Nội dung nghiên cứu - Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học, ứng dụng về cây Bằng Lăng nước.. Do đó, việc nghiên cứu thành phần hó
Trang 1ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA HÓA HỌC
+
TRƯƠNG NHƯ Ý
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO CHIẾT
Trang 2ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA HỌC
+
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO CHIẾT
CHLOROFORM TỪ LÁ BẰNG LĂNG NƯỚC
(LAGERSTROEMIA SPECIOSA (L.)PERS.)
Ở KON TUM
SVTH: TRƯƠNG NHƯ Ý LỚP: 14SHH
GVHD: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG
Đà Nẵng - 2018
Trang 3ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA HÓA
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Trương Như Ý
Lớp : 14SHH
lá Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa(L.)Pers.) ở Kon Tum”
2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị
- Nguyên liệu: Quả Bằng lăng nước thu hái tại tỉnh Kon Tum
- Dụng cụ, thiết bị: bộ chiết chưng ninh, bình tam giác, cột sắc ký, bản mỏng sắc
ký, đèn UV, cân phân tích, bếp cách thủy, tủ sấy, lò nung…
3 Nội dung nghiên cứu
- Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học, ứng dụng về cây Bằng Lăng nước
- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, xử lý mẫu; các phương pháp chiết tách, định tính và phân lập các hợp chất từ thực vật
- Nghiên cứu phương pháp phổ để xác định thành phần hóa học, định danh và xác định cấu trúc
4 Giáo viên hướng dẫn: GS.TS Đào Hùng Cường
Trang 45 Ngày giao đề tài: 08/12/2017
6 Ngày hoàn thành: 23/04/2018
Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày … tháng 04 năm 2018 Kết quả điểm đánh giá:……
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Trang 5LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Đào Hùng Cường đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ trong suốt quá trình
thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giảng dạy và công tác tại phòng thí nghiệm khoa Hóa, đại học Sư phạm Đà Nẵng, đặc biệt là cô Võ Thị Kiều Oanh và thầy Trần Mạnh Lục đã hỗ trợ kiến thức, cơ sở vật chất, dụng cụ thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này
Đà Nẵng, ngày tháng năm 2018
Sinh viên thực hiện
Trang 6DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Trang 7MỤC LỤC
MỞ ĐẦU……….1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu 1
2.1 Đối tượng nghiên cứu 1
2.2 Mục đích nghiên cứu 2
3 Nội dung nghiên cứu 2
3.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 2
3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm 2
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
5 Bố cục đề tài 3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4
1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ BẰNG LĂNG VÀ CHI TỬ VI 4
1.1.1 Họ Bằng Lăng 4
1.1.2 Thực vật chi Tử vi 4
1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC 4
1.2.1 Tên gọi 4
1.2.2 Mô tả thực vật 5
1.2.3 Phân bố và cách trồng 5
1.3 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY BĂNG LĂNG NƯỚC 6
1.3.1 Dùng làm thuốc chữa bệnh 6
1.3.2 Tác dụng dược lý 7
1.3.3 Trồng làm cảnh 7
Trang 81.4 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỌ BẰNG LĂNG 7
1.4.1 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 7
1.4.2 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam 9
CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………11
2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 11
2.1.1 Thu mẫu và xử lý mẫu nguyên liệu 11
