cá nuôi và

trên toàn cầu (Mishra và ctv, 2018), làm tổn thất hoảng 250 triệu USD trên toàn

thế giới mỗi năm (Amal và Zamri-Saad, 2011) Bệnh do Streptococcus spp (Streptococcal disease) gây ra trên cá được báo cáo lần đầu ti n vào năm 1957 tr n

cá hồi cầu vồng tại Nhật Bản (Hoshina và ctv, 1958) Kể từ đó Streptococcosis là một bệnh phổ biến ảnh hưởng đến nhiều oài cá hác nhau tr n toàn thế giới bao gồm cá nước ngọt nước ợ và nước mặn: cá hồi, cá trích, cá rô phi, cá basa, cá chẽm cá mú cá bơn Nhật Bản cá tráp, cá chim bạc (Roberts, 2012) Ở một số

loài cá cảnh, Streptococcus spp cũng đã được tìm thấy từ mẫu phân lập Bệnh do

Streptococcus spp gây tỷ ệ chết cao (trên 50%) trong hoảng thời gian từ 3 đến 7

ngày Tuy nhi n một số đợt b ng phát có tính chất mãn tính hơn và tỷ ệ tử vong có thể éo dài trong hoảng thời gian vài tuần chỉ có một vài con cá chết mỗi ngày(Yanong, 2002)

Vi huẩn S agalactiae và S iniae là hai loài trong nhóm Streptococcus gây ảnh hưởng chính đến ngành nuôi trồng th y sản (Evans và ctv, 2002) Streptococcus

agalactiae được báo cáo đầu ti n tr n cá nuôi nước ngọt vào năm 1966 (Robinson

và Meyer, 1966), còn S iniae lần đầu ti n được phân lập từ một tổn thương da c a

cá thể cá nuôi sông Amazon (Inia geoffrenis) (Pier và Madin, 1976) Nhiều nghiên cứu đã phát hiện và khẳng định S agalactiae là nguyên nhân gây bệnh cho cá đặc

biệt à cá nước ngọt (Plumb, 1999) Các quốc gia Đông Nam Á (Anshary và ctv, 2014; Jantrakajorn và ctv, 2014; Barkham và ctv, 2019; Kayansamruaj và ctv, 2019;

Syuhada và ctv, 2020) và Trung Quốc (Li và ctv, 2014; Su và ctv, 2019) ghi nhận S

agalactiae à oài chính i n quan đến dịch bệnh do Streptococcus gây ra Tỷ lệ

quan sát được c a S agalactiae so với S iniae ở các quốc gia này là tương tự như

các báo cáo trên toàn thế giới đặc biệt là ở các vùng sản xuất cá rô phi chính khu vực Châu Á và Châu Mỹ Latinh (Liu và ctv, 2016)

1.2.4.2 Đối với cá rô phi

So với nhiều oài cá hác trong c ng môi trường nuôi, cá rô phi đã được xem

là có khả năng đề kháng tốt với các mầm bệnh Tuy nhiên, các nghiên cứu thời gian qua đã cho thấy nghề nuôi cá rô phi đang phải đối mặt với những thách thức ớn từ

các bệnh do vi huẩn Streptococcus spp., Flavobacterium columnare, Aeromonas

hydrophyla, Edwarsiella tarda gây ra (Abraham và ctv, 2019) Các đợt dịch bệnh

bùng phát ở các v ng nước ngọt nuôi cá rô phi tiếp tục đe dọa sản xuất toàn cầu và

làm thiệt hại kinh tế trầm trọng trên toàn thế giới (Mishra và ctv, 2018)

Streptococcus à một trong những nhóm vi huẩn đe dọa đáng ể đến nghề

nuôi cá rô phi (Lingam và ctv, 2021), và Streptococcosis đã được công nhận à một trong những bệnh vi huẩn nghi m trọng nhất trong nuôi cá rô phi, bao gồm khu vực Đông Nam Á (Kayansamruaj và ctv, 2020), thường gây tỷ ệ tử vong cao và

kéo dài (Yang và Li, 2009) Loài S agalactiae là vi huẩn chính ảnh hưởng đến

việc sản xuất cá rô phi trên thế giới (Zamri-saad và ctv, 2010) Nghiên cứu c a

Lauke (2007) cho thấy, vi khuẩn S agalactiae chiếm đa số 74,5% (219 mẫu tại 22

điểm thu) trong các mẫu nhiễm vi khuẩn tr n cá rô phi được thu thập tại các quốc

gia Đông Nam Á gồm: Indonesia, Singapore, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Trung

Quốc và Việt Nam, tiếp theo là S iniae (75 mẫu tại 14 điểm thu) Trong tổng số 500

mẫu phân lập từ 13 nước Châu Á và Châu Mỹ La tinh trong 8 năm thì có đến 82%

số mẫu được xác định là S agalactiae (Sheehanvà ctv, 2009), trong khi tại Thái Lan, tỷ lệ S.agalactiae được tìm thấy là 93% (112/120 mẫu) trong tổng số mẫu phân lập được trên cá rô phi vằn (O niloticus) (Wongtavatchai và Maisak, 2008)

Nhiều trang trại nuôi cá rô phi trên thế giới đặc biệt là các trang trại ở châu Á,

đã ghi nhận được nhiều đợt dịch bệnh do nhiễm S agalactiae (Musa và ctv, 2009)

Năm 2001 tại Thái Lan xuất hiện dịch bệnh làm chết khoảng 40-60% số ượng cá nuôi sau hai tuần nhiễm bệnh; tiếp đó trong năm 2002 và 2003 tại Indonesia cũng

đã xảy ra hiện tượng cá rô phi nuôi lồng bị chết; năm 2005 tiếp tục xuất hiện hiện tượng cá rô phi nuôi lồng ở một số hồ chứa bị chết tại Malaysia Vi khuẩn phân lập được từ những con cá rô phi bị nhiễm bệnh tại các địa điểm trên đều xác định hầu

hết là S agalactiae (Yuasa, 2008) Năm 2011 bệnh i n cầu huẩn gây thiệt hại 40

triệu đô a Mỹ cho ngành công nghiệp cá rô phi ở Trung Quốc do tỷ ệ mắc bệnh và

tử vong cao có thể n tới 80% (Zhang, 2021)

Tại Việt Nam, bệnh do S agalactiae được ghi nhận xuất hiện lần đầu tiên ở

một số cơ sở nuôi bè tại An Giang vào năm 2004 và àm chết cá rải rác (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương 2012b) Đợt dịch bệnh lớn nhất kể từ trước đến nay đối với nghề nuôi cá rô phi xảy ra vào năm 2009 tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (Hà Nội Hưng Y n Hải Dương Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh và

Hà Giang) (Đồng Thanh Hà và ctv., 2010), gây chết với tỷ lệ cao (90-100%) trên cá

rô phi giống và thương phẩm (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản I, 2017) Một

số đợt bệnh do S agalactiae gây ra đã được báo cáo xảy ra tại một số tỉnh khu vực

Đồng bằng sông Cửu Long, một số tỉnh miền Bắc và tỉnh Thừa Thiên – Huế (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương 2012b; Trương Đình Hoài và ctv 2014; Nguyễn Ngọc Phước và ctv., 2019)

1.3 Sử dụng thảo dƣợc phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp và S

agalactiae gây ra trên thủy sản

Tr n thế giới nhiều oại thảo dược và dung môi chiết xuất đã được hảo sát in

vitro để tìm ra oại có hiệu quả háng Streptococcus sp và S agalactiae Tại Việt

Nam nghi n cứu ứng dụng thảo dược để trị bệnh tr n động vật th y sản mới được phát triển thời gian gần đây và đang dần được quan tâm; tuy nhi n các nghi n cứu

sử dụng thảo dược để ph ng trị bệnh nâng cao tỷ ệ sống và miễn dịch do vi huẩn

S agalactiae gây ra tr n động vật th y sản nói chung và tr n cá rô phi nói ri ng vẫn

c n há hi m tốn các ết quả nghi n cứu chỉ mới dừng ại ở quy mô ph ng thí nghiệm Một số ết quả nghi n cứu bước đầu tìm ra được oại thảo dược có hả

năng háng Streptococcus spp và S agalactiae

1.3.1 Nghiên cứu khả năng kháng Streptococcus sp của thảo dƣợc

Một số thảo dược đã được d ng để khảo sát khả năng háng Streptococcus sp

Nghi n cứu c a Wei (2008) tiến hành trên một số loài thực vật nhiệt đới cho thấy,