2.1.2 Khảo sát khối lượng cao chiết cồn trong mỗi loại nguyên liệu 11
2.1.3 Định tính một số nhóm chất trong dịch chiết cồn 12
2.1.4 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 14
2.2 CHIẾT RẮN–LỎNG NGUYÊN LIỆU VÀ CHIẾT LỎNG–LỎNG VỚI DUNG MÔI CHLOROFORM………16
2.3 PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO TỔNG CHLOROFORM 19
2.3.1 Sắc ký bản mỏng 19
2.3.2 Sắc ký cột 23
2.3.3 Chạy sắc ký bản mỏng để lựa chọn dung môi chạy sắc ký cột 26
2.3.4 Tiến hành sắc ký cột cao chloroform 27
2.4 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KẾT HỢP KHỐI PHỔ (GC-MS) 30
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……….33
3.1 KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM DẦM VÀ CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG – LỎNG… ……42
3.1.1 Kết quả điều chế tổng cao ethanol bằng phương pháp ngâm dầm… …42
3.1.2 Kết quả chiết phân bố cao ethanol bằng dung môi chloroform……… 34
Trang 93.2 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO CHIẾT ETHANOL VÀ CAO CHIẾT CHLOROFORM 373.3.KẾT QUẢ PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO CHLOROFORM TỪ CAO TỔNG ETHANOL 443.4.KẾT QUẢ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO CHIẾT CHLOROFORM VÀ PHÂN ĐOẠN … 48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… ….68 TÀI LIỆU THAM KHẢO………69
Trang 103.4 Thành phần nhóm chức trong cao chiết dung môi ethanol 96% 36 3.5 Thành phần nhóm chức trong cao chiết bằng dung môi chloroform 41
Trang 113.1 Điều chế tổng cao ethanol băng phương pháp ngâm dầm 33
3.3 Điều chế tổng cao chloroform bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 35 3.4 Biểu đồ phần trăm chất chiết của các lần chiết với chloroform 36
3.6 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với dung môi đơn 45 3.7 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi diclometane:
chloroform theo các tỷ lệ 10:0; 8:2; 6:4; 4:6; 2:8: 0:10
45
Trang 123.8 Các bình hứng dung dịch giải ly (17 ml) 46
Trang 13MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Trong vài chục năm trở lại đây, Đái tháo đường hay còn gọi là tiểu đường đang
là một trong mườ i nguyên nhân chính gây tử vong hàng đầu ở hầu hết các quốc gia trên thế giới; theo thống kê của Liên đoàn Tiểu đường thế giới, Đái tháo đường đã cướp đi mạng sống của 4,6 triệu người mỗi năm; nếu tính trung bình thì cứ 7 giây, trên thế giới lại có một người chết vì căn bệnh này; ngoài ra, bệnh Đái tháo đư ờng còn để la ̣i gánh
nă ̣ng đối với bản thân người bê ̣nh và cho xã hô ̣i trên n hiều phương diê ̣n (cả về mặt vật chất lẫn tinh thần ); PGS.TS Tạ Văn Bình- Chủ tịch Hội Người giáo dục bệnh tiểu đường Việt Nam, đã phát biểu : “Việt Nam không phải là quốc gia có tỷ lệ bê ̣nh tiểu đường lớn nhất thế giới, nhưng bệnh tiểu đường ở Việt Nam phát triển nhanh nhất thế giới” Một thực tế cho thấy, những người mắc bệnh Đái tháo đường ở nước ta đang có
xu hướng trẻ hóa, thường ở độ tuổi từ 30-65, cá biệt có bệnh nhân tiểu đường dưới 10 tuổi
Một trong những dược liệu quý chưa được nghiên cứu nhiều là cây Bằng Lăng nước (Lagerstroemia speciosa) Ở nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Philippin v.v… các chế phẩm từ lá Bằng Lăng nước thường xuyên được sử dụng để làm giảm mức đường huyết trong máu đối với những bệnh nhân Đái tháo đường Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bằng Lăng nước để tìm hiểu hoạt chất có tác dụng chữa bệnh, chứng minh cho hoạt tính của cây là công việc rất có ý nghĩa khoa học và