chiết xuất methanol thô từ thân và lá rau má (Centella asiatica), lá tắc (Citrus

microcarpa), trái nhàu (Morinda citrifolia) và chiết xuất nước thô c a lá tắc có tác

dụng kháng Streptococcus; tuy nhiên, hiệu quả kháng khuẩn c a các chiết xuất này không cao (vòng kháng khuẩn 7 mm) Dịch chiết c gừng (Z officinale) được chiết xuất với dung môi nước và ethano 95% (200 mg/m ) tr n vi huẩn Streptococcus

sp cho thấy tiềm năng háng huẩn với đường ính v ng háng huẩn ần ượt 14,11 mm và 28 mm (Nader, 2010) Tại Việt Nam, Trương Thị Mỹ Hạnh (2008) đã

xác định dịch chiết lá hẹ (Allium tuberosum) có khả năng háng vi huẩn

Streptococcus sp cao, với đường ính v ng háng huẩn đạt tr n 25mm tuy nhi n

hiệu quả tính háng huẩn c a hẹ giảm mạnh hi có tác động c a nhiệt độ ở 150°C đường ính v ng háng huẩn chỉ đạt 5mm; Trần Ngọc H ng và Trương Thành

Vinh (2012) tìm thấy tính kháng khuẩn đối với Streptococcus spp gây bệnh trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) c a dịch ép c a lá

ổi (Psidium guajava) và cây cỏ mực (Eclipta prostrata L.), với đường ính v ng

háng huẩn ần ượt à 20 63 mm và 12 44 mm

Đối với vi khuẩn S agalactiae, nhiều ết quả nghi n cứu dịch chiết thảo dược

bằng dung môi nước đã được công bố Dịch chiết c a lá xuyên tâm liên

(Andrographis paniculata) và c a cây duối nhám (Streblus asper) cho đường kính

vòng kháng khuẩn lần ượt là 27,5 mm và 23,1 mm, giá trị MIC đạt 31,25 µg/ml và

và 125 µg/ml (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010); dịch chiết từ vỏ quế

(C verum) cho đường kính vòng kháng khuẩn đạt 18 mm, giá trị MIC đạt 150 µg/ml trong khi dịch chiết c a tỏi (Allium sativum), nụ hoa đinh hương (Eugenia

caryphyllus) và lá cỏ xạ hương (Thymus vulgaris) cho hiệu quả thấp hơn (A said và

ctv, 2010); dịch chiết c a lá, quả và vỏ bưởi (Citrus grandis) có tác dụng ức chế

tương tự kháng sinh Enrofloxacin (Wongthai và ctv, 2011); dịch chiết lá chùm ngây

(Moringa oleifera) cho đường kính vòng vô khuẩn đạt 13,1 mm (Kamble và ctv,

2014) Gần đây nhất ết quả nghi n cứu c a Guo (2019) thực hiện tr n 115 oại thảo dược chiết xuất với dung môi nước cho thấy dịch chiết c a á sâm Hàn Quốc

(Panax ginseng), nụ hoa im ngân (Lonicera japonica) trái c a cây mã đậu inh (cây nhạc ngựa) (Aristolochia debilis) hạt cau (Areca catechu) vỏ thân cây huyết đằng hoa trắng (Spatholobus suberectus) rễ cây thảo đại thanh (Isatis indigotica) có hiệu quả trong việc điều trị nhiễm huẩn do S agalactiae gây ra tr n cá rô phi vằn

B n cạnh dung môi nước một số dung môi hác cũng bước đầu được hảo sát Trong dung môi ethanol, dịch chiết c a trái ổi cho đường kính vòng kháng khuẩn là 25,4 mm, giá trị MIC đạt 62,5 µg/ml (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010); dịch chiết từ các loại thảo dược đặc hữu c a Trung Quốc

gồm hoàng liên chân gà (Coptis chinensis), hoàng cầm (Scutellaria baicalensis), cốt

hí c (Polygonum cuspidatum) và địa du (Sanguisorba officinalis) cho thấy tiềm

năng trong ức chế vi huẩn S agalactiae ở điều iện in vitro (Peng và ctv, 2014);