thực tiễn Vì vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học trong
lá cây Bằng Lăng nước (Lagerstroemia speciosa) ở Kon Tum”, với mục tiêu đóng
góp một phần tư liệu vào hệ thống các công trình khoa học về loài cây này
2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Lá Bằng Lăng nước thu hái tại thành phố Kon Tum
Trang 142.2 Mục đích nghiên cứu
- Tìm các điều kiện chiết tách thích hợp các chất từ lá Bằng Lăng nước
- Phân lập, xác định thành phần hóa học của một số dịch chiết từ lá Bằng Lăng nước
- Đóng góp thêm thông tin, tư liệu khoa học về loài Bằng Lăng nước, tạo cơ sở khoa học ban đầu cho các nghiên cứu về sau
3 Nội dung nghiên cứu
3.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
- Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học, ứng dụng về cây Bằng Lăng nước
- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, xử lý mẫu; các phương pháp chiết tách, định tính và phân lập các hợp chất từ thực vật
- Nghiên cứu tài liệu về các phương pháp phổ để xác định thành phần hóa học, định danh và xác định cấu trúc
3.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Chiết ngâm bằng dung môi ethanol 96%
- Chiết phân bố bằng dung môi có độ phân cực
- Phân lập các chất từ cao chiết chloroform bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng
- Dùng phương pháp khối phổ (GC-MS) để xác định các chất trong các phân đoạn
Trang 154 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Những kết quả có được trong đề tài nghiên cứu này sẽ là một nguồn tư liệu có ý nghĩa trong việc cung cấp thông tin về thành phần hóa học các cấu tử được chiết tách
từ loài Lagerstroemia speciosa, qua đó nâng cao giá trị và ứng dụng của chúng trong
ngành dược liệu
5 Bố cục đề tài
Luận văn bao gồm 60 trang, 11 bảng, 22 hình, 22 tài liệu tham khảo
Cấu trúc bài nghiên cứu như sau:
Mở đầu (3 trang)
Chương 1: Tổng quan (7 trang)
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (22 trang)
Chương 3: Kết quả và thảo luận (24 trang)
Kết luận và kiến nghị (1 trang)
Tài liệu tham khảo (3 trang)
Trang 16CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ BẰNG LĂNG VÀ CHI TỬ VI
1.1.1 Họ Bằng Lăng
Họ Bằng Lăng (hay Tử vi, Tường vi) là một họ khá lớn có tên khoa học là Lythraceae, bao gồm trên 500 loài thuộc 32 chi, đa số là cây thân thảo và một số cây thân bụi hoặc cây thân gỗ Các thực vật họ Lythraceae phân bố khắp toàn cầu.Vùng nhiệt đới là khí hậu “ưa thích” của loài này, tuy nhiên chúng cũng sinh sống tốt trong các khu vực có khí hậu ôn đới [4]
1.1.2 Thực vật chi Tử vi
Chi Tử vi (tên khoa học: Lagerstroemia) có khoảng 50 loài Cây thân gỗ hay
cây bụi, có nguồn gốc ở vùng Đông Á và Australia.Thân cây giống như gân tạo nếp máng, hàng năm đều lột vỏ Lá mọc đối, đơn và có chiều dài khoảng 5-20 cm Hoa mọc thành những cụm dài từ 20-40 cm, có màu trắng, hồng hoặc tím; cây nở hoa từ giữa mùa hè đến cuối hè Quả là dạng quả nang, ban đầu có màu xanh lục, khi chín chuyển thành màu đen, được mở rộng theo 6 hoặc 7 đường, tạo ra các răng giống như đài hoa và giải phóng nhiều hạt nhỏ có cánh Ở nước ta, chi Tử vi là một chi thảo mộc khá lớn, mọc nhiều nhất ở các rừng Đông Nam Bộ[2,3]
1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC
1.2.1 Tên gọi
Tên khoa học: Lagerstroemia speciosa L
Tên thông thường: Bằng Lăng nước, Bằng Lăng tím
Theo phân loại thực vật:
- Giới: Thực vật (Plantae)
- Bộ: Đào kim nương (Myrtales) Hình 1.1 cây Bằng lăng nước
Trang 17- Họ: Bằng Lăng (Lythraceae)
- Chi: Tử vi (Lagerstroemia) [2, 6 ,7].