cao khô dịch chiết lá trầu không (Piper betle) với nồng độ 100 mg/ml có khả năng

ức chế vi khuẩn S agalactiae mạnh nhất ở điều iện in vitro khi chiết xuất với dung

môi ethanol (Trịnh Thị Trang và Nguyễn Thanh Hải, 2016) Trong dung môi methanol, nghiên cứu c a Castro và ctv (2008) sử dụng lá c a một số thảo dược đặc

hữu c a Brazil (gồm Calyptranthes clusiifolia, Croton floribundus, Heisteria

silvianii, Merremia tomentosa, Zanthoxylum riedelianum) để khảo sát, kết quả cho

thấy đường kính vòng kháng khuẩn đạt khoảng 7-8 mm Trong một số dung môi

hữu cơ hác dịch chiết bằng dung môi chloroform c a lá sầu đâu (Azadirachta

indica) cho đường kính vòng vô khuẩn đạt 12,2 mm (Kamble và ctv, 2014)

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy nước và ethanol là các dung môi cho dịch

chiết có tác dụng kháng S.agalactiae trong đó dịch chiết với ethanol cho kết quả

đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn Bên cạnh đó dung môi methano chloroform chưa được khảo sát nhiều trên vi khuẩn S agalactiae

1.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thảo dược lên tăng trưởng, sức khỏe của cá

Đối với th y sản, bên cạnh khả năng háng huẩn, các chiết xuất thảo dược còn có tác dụng kích thích ăn ngon giúp tăng trưởng, cải thiện sức khỏe và hệ miễn dịch, giảm căng thẳng (Reverter và ctv, 2014; Jeney và ctv, 2015) Theo Stratev và ctv (2018), các phương pháp sử dụng chiết xuất thảo dược trên cá gồm bổ sung vào thức ăn ngâm cá trong dịch chiết, tiêm dịch chiết vào xoang bụng cá; trong đó phương pháp bổ sung chiết xuất thảo dược vào thức ăn cho cá là cách hiệu quả nhất (Isnani và ctv, 2021)

Hệ miễn dịch là một mạng ưới gồm nhiều tế bào mô cơ quan và các chất giúp chống lại nhiễm trùng (Kordon và ctv, 2018); bao gồm miễn dịch hông đặc hiệu và miễn dịch đặc hiệu Ngày càng có nhiều nghiên cứu về hiệu quả c a thảo dược trong việc giúp cải thiện tăng trọng, kích thích miễn dịch trên th y sản được tiến hành Thí nghiệm c a Yin và ctv (2006) cho thấy một chế độ ăn có bổ sung

0,1% và 0,5% hoàng ỳ (Radix astragalus) tr n cá rô phi vằn ba tháng tuổi đã làm

tăng hàm ượng lysozyme sau 1 tuần àm tăng hoạt động thực bào sau 3 tuần, còn hoạt động hô hấp c a các tế bào thực bào hông tăng n Tuy nhi n hi được cho

ăn thức ăn có bổ sung hoàng cầm (Radix scutellariae) với tỷ lệ 0,5% và 1,0% thì

cho thấy lysozyme, hoạt tính thực bào và hoạt tính chống oxy hóa đều bị ức chế Một số nghiên cứu khác trên cá rô phi cho kết quả cải thiện tăng trưởng miễn dịch tương tự nghi n cứu bổ sung hoàng ỳ c a Yin và ctv (2006) như: cá rô phi lai

(O.niloticus x O.aureus) được cho ăn hẩu phần ăn có bổ sung 0 5% tỏi trong 4 tuần (Ndong và ctv, 2007); cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) ăn thức ăn bổ sung tỏi trong

14 ngày (Mai Thanh Thanh và Bùi Thị Bích Hằng, 2018); cá rô phi vằn ăn thức ăn

có bổ sung các oại tinh dầu c a húng quế (Ocimum basilicum) và gừng (Brum và

ctv, 2017), chiết xuất từ á trà m (Excoecaria agallocha) (Abdul và ctv, 2020) Bên

cạnh hả năng cải thiện một số chỉ ti u miễn dịch thảo dược c n được ghi nhận giúp làm nâng cao tỷ lệ sống, có tác dụng phòng bệnh hi được bổ sung vào thức ăn như ết quả thí nghiệm trên một số thảo dược như: bột lá xuyên tâm liên, dịch chiết

vỏ quế, chiết xuất từ lá trà m , tỏi (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2009;

Alsaid và ctv, 2010; Mai Thanh Thanh và Bùi Thị Bích Hằng, 2018; Abdul và ctv,

2020); một số tinh dầu (tỏi cô đơn trầu không, gừng), cây khổ sâm (S flavescens)

và cây hương thảo (R officinalis) (Ataguba và ctv, 2018; Brum và ctv, 2017; Wu và

ctv, 2013; Zilberg và ctv, 2010)

Nghiên cứu c a Emmanuel và ctv (2018) sử dụng hỗn hợp gồm hoàng kỳ

(Astragalus membranaceus) đương quy (Angelica sinensis) và Crataegus

hupehensis (một loại thực vật gần với táo mèo) được phối trộn theo tỷ lệ 1:1:1 và

được bổ sung vào thức ăn (10g/ g thức ăn) cho cá rô phi vằn trong 4 tuần Kết quả

đã ghi nhận sự gia tăng đáng ể trọng ượng, tốc độ tăng trưởng, giảm FCR, gia tăng các thông số miễn dịch so với nhóm ăn thức ăn hông bổ sung hỗn hợp Nhóm nghiên cứu c a Doan (2019) đã tiến hành một số nghiên cứu về ảnh hưởng c a thảo dược lên cá rô phi vằn Các thảo dược được bổ sung vào chế độ ăn c a cá gồm: bột

c a cây ưỡi cọp (Boesenbergia rotunda) với các tỷ lệ 5, 10, 20 và 40 g/kg thức ăn (Doan và ctv, 2019a); chiết xuất c a cúc chỉ thiên (Elephantopus scaber) với các

mức 0, 2, 5, 10 và 20 g/kg thức ăn (Doan và ctv, 2019b); chiết xuất c a trà xanh

(chè xanh) (Camellia sinensis) với các mức 1, 2, 4 và 8 g/kg thức ăn (Doan và ctv, 2019c) Sau thời gian thí nghiệm đã cho thấy hiệu quả kháng bệnh do S agalactiae,

có sự tăng đáng ể ở nhóm ăn thức ăn bổ sung các loại thảo dược đối với một số thông số miễn dịch (lysozyme, hoạt tính chống chất oxy hóa, hoạt tính thực bào …) thúc đẩy tăng trưởng (trong đó mức bổ sung 5 g/kg thức ăn đối với chiết xuất c a cúc chỉ thiên, 10 g/kg thức ăn đối với bột ưỡi cọp, 2 g/kg thức ăn đối với chiết xuất trà xanh cho hiệu quả cao nhất)

Tuy nhiên, việc bổ sung vào thức ăn các chất kích thích miễn dịch hoặc các thành phần đã được chứng minh có vai trò giúp kháng bệnh tốt nhất không phải lúc nào cũng giúp đối tượng nuôi nâng cao hệ miễn dịch hoặc đạt được sự tăng trưởng tốt nhất (Galindo-Villegas và Hosokawa, 2004) Nghiên cứu c a Ndong và ctv (2007) đã thí nghiệm trên cá rô phi lai trong 4 tuần với khẩu phần ăn có 0 5% tỏi cho thấy có tác dụng nâng cao miễn dịch nhưng hông cải thiện tăng trưởng Một

nghiên cứu hác cũng cho thấy, sự có mặt c a đinh hương (Syzgium aromaticum)

trong thức ăn ảnh hưởng đến tăng trọng c a nhiều loài th y sản (Mohan, 2004)

1.4 Đáp ứng miễn dịch trên cá xương và tác động của thảo dược lên hình thái biểu mô của cá

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch trên cá xương

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương (2007) đáp ứng miễn dịch

tr n cá xương gồm:

- Cơ chế bảo vệ hông đặc hiệu, gồm: các hàng rào bề mặt (dịch nhờn, da, mang) và các yếu tố miễn dịch hông đặc hiệu (các nhân tố ức chế sinh trưởng như: transferin, interferon, lysine trong bổ thể, protein phản ứng C và lectin) Bên cạnh