1.2.2 Mô tả thực vật
Bằng Lăng nước có thân cây thẳng và khá nhẵn nhụi Lá màu xanh lục, dài khoảng từ
8 đến 15 cm, rộng từ 3 đến 7 cm, hình oval hoặc elip, lá rụng theo mùa Hoa màu tím hoặc tím nhạt, mọc thành cụm dài từ 20 đến 40 cm, thường thấy vào giữa mùa hè Mỗi bông hoa có 6 cánh, mỗi cánh dài chừng 2 đến 3,5 cm Quả lúc tươi màu tím nhạt pha xanh lục, mềm Quả già có đường kính 1,5 đến 2 cm, khô trên cây
Hình 1.2 Hoa, lá, quả già và lá khô của cây Bằng Lăng nước
1.2.3 Phân bố và cách trồng
Bằng Lăng nước có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Nam Á, hiện có nhiều ở Đông Nam Á, Ấn Độ và các vùng nhiệt đới khác Đây là loại cây thường sinh sống chủ yếu
Trang 18trong những kiểu rừng khô rụng lá, nửa rụng lá Cây đòi hỏi có độ đất dày, sâu và có
độ ẩm cao Bên cạnh đó, Bằng Lăng nước còn là cây đạt biên độ sinh thái khá rộng, thường hay mọc tại ven hồ, ven sông suối, ven các đầm nước ngọt Cây thường phân
bố tại những nơi có độ cao không quá 700m trên mực biển
Ở Việt Nam, Bằng Lăng nước là loại cây mọc hoang Cây thường phân bố chủ yếu ở những tỉnh thuộc Bắc Trung Bộ như Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Quảng Bình Một số tỉnh ở khu vực Tây Nguyên như Gia Lai, Đắc Lắc, Kon Tum cũng bắt gặp cây Bằng Lăng nước sinh sống và phát triển
Cây được trồng vào đầu mùa mưa (tháng 5,6) và được trồng dặm trước tháng 9 hàng năm Đất trồng cây Bằng Lăng nước phải có tầng đất mặt tơi xốp, dễ thoát nước, nếu đất có độ pH thấp, cần bón thêm vôi Trước khi trồng tiến hành đào hố trước ít nhất 1 tháng, kích thước hố và lượng phân bón lót tùy thuộc vào đất giàu hoặc nghèo dinh dưỡng, thông thường là 50 x 50 x 50cm, trộn đều lớp đất mặt với phân hữu cơ, NPK, phân bón lót, phân lân, vôi sau đó cho hỗn hợp đất phân xuống hố Công việc trên cần thực hiện trước khi trồng cây ít nhất nửa tháng
Mật độ trồng thích hợp từ 500 đến 834 cây/ha Cây cách cây 3m, hàng cách hàng 4m, hoặc cây cách cây 4m, hàng cách hàng 5m Sau khi trồng cần làm cỏ, xới đất kết hợp tủ gốc giữ ẩm cho cây 4-5 lần/năm.Trong 3 năm đầu khi cây chưa kép tán cần trồng thêm cây che bóng giữa các hàng để bảo vệ đất, nhằm tăng cường chất hữu cơ và giảm công làm cỏ Lượng phân bón trong 3 năm đầu như sau: phân chuồng 5-10kg, phân NPK 150g/gốc/năm Các năm sau tăng dần lượng phân lên, nên bón phân vào lúc làm cỏ và vun gốc vào đầu, giữa và cuối mùa mưa
1.3 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY BĂNG LĂNG NƯỚC
1.3.1 Dùng làm thuốc chữa bệnh
Bằng Lăng nước đã được dùng trong Y học dân gian ở Châu Mỹ, Ấn Độ, Philippines, để trị bệnh đái tháo đường và khá nhiều bệnh khác như trị ỉa chảy, tim
Trang 19mạch, mụn nhọt Trong Y học cổ truyền châu Á, người ta sử dụng lá Bằng Lăng nước làm trà uống hàng ngày để trị đau dạ dày và kiểm soát mức đường huyết Các chất trích
ly được thương mại hóa đôi khi cũng được dùng làm giảm mỡ, chống béo phì [8]
1.3.2 Tác dụng dược lý
Dược liệu này chứa ancaloit, flavonoit, saponin và cumarin Tanin trong vỏ với hàm lượng 30%, chủ yếu là catechin (23%) và một lượng nhỏ tanin gallickhoảng 7%
Vỏ Bằng Lăng nước đã được nghiên cứu dược lý với kết quả là cao lỏng của vỏ có tác
dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn [9] Shigella shigae, Bacillus subtilis,
Shigella flexneri, Salmonella typhi, Escherichia coli, Staphylloccus aures Cao này có
tác dụng chống một số nấm bệnh ngoài da như Epidermophyton inguinale,
Trichophuton rubrum và Cadida albicans Lá và quả già loài Bằng Lăng nước chứa
axit corosolic ở hàm lượng cao (axit corosolic được cho là hoạt chất chính làm hạ mức đường huyết) [10]
1.3.3 Trồng làm cảnh
Ở Việt Nam và một số nước châu Á, Bằng Lăng nước được trồng để tạo mỹ quan đô thị Trong tự nhiên, ngoài Bằng Lăng có hoa tím còn có hoa các màu đậm, nhạt, trắng, hồng, đỏ, Vào cuối thu nhiều giống cũng rụng lá vàng, lá đỏ như cây phong xứ lạnh
1.4 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HỌ BẰNG LĂNG
1.4.1 Các công trình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có một số các công trình nghiên cứu về tác dụng chữa bệnh đái tháo đường của một số thành phần có trong cây Bằng Lăng nước như công trình của Kakura, Garcia và một nhóm các nhà khoa học thuộc trường đại học Hirosima, Nhật Bản v.v…[11, 12]
Đầu năm 1940, Garcia đã công bố những nghiên cứu đầu tiên của mình về khả năng làm giảm hàm lượng đường huyết của cao đặc từ Bằng Lăng nước tương tự như
Trang 20insulin Sau đó, việc sử dụng rộng rãi cây Bằng Lăng nước ở Philippin được chú ý và được đưa sang Nhật Bản.Hiện nay,các nhà khoa học từ nhiều nước như Nhật Bản, Philippin, Mỹ, Hàn Quốc đang nghiên cứu về cây Bằng Lăng nước Cây Bằng Lăng nước đã trở thành phổ biến dưới nhiều hình thức như trà bảo vệ sức khỏe ở nhiều nước phía Đông Nam Á và nước Mỹ
Năm 1961, Carew D.P và Chin T.F đã làm các thí nghiệm để kiểm tra một số nhóm chất có trong lá Bằng Lăng nước ở Philippin và đã đi đến kết luận: Trong lá có tanin, glucozit trợ tim, flavonoit và sterol, không có ancaloit [13]
Đến năm 1996, Kakuda đã nghiên cứu về hoạt tính ngăn ngừa bệnh đái tháo đường của dịch cô được ngâm chiết từ cây Bằng Lăng nước Trong nghiên cứu này, Kakuda đã thấy rằng dịch chiết có thể làm giảm mức insulin, đường huyết và hàm lượng cholesterol trong máu Một nghiên cứu khác cũng thuộc nhóm nghiên cứu của Kakuda cho biết, một số thành phần trong cây Bằng Lăng nước có tác dụng làm giảm đáng kể cân nặng của các cơ thể béo phì, một trong những nguyên nhân phổ biến gây
ra bệnh tiểu đường
Một nghiên cứu khác cho thấy, trong hạt cây Bằng Lăng nước có chứa axit 9-oxooctadec-11-enoic [15], trong lá có các amino axit như isoleuxin, alanin, axit α-aminobutyric và methionin [13]
Isoleuxin (C6H13O2N) Axit α-aminobutyric ( C4H9O2N)
Alanin (C3H7O2N) Methionin (C5H11O2SN)
Trang 21Năm 1991, công trình nghiên cứu của Daulatabad C.D và các cộng sự [14] đã xác định được hàm lượng các axit có trong dầu lấy từ hạt loài Lagerstroemia thomsonii được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây
Bảng 1.1 Hàm lượng các axit có trong dầu hạt loài Lagerstroemia thomsonii
(%)
Axit stearic CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 8,8
Axit linoleic CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH 49,9
Khi nghiên cứu lá loài Lagerstroemia subcostata,Iida,H và CominsD.L đã phát hiện một số ancaloit khác như: Subcosin I, lasubin I, lasubin II [16], subcosin II [17] Còn Blomster R.N và Zachrias D.E đã phân lập được lythridin [18], lythrin [19] từ Lagerstroemia fauriei và decinin từ loài Lagerstroemia lanceolatum [20]
Trong công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Lagerstroemia flosreginae, Xu Y.M đã chỉ ra rằng trong lá có flosin A, reginin A, reginin B [21], reginin C và reginin D [22]
1.4.2 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam
Năm 2001, PGS.TS Đỗ Đình Rãng cùng các cộng sự trường ĐHSP Hà Nội [5]
đã nghiên cứu hàm lượng nước có trong một số bộ phận của cây Bằng Lăng nước như
Trang 22hoa, lá, vỏ được trình bày ở bảng 1.2 Kết quả cho thấy, hàm lượng nước trong hoa là lớn nhất và trong vỏ là ít nhất
Bảng 1.2 Hàm lượng nước một số bộ phận của cây Bằng Lăng nước
Trang 23CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
2.1.1 Thu mẫu và xử lý mẫu nguyên liệu
Nguyên liệu để nghiên cứu là lá cây Bằng Lăng nước (Lagerstroemia
speciosa) còn có tên gọi khác theo địa phương là cây Bằng Lăng tím được thu hái tại
Kon Tum Lựa chọn thu hái 2 dạng nguyên liệu là lá non, lá già với tổng khối lượng là 5kg
Hình 2.1 Lá non, lá già và lá khô (từ trái sang phải)
Thông số về trạng thái kích thước nguyên liệu tính trung bình trên 50 lá ngẫu nhiên được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1 Thông số nguyên liệu
Thông số Đường kính
(cm)
Chiều dài (cm)
2.1.2 Khảo sát khối lượng cao chiết cồn trong mỗi loại nguyên liệu
Nguyên liệu: bột lá Bằng Lăng nước Nguyên liệu sau khi thu hái được cắt nhỏ
và phơi khô, sấy và đem nghiền thành bột Cho vào bình thủy tinh lớn 600g bột nguyên