đó hàng rào tế bào (đại thực bào, bạch cầu trung tính) cũng đóng vai tr quan trọng trong miễn dịch hông đặc hiệu trên cá, tuy nhiên so với ở người và động vật bậc cao thì chức năng và cơ chế hoạt hóa c a các tế bào này ở cá c n chưa được nghiên cứu sâu

- Cơ chế bảo vệ đặc hiệu, gồm: cơ quan ympho (với thận à nơi xảy ra quá trình bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứng miễn dịch), đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào đáp ứng miễn dịch cục

bộ ở mang đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da, và đáp ứng miễn dịch cục bộ ở dịch nhầy

1.4.2 Tác động của thảo dược lên hình thái biểu mô của cá

Hình thái mô học c a ruột phản ánh sức hỏe c a cá do i n quan đến hả năng hấp thu chất dinh dưỡng và chức năng miễn dịch (Nicholson và ctv, 2012) Chỉ số nhung mao dài biểu thị cho hả năng hấp thụ hiệu quả và đường ruột hỏe

mạnh (Va adao ctv, 2017) trong hi đó ớp cơ ni m mạc có vai tr thúc đẩy nhu động ruột (Liu và ctv, 2018) Các nghi n cứu đã công bố đều cho rằng hầu hết các sản phẩm thảo dược được bổ sung vào chế độ ăn c a cá hông gây ra bất ỳ sự thay đổi bất ợi nào đến hình thái ruột c a cá được quan sát (Agbebi và ctv, 2013; Lewis

và ctv, 2019) Các nghi n cứu gần đây đều chứng minh rằng thảo dược giúp cải

thiện sức khỏe đường ruột trên cá rô phi như: bổ sung bột lá táo ta (Ziziphus

mauritiana) vào thức ăn trong 12 tuần (Amin và ctv., 2019); bổ sung chiết xuất lá

cúc mai (Tridax procumbens) trong hẩu phần ăn trong 8 tuần (Adeshina và ctv., 2021); bổ sung chiết xuất bột quả me (Tamarindus indica L.) vào thức ăn trong 84

ngày (Adeniyi và ctv., 2022)

1.5 Giới thiệu các loại thảo dƣợc sử dụng trong nghiên cứu

 Cây diếp cá (H cordata)

Diếp cá là loại cây thảo, cao 20-40cm Thân ngầm mọc bò ngang trong lòng đất, màu trắng hơi có ông bén rễ ở các mấu Thân đứng nhẵn, màu lục hoặc tím

đỏ Lá mọc so e hình tim đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu tím, cuống lá dài, có bẹ Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành bông dài 2-2,5 cm, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt, bao bởi 4 lá bắc màu trắng Quả nở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn Diếp cá phân bố ch yếu ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới c a châu

Á như Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á hác Diếp cá có tác lợi tiểu do tác dụng c a chất quercitrin, làm chắc thành mao mạch; lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tang miễn dịch c a cơ thể (Đỗ Tất Lợi, 2004) Cây diếp cá có hoạt chất chính là decanoyl acetaldehyde (houttuynin),

flavonoids, quercetin; có hoạt tính kháng khuẩn (Streptococcus, Staphylococcus

aureus và Sarcina ureae), chống oxy hóa (Zhang và ctv, 2008; Sekita và ctv, 2016)

 Củ hành tím (A ascalonicum)

Hành tím thuộc loại cây thảo sống nhiều năm cao tới 50cm, có thân hành nhỏ, trắng hay nâu, chỉ hơi phồng, rộng 0,7-1,5cm Lá màu xanh mốc, hình trụ rỗng, có 3 cạnh ở dưới dài đến 30cm, có bẹ lá dài bằng 1/4 phiến Cán hoa (trục mang cụm

hoa) cao bằng lá Cụm hoa hình đầu tròn, gồm nhiều hoa có cuống ngắn; bao hoa có các mảnh hình trái xoan nhọn màu trắng có sọc xanh; bầu xanh đợt.Thường trồng ở rẫy và ở v ng đồng bằng Cây chịu được lạnh vào m a đông C hành tím được

d ng để trị cảm lạnh, giảm nhiễm tr ng đường tiết niệu, ổn định huyết áp, giảm sốt, tăng cường hệ miễn dịch (Đỗ Tất Lợi, 2004) C hành tím có hoạt chất chính là flavonoid, polyphenol; có hoạt tính kháng khuẩn rộng (Hendrich, 2006)