Trang 24liệu các loại, thêm vào 5400ml ethanol 96%, chiết ngâm 3 lần, mỗi lần 4 giờ Dịch chiết đƣợc cô cạn dung môi đến cao khô, cân đến khối lƣợng không đổi
d Định tính terpenoid – steroid
Trang 25Lấy 0,01g cao chiết, thêm 15ml clorofom, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Lấy vào
Cách tiến hành: thêm vào mẫu thử 1ml dung dịch thuốc thử, 1-2 giọt H2SO4
đậm đặc Nếu xuất hiện màu xanh lục sau 1-2 phút thì phản ứng dương tính
Trang 26Ống 2: Thêm vào 1ml dung dịch FeCl3 5% trong ethanol Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏ thì phản ứng dương tính
Ống 3: Thêm vào 1ml formol 36%, 1-2 giọt HCl đậm đặc Nếu xuất hiện trầm hiện màu đỏ thì phản ứng dương tính
2.1.4 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 365 nm
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100
Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm)
Trang 27Tủ sấy, lò nung, cân phân tích 3 số, bếp cách thủy, bếp điện, cốc thủy tinh, phễu chiết, ống đong, pipet, giấy lọc, cột sắc ký và các dụng cụ thí nghiệm khác
Bảng 2.2 Các hóa chất đã sử dụng
STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Nguồn gốc
5 Dung dịch H2SO4 (98%) Tinh khiết Trung Quốc
8 Dung dịch HCl đậm đặc Tinh khiết Trung Quốc
10 Dung dịch NaOH Tinh khiết Trung Quốc
12 Dung dịch NH4OH Tinh khiết Trung Quốc
Trang 2816 CH3COOH Tinh khiết Trung Quốc
18 Dung dịch Formol 36% Tinh khiết Trung Quốc
19 Na2SO4 rắn Tinh khiết Trung Quốc
b Thiết bị nghiên cứu
- Đèn UV bước sóng 254 và 365 nm
- Máy sắc ký kết hợp khối phổ GC – MS ( trung tâm đo lường 2 )
- Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS LAMBDA25 (Phòng thí nghiệm Khoa Hóa, trường đại học Sư phạm Đà Nẵng)
2.2 CHIẾT RẮN – LỎNG NGUYÊN LIỆU VÀ CHIẾT LỎNG – LỎNG VỚI DUNG MÔI CHLOROFORM
2.2.1 Mục đích
Sau khi chiết ngâm 600g nguyên liệu với dung môi ethanol 96%, dung dịch thu được đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng được áp dụng để phân chia dung dịch ethanol ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau
2.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm và kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
* Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Trang 29Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, có nắp đậy Rót dung môi tinh khiết vào đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một ngày đêm để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó dịch chiết đƣợc lọc sang một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi đƣợc cao chiết Có thể gia tawnghieeuj quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn lớp bột hoặc gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ
Hình 2.3 Phương pháp chiết ngâm dầm
*Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng
Hình 2.4 Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Nguyên tắc: là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, đƣợc biểu diễn bằng hằng số phân bố K
Trang 30K= C a
Cb
Trong đó:
Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng
Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng
Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Có độ tinh khiết cao
- Hòa tan tốt các chất được chiết
- Không hòa tan lẫn với dung môi cũ, nghĩa là có tỉ khối khác nhiều với dung môi cũ
- Không tương tác với chất cần chiết và có nhiệt độ sôi tương đối thấp
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết:
- Ảnh hưởng của quá trình chiết
- Vai trò của sự tạo phức
- Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan
2.2.3 Cách tiến hành
Lấy 600g mẫu cho vào bình thủy tinh lớn có nắp đậy được bọc kín, sau đó thêm 5400ml dung môi ethanol 96%, chiết ngâm 3 lần, mỗi lần trong thời gian 24h ở nhiệt
độ phòng, lắc đều cách 2 giờ để tăng hiệu quả quá trình chiết Lọc lấy dịch lọc
Dịch chiết ethanol sau mỗi lần chưng ninh được đo thể tích bằng ống đong, cô cạn dung môi đến dưới 500ml sau đó định mức thành 500ml bằng cùng dung môi và trích 10ml dịch để đo UV-VIS Cô cạn toàn bộ dịch chiết ethanol thu được cao ethanol