 Lá kinh giới (E ciliata)

Kinh giới là loại cỏ sống hằng năm m i hương rất thơm, thuộc họ thân thảo, cao 0,3-0,45m, thân nhẵn, mọc thẳng đứng Lá mọc đối, phiến lá thuôn nhọn, dài 5-

8 cm, rộng 3 cm mép có răng cưa cuống gãy dài 2-3 cm Hoa nhỏ, không cuốn, màu tím nhạt, mọc thành bông ở đầu cành Quả gồm 4 hạch nhỏ, nhẵn, dài 0,5 cm Kinh giới được trồng ch yếu ở các tỉnh phía Bắc Lâm Đồng, Thành phố Hồ Chí Minh Kinh giới được d ng để chữa cảm mạo, sốt, cúm, nhức đầu, hoa mắt, phong thấp đau xương đau mình vi m họng, nôn mửa, sởi, lở ngứa, mụn nhọt; sao đen chữa băng huyết, rong huyết, thổ huyết, chảy máu cam đại tiểu tiện ra máu (Đỗ Tất Lợi, 2004) Lá kinh giới có hoạt chất chính là thymol, carvacrol; có tác dụng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trên th y sản (Guo và ctv, 2012)

 Củ riềng (A officinarum)

C riềng thuộc loại cây thân thảo sống nhiều năm thích nghi nơi bóng râm nhưng ỵ ngập nước, có thể cao đến 1 2 m ra hoa tháng 4 đến tháng 9 Thân rễ mọc

bò ngang, dài, hình trụ có phân nhánh, vỏ màu đỏ nâu, ruột màu vàng sáng được gọi là c riềng Có dạng rễ chùm, mọc từ các đốt ở dưới gốc và từ thân rễ Lá không cuống hình mũi mác hẹp, dài 20 - 30cm, rộng 1,2 - 2 5cm; hai đầu đều nhọn, bẹ lá dạng vẩy, lưỡi bẹ dạng vẩy nhọn Cụm hoa hình chùy, mọc ở ngọn, dài 6 - 10cm, có lông mềm Quả hình cầu, có lông, rộng 1cm, màu hồng C riềng được trồng phổ biến ở nhiều nơi C riềng dùng làm gia vị và làm thuốc ích thích ti u hóa ăn ngon cơm chữa đầy hơi đau bụng đau dạ dày, sốt rét đi ỏng, trúng hàn nôn mửa (Đỗ Tất Lợi, 2004) C riềng có hoạt chất chính là terpinen-4-o ; được chứng minh có

phổ hoạt tính rộng từ kháng khuẩn đến nấm men, ký sinh trùng (Oonmetta-Aree và ctv, 2006)

 Vỏ thân quế (C verum)

Quế là một loại cây cao từ 12-20cm Cành mọc trong năm có 4 cánh dẹt, nhẵn Lá hơi hình trứng 2 đầu hẹp lại hơi nhọn, có ba gân rất rõ chạy từ cuống đến đầu lá, mặt dưới ph những vẩy nhỏ Phiến lá dài 12-15cm, rộng 5cm Cuống dài chừng 15mm Hoa màu trắng mọc thành chùy ở kẽ á hay đầu cành Quả hạch hình trứng dài chừng 1cm úc đầu xanh lục, khi chín ngả màu nâu tím, mặt quả bóng Quế phân bố rộng rãi khắp lãnh thổ Việt Nam từ biên giới phía Bắc đến tận miền Nam Quế có tác dụng tăng tiết nước bọt và dịch vị tăng cường chức năng ti u hóa làm giảm co thắt cơ trơn nội tạng, làm dịu cơn đau bụng do co thắt ruột Cinnamaldehyde còn có tác dụng ức chế sự hình thành loét bao tử ở chuột do kích thích Nước sắc nhục quế àm tăng ưu ượng máu động mạch vành tim cô lập c a chuột lang, cải thiện được thiếu máu cơ tim cấp c a thỏ do pituitrin gây nên (Đỗ Tất Lợi, 2004) Vỏ thân quế có hoạt chất chính là cinnamic aldehyde; có hoạt tính kháng khuẩn và điều hòa chức năng miễn dịch (Faikoh và ctv, 2014) đồng thời có khả năng háng mạnh với một số loài vi khuẩn gây bệnh trên th y sản (Dương Nhật Linh và ctv, 2010)