Trang 31Hòa tan cao chiết vào 50ml nước cất,chiết lỏng – lỏng với 500ml dung môi chloroform
Cho vào bình có nút nhám 50ml dung dịch, lắc 3 lần với dung môi chloroform, mỗi lần 500ml lắc đều trong 4 giờ, chiết phần dung dịch được tách ra vào bình chứa Sau 3 lần chiết ta thu được dịch chiết của dung môi chloroform, tiến hành cô cạn thu được cao chloroform
2.3 PHÂN LẬP PHÂN ĐOẠN CAO TỔNG CHLOROFORM
2.3.1 Sắc ký bản mỏng
Phương pháp này được Izmailop và Schereiber đề nghị từ năm 1938, được Stan phát triển, hoàn thiện năm 1955
a Nguyên tắc
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi
để bán định lượng hoặc định lượng các hoạt chất Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng phân đoạn Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả là ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động
Ưu điểm của kỹ thuật: hiệu quả tách cao, thời gian ngắn, lượng chất ít, thường được dùng để định tính và tách các hợp chất thiên nhiên Nó cũng được các nhà hóa
Trang 32học tổng hợp sử dụng thường xuyên để nhanh chóng phân tách các chất thu được trong phản ứng
Nhược điểm của kỹ thuật:
- Thành phần pha động dễ thay đổi trong quá trình khai triển
- Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi
- Chỉ dùng khi hỗn hợp cần tách có số lượng ít, vài trăm miligam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách bằng sắc ký cột sẽ kinh tế hơn
- Bình triển khai bằng thủy tinh trong suốt, có nắp đậy kín
- Micropipet nhiều cỡ từ 1ml đến 20ml hoặc các ống mao quản
Công thức pha dung dịch thuốc thử hiện màu (dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuaric): cho vào cốc loại 500ml hỗn hợp gồm 200ml CH3OH và 25ml CH3COOH đậm đặc, khuấy đều, sau đó cho từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc vào Tiếp theo cho 1,2 g vanillin vào hỗn hợp trên, khuấy đều tay Dung dịch sau khi pha được đựng trong bình thủy tinh màu tối, đậy nút kín
c Lựa chọn dung môi giải ly
Trang 33Chọn dung môi triển khai phụ thuộc vào mẫu cần tách Với mẫu chƣa biết thành phần, chƣa có tài liệu tham khảo cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ loại không phân cực đến phân cực
Cách xác định nhanh loại dung môi phù hợp với mẫu:
Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm bằng nhau, đều nhau trên cùng một bản mỏng, các vết chấm cách nhau 1 cm Dùng những vi quản để đƣa các dung môi có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, mỗi vết mẫu một loại dung môi khác nhau Sau khi chấm, dung môi sẽ lan tỏa tạo thành vòng tròn Dùng viết chì khoanh tròn vết lan xa nhất của dung môi Quan sát các vòng tròn đồng tâm: dung môi nào làm mẫu lan ra ngoài cùng lúc với tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực, dung môi nào vẫn nằm tại chỗ là dung môi đó không đủ phân cực
Để dễ quan sát hơn, nên thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển khai sắc ký bản mỏng trong đó mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phân cực tăng dần nhƣ : hexan, benzene, chloroform, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, methanol Chuẩn bị các tấm bản mỏng có chấm các mẫu chất nhƣ nhau rồi nhúng mỗi tấm vào một bình nhƣ đã chuẩn bị Ghi nhận độ di động của các cấu tử trong mẫu:
+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử nằm tại chỗ mức xuất phát thì dung môi đó chƣa đủ phân cực (dung môi không phù hợp)
+ Nếu dung môi nào khiến cho tất cả các cấu tử di chuyển lên hết mức tiền tuyến dung môi thì dung môi đó quá phân cực (dung môi không phù hợp)
+ Nếu dung môi nào có thể làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau một cách gọn, rõ, sắc nét và vị trí các vết nằm khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký thì dung môi đó phù hợp
+ Nếu qua quá trình triển khai mà nhận thấy hệ thống dung môi đơn không có những vết gọn, rõ, sắc nét thì cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung môi