 Củ gừng (Z officinale)

Gừng là cây thân thảo, cao 0,6-1 m Lá mọc so le, không cuống, hình mác dài,

có m i thơm Trục hoa xuất phát từ gốc, dài khoảng 20 cm Hoa màu vàng, thân rễ mập, phồng lên thành c C có màu vàng, mặt ngoài c có màu trắng tro hay màu nâu nhạt, trên thân c có đốt tròn và vết nhăn dọc rõ rệt C gừng có m i thơm vị cay nóng Gừng được trồng ở Việt Nam và một số nước như: Trung Quốc, Ấn Độ, Austra ia các nước Đông Nam Á Gừng có nhiều công dụng đối với con người như: chữa cảm mạo phong hàn, trị chứng khó tiêu, chân tay lạnh, khí huyết ngưng trệ … (Đỗ Tất Lợi, 2004) Đối với th y sản, c gừng có hoạt chất chính là 6-gingerol, có tác dụng kháng cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Ekwenye và ctv, 2005)

Do hiệu quả c a các hoạt chất trong thảo dược nên việc sử dụng thảo dược để phòng, trị bệnh, cải thiện tăng trưởng, miễn dịch đã cho thấy tiềm năng ớn trong khi ứng dụng vào nuôi trồng th y sản, mặc dù còn khá mới mẻ và non trẻ so với ứng dụng tr n người và chăn nuôi Kết quả c a các nghiên cứu trên thế giới và tại

Việt Nam đã tìm thấy nhiều loại thảo dược có khả năng háng vi huẩn S

agalactiae Đối với vi khuẩn S agalactiae gây bệnh trên cá rô phi (Oreochromis

spp.), các nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành khảo sát khá nhiều loại thảo dược, trong đó bao gồm cả các loại thảo dược đặc trưng đặc hữu Vỏ quế và hoạt chất

cinnamaldehyde có trong vỏ quế đã được báo cáo là có tác dụng kháng S

agalactiae ở điều kiện in vitro đồng thời giúp tăng tỷ lệ sống c a cá rô phi vằn

(Alsaid và ctv, 2010; Faikoh và ctv, 2014) C gừng được cho thấy là có tiềm năng

sử dụng để điều trị bệnh do một số vi khuẩn Gram âm gây ra như Pseudomonas

spp và Vibrio vulnificus (Đinh Thị Vân Chung, 2012; Nguyễn Thị Thanh và ctv, 2013), tuy nhiên mới chỉ ghi nhận kết quả khảo sát tác dụng kháng vi khuẩn S

agalactiae (Gram dương) ở dạng tinh dầu và chưa ghi nhận báo cáo nào về tác dụng

c a hoạt chất 6-gingerol trong c gừng

Các loại thảo dược trong tự nhiên rất phong phú đa dạng nên còn nhiều loại thảo dược chưa từng được nghiên cứu tr n động vật th y sản kể cả trên thế giới và tại Việt Nam Mặt khác, các nghiên cứu đã công bố cho thấy, có một số thảo dược

tuy có hiệu quả kháng S agalactiae tr n cá rô phi nhưng à oại nằm trong danh mục thảo dược độc hại (ví dụ như trái c a cây mã đậu linh, A debilis) hoặc là loại

có giá trị kinh tế cao (ví dụ như á sâm Hàn Quốc, P ginseng) Do đó việc tìm kiếm các thảo dược có khả năng háng S agalactiae mà lại phổ biến, dễ tìm, giá thành

thấp, không chứa chất gây hại hay thuộc danh mục thảo dược độc hại cần được thực hiện bởi nhiều nghiên cứu hơn nữa Và việc tìm kiếm nguồn thảo dược tiềm năng cần phải kế thừa từ các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước i n quan đến đặc

tính kháng khuẩn c a thảo dược, nhất à đối với vi khuẩn S agalactiae

1.6 Phương pháp chiết xuất thảo dược dùng trong nghiên cứu

1.6.1 Chiết ngấm kiệt