Trang 34Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm nhẹ vào bề mặt bản mỏng
để không nhìn thấy lỗ bề mặt Chạm vào và lấy vi quản ra khỏi về mặt thật nhanh để dung dịch thấm mẫu vào bản mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu, điểm này sẽ lan to Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay hơi nhanh, không lan thành vết chấm to Có thể chấm thêm lên ngay vết chấm cũ vài lần để có vết đậm, rõ, đường kính không quá 2mm Nên chấm nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung dịch mẫu hơn là chấm một lần với lượng lớn mẫu
Nếu cần chấm cùng lúc nhiều vết chấm lên một bản thì các vết chấm phải cách đáy bản 1cm và cách đều nhau 1cm và cách hai cạnh bên 1cm
e Chuẩn bị bình triển khai
Bình hình khối trụ hoặc khối chữ nhật, có đường kính lớn hơn bề ngang bản mỏng một ít Đặt một tờ giấy lọc bao phủ mặt trong của bình nhưng vẫn chừa một khoảng để có thể quan sát bên trong Tính toán lượng dung môi giải ly sao cho khi vào bình, lớp dung môi sẽ dày khoảng 0,5-0,7 cm
Trang 35Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5-10 phút để bão hòa hơi dung môi trong bình nhờ vào lớp giấy lọc
Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào dung môi trong bình, khi nhúng vào phải cẩn thận để hai cạnh bên không chạm vào thành bình, lúc đó vị trí của các vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môi khoảng 0,5cm
Đậy nắp bình, dung môi sẽ được hút lên bản bởi lực mao dẫn Theo dõi khi dung môi lên đến vạch kết thúc đã được vạch sẵn thì lấy bản ra khỏi bình Sấy nhẹ bản mỏng, quan sát bằng mắt và dùng bút chì khoanh nhẹ các vết thấy được Còn nếu không thấy gì trên bản, có thể nhìn dưới đèn tử ngoại (UV), bằng hơi iod hoặc phun bản với thuốc thử hiện hình thích hợp
f Cách hiện hình các vết sắc ký
Sau khi kết thúc quá trình sắc ký, phải tiến hành làm hiện hình vết sắc ký bằng các phương pháp hóa học và vật lý phù hợp
Đối với phương pháp hóa học, phun xịt lên bản mỏng một dung dịch thuốc thử
có thể có tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp tạo thành hỗn hợp màu nhìn rõ bằng mắt thường
Trong phương pháp vật lý, ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia
tử ngoại Ngoài ra có thể dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng được với các cấu
tử trong hỗn hợp hoặc nhận dạng vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ
2.3.2 Sắc ký cột
a Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì có thể dùng bông thủy tinh để chặn, tiếp theo cho cát phủ lên để có được một mặt bằng phẳng
Trang 36Chất hấp thu dạng sệt được chuẩn bị như sau:
Trong một becher đã có sẵn dung môi, cho chất hấp thu vào becher đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khuấy đều nhẹ nhàng Lưu ý không được thực hiện ngược lại, nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt sẽ khiến cho bọt khí bị giữ lại trong cột và cũng không được quá loãng
Nhờ một phễu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa bên dưới cột để dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng để rót trả lại trên đầu cột
Tiếp tục rót hỗn hợp chất hấp thu vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng thanh cao su gõ nhẹ vào ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột
Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang Nếu mặt thoáng không nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt lớp chất hấp thu để làm xáo một phần chất hấp thu trên đầu cột, để yên cho chất háp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng
Đối với chất hấp thu có thể trương nở, cần có thời gian để gel trương nở Thường ta thêm đủ lượng dụng môi để làm thành hỗn hợp sệt có thể rót chảy để rót vào cột
b Nạp chất hấp thu dạng cột khô vào cột
Dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất
có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột qua phễu thủy tinh có đuôi dài Cho chất hấp thu ở dạng bột khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho