Các phương pháp phân tích vi sinh

Trang 21 là 12 2.1.4 Clostridium botulinum do Clostridium botulinum Clostridium botulinum2.1.5 Vibrio spp Các loài Vibrio +Vibrio Vibrio cholerae, V.. Aspergillus, Fusarius, Rhizopus B

TÍCH VI SINH

I VII

1

1.1 VAI TRÒ VÀ Ý CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VI SINH 1

1.2 CÁCH VÀ PHÁP AN TOÀN KHI LÀM VI SINH 2

1.3 KHÁI QUÁT CHUNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH 3

1.4 YÊU HÓA 4

4

4

1.4.3 Ng 5

5

5

6

7

TÓM 8

CÂU ÔN 8

N HÌNH 9

2.1 VI SINH GÂY TRONG VÀ 9

2.1.1 Salmonella 9

2.1.2 Campylobacter 10

2.1.3 Clostridium perfringens 10

2.1.4 Clostridium botulinum 11

2.1.5 Vibrio spp 11

2.1.6 Escherichia Coli 12

2.1.7 Listeria monocytogenes 13

2.1.8 Staphylococcus aureus 14

2.1.9 Shigella spp 14

2.1.10 Coliforms 15

2.1.11 Bacillus cereus 15

2.1.12 Neisseria gonorrhoeae 16

2.1.13 Haemophilus influenza 16

2.1.14 Pseudomonas aeruginosa 16

2.2 VI SINH LÝ MÔI 17

17

19

TÓM 28

CÂU ÔN 28

29

3.1 VÀ YÊU TRONG PHÂN TÍCH VI SINH 29

3.2 THU VÀ 30

30

30

30

31

3.3 THU VÀ 31

31

32

34

34

3.4 THU VÀ 35

35

35

3.4 36

37

38

38

39

40

40

3.5 THU VÀ 41

41

41

TÓM 48

CÂU ÔN 48

H 49

4.1 PHÁP 49

49

50

51

4.2 PHÁP 51

52

52

53

54

54

54

4.3 PHÁP MÀNG 55

4.4 PHÁP MPN 55

4.5 NG PHÁP LAI 56

TÓM 58

CÂU ÔN 58

SINH HÓA TRONG PHÂN 59

5.1 KHÁI 59

5.2 CÁC LIÊN QUAN CARBOHYDRATE 59

59

60

63

- galactosidase 64

65

5.3 LIÊN QUAN PROTEIN, ACID AMIN, ENZYME 67

2 S 67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

78

79

80

81

83

84

5.4 PHÂN LIPID 85

5.5 KHÁC 86

86

87

88

89

TÓM 91

CÂU ÔN 91

92

6.1 PHÁP PHÁT QUANG SINH 92

92

6.2 PHÁP PETRIFILM 94

6.3 PHÁP ELISA 95

95

6.3.2 Nguyên lý 95

96

6.4 PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 100

101

102

6.5 PHÁP RFLP 104

104

104

105

6.6 PHÁP SEQUENCING 106

106

106

TÓM 113

CÂU ÔN 114

115

7.1 VI SINH KHÍ 115

115

115

115

7.1.4 Quy trình phân tích 116

7.2 COLIFORMS VÀESCHERICHIA COLI 118

118

pháp MPN 118

121

123

124

7.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 127

127

127

128

7.4 STREPTOCOCCUS FEACALISTRONG 130

130

130

7.4.3 Môi 130

131

7.5SALMONELLA 132

132

7.5.2 Môi 133

134

7.6 SHIGELLA 139

139

7.6.2 Môi 139

140

7.7 VIBRIO 143

143

143

144

7.8LISTERIA MONOCYTOGENES 146

146

146

147

7.9 CLOSTRIDIUM 149

149

149

149

7.10CAMPYLOBACTER 150

150

151

152

7.11 MEN, 154

154

155

7.11.3 Môi 155

155

TÓM 157

CÂU ÔN 157

G PHÁP PHÂN TÍCH VI P 158

8.1 XÁC VÀ THU 158

158

158

8.2 PHÂN VI SINH 159

159

159

8.2.3 159

8.3 XÁC HÌNH THÁI VI SINH 160

160

8.4 XÁC TRÚC VI SINH 162

162

Nelsen) 163

165

166

168

8.5 DANH VI SINH CÁC SINH HÓA 168

8.6 XÁC CÓ VI SINH 169

169

169

8.7 DANH VI SINH CÁC SINH PHÂN 169

TÓM 170

CÂU ÔN 170

171

9.1 SÁT KHÁNG VI SINH VI SINH KHÁNG 171

171

173

9.2 SÁT SINH ENZYME BÀO VI SINH 174

174

174

TÓM 180

CÂU ÔN 180

181

10.1 QUY TRÌNH DANH VI SINH 181

10.1.1 Quy trình chung 181

182

183

10 183

10.2 XÂY CÂY PHÁT SINH LOÀI 184

TÓM 193

CÂU ÔN 193

TÀI THAM 194

dung

- eptone

e

e Peptone

phân tích vi s

1

2

1

parahaemolyticus, V vulnificus, V hollisae, V furnsii, V

minicus, V fluvialis, V alginolyticus

a Vibrio cholerae

Vibrio cholerae là vi

Clostridium botulinum

Vibrio cholerae

Escherichia Coli

Enteropathogenic E.Coli (EPEC)

Enterotocigenic E.Coli (ETEC)

Enteroinvasive E.Coli (EIEC)

Enterohaemorrhagic E.Coli E.Coli (VTEC) hay E.Coli

2.1.10 Coliforms

Escherichia, Klebsiella, Enterobacter

2.2 M T S VI SINH V T X NG

2.2.1 Vi sinh v t phân gi i các h p ch t ch a carbon

2.2.1.1 Vi sinh v t phân gi i cellulose

và exo gluca x Enzyme -

phân cellobiose thành glucose

- Amylose 1,6 -

-

de

2.2.2 Vi sinh v t phân gi i các h p ch t ch a nitrogen

2.2.2.1 Quá trình amon hóa

thành NH4+ 3

a

trình amôn hoá Quá trình amôn hoá urea

enzyme urease sinh ra

3, CO2 và H2O CO(NH2)2 + 2 H2O (NH4)2CO3

(NH4)2CO3 2NH3 + CO2 + H2O

3

3 CN-NCa + 2 H2O CN-NH2 + Ca(OH)2

2.2.2.2 Quá trình nitrate hóa

Sau quá trình amôn hoá NH3

Thiobacillus denitrificans, Hydrogenomonas

denitrificanas, Bacillus licheniformis

N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O 2NH4+ + 12 ADP + 12P + 4H+

Azotobacter vinelandii

2 N2

trong quá trình này 3

2 thành NH3

Azotobater

Azotobacter

NH3

b

húng

quang

- 300 -

Ngoài ra, calci

Azotobacter

Azotobacter Azotobacter -

- Quá trình amon hóa

- Quá trình nitrate hóa

b

Lô hàng

Kháng sinh Vi sinh

3.4.1 M t s nguyên t n khi thu m u b nh ph m

- m b o vô khu n khi l y b nh ph m

- D ng c l y b nh ph xét nghi m ph i do phòng xét nghi m vi sinh cung c p

- T t c b nh ph m, v t ph m ph i có phi u yêu c u xét nghi m kèm theo và ph i

thông tin trên phi u xét nghi m

3.4.2 Thu m u và c y máu

a Yêu c u

- D ng c : chai c y máu Bactec

- L c khi b nh nhân dùng kháng sinh và t t nh t khi b nh nhân b n

- Th tích máu càng nhi u, t l -5ml cho tr em

b Cách l y

- Ch ch rõ nh t

- Dùng gòn nhúng vào dung d ch sát khu n (Povidine), sát khu n theo hình xo n c

t trong ra ngoài (n u da b nh nhân không s ch thì ph i r a b c

r i r c th m khô b ng bông s ch r m i sát khu n)

- L p l i thao tác 1 l n n a

- i cho dung d ch Povidine khô

- Lau s ch Povidine b ng bông gòn th m c i cho dung d ch sát khu n khô

- y máu, không nên l y ngón tay s n

m y máu s b nhi m khu n tr l i

- Sát trùng m t nút chai b ng c i

- L c dây garô cho n ch và l y máu

b c khi rút kim ra kh ch, n i l ng dây garô Thay

3.4.3.2 Cách l y

a ng h p m

- Lau s ch vùng da lành xung quanh v i c n 70%

- Lau s ch m trên v ng g c vô trùng th c mu i sinh lý vô trùng

B nh ph m l y càng s m càng t t ngay sau khi có ch c khi dùng kháng sinh

a ng h p viêm tai ngoài

y nh t v tình tr ng s c kh e th c v t c a m c H ch h i baog m m u tiêu b n và d li n g m l y m u, ngày l y

Vi c l a ch n m u b nh cho dù v i m nh hay nghiên c u v phân

lo i h u ph i h t s c c n th n Th m thu m u cây b nh thích h p nh t là

u ho c gi a c a b nh, khi vi sinh v t h i v tr ng thái ho t

ng Nh ng m u b nh b nhi m quá n ng không s d c vì n này vi sinh v t h i có th không ho ng n t ho i sinh xâm nh p vào các các mô b t ho i Vì v y, phân l p vi sinh v t h i t các m u b nh ng r t khó Vi c l a ch n v trí l y m u trên cây

b t quan tr i thu th p m u b nh c n ph i có ki n th n v tri u ch ng b nh và nguyên nhân gây b b m r ng m u l c có vi sinh

v t h i Trong m t s ng h p, tri u ch ng có th xu t hi n v trí này c a cây

l y v chính là cây ký ch c bi t quan tr ng khi l y m u b nh than

t s b nh phá h y hoa c a m t s loài trong h Hòa th o vì nh ng b nh

ng phát tri n trên nh ng t khác nhau

- S d ng túi gi l y gi m u b nh Không bao gi s d gi m u

u v n có th hô h p, làm m túi t u ki n cho vi sinh v t ho i sinh

xâm nh p và phát tri n nhanh, phá h y các mô th c v t Túi nilon ch có th c

s d gi các m t trong th i gian ng n

- u c n th B m t m s t o

u ki n cho vi sinh v t ho i sinh phát tri n, khi n cho m u b nh không th s

d c

- S d vi t nhãn (m c s không thích h p vì có th b nhòe khi t)

- Xin các gi y phép c n thi thu th p và v n chuy n m u b nh m t s khu

v c vi c l y m u sinh v t có th b h n ch , ví d n Qu c gia ho c các khu v n lý Vi c v n chuy n m u t c khác

d

hay không

-

-

-

acridin orange -dianidino-phenyl-indol

(DAPI), fluorescent isothiocyanate (FITC)

4.2 M KHU N L C

cho ph

Hìn

4.2.6 ng xo n c

4.3 C

4.4

càng cao

32

-

-

-

b sinh hóa

Monosaccharide, polyhy

oligosaccharide; 3 polyhydric alcohol

- Glucose- Arabinose- Trehalose- Sorbitol

- Galactose - Raffinose- Melibiose- Adonitol

- Fructose - Rhamnose- Salicin- Dulcitol

- Lactose - Xylose- Mannitol- Inulin

- Saccharose - Cellobiose- Inositol

2

2

Hình 5.2

5.2.4 Th nghi m kh - galactosidase

a Nguyên t c

-b sinh hóa

(-)

2S và sinh gas hay không

-e

-c Cách ti n hành

-acetoin và

S.aureus 2+

S.aureus S.aureus

-c Cách ti n hành

-tetramethyl-p-phenylenediamin, quan sát sau vài phút

Urea+ H2O CO2+ H2O +NH3 ammonia carbonat

-napthylethylenediamine

-

-

thêm Zn Hình 5.22

5.4 TH NGHI M TH Y PHÂN LIPID

a Nguyên t c

b sinh hóa

Serratia marcescens Edwardsiella tarda

TPase và ình 6.1)

6.2

ilm

k

petrifilm

6.3.3 M t s k thu t ELISA

a ELISA tr c ti p

] = Ag + Ab E ] = Ag Ab E

1981; Koenig và Paul, 1982)

d ELISA c nh tranh

- -equilibrium saturarion):

c

hai

-

-6.4.2 Các thành ph n c a ph n ng PCR

1.000 b

E coli (McPherson và Moller, 2000)

Hình 6.6

-b

Hình 6.7

Hình 6.8 p Sanger

c Gi i trình t b ng máy gi i t ng

chù

Hình 6.9

Hình 6.10

7.2 COLIFORMS VÀ ESCHERICHIA COLI

7.2.2.2 ng, hóa ch t và thi t b

- Canh Lauryl Sulphate (LSB)

- Canh Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

- Canh EC (E.Coli medium)

- Violet Red Bile Agar (VRB)

- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

7.2.3.3 Quy trình phân tích

a

b

1

5 30 phút 15ml môi

7.2.4.3 Quy trình phân tích

0

y vòcanh trypton, canh MR- 0C

+ +

- Glucose Azide broth

- Bile Esculine Agar

-

-

7.5 SALMONELLA

7.5.1 Nguyên t c

Salmonella Salmonella tron

- Canh Rappaport Vasilliadis Soya (RV)

- Canh Malachite Green Magnesium Chloride

- Canh Selennite Cystein

- Canh Lysine Decarboxylase (LDC)

- Canh Ornithin Decarboxylase (ODC)

- Canh Mannitol Phenol Red broth base

e

Salmonella là anti-O, anti-H và anti-Vi

Salmonella

quanmàu nâu

- Canh Tryptose soya

- Canh Gram negative

-

-

- Canh Tryptose soya

- Canh Gram negative

-

-

- Mannitol phenol red broth base

- Dulcitol phenol red broth base

- Lysine Decarboxylase broth (LDC)

Malonate

MR

VP Salicine Xylose Cellobiose Adonitol Dulcitol Inositol

- +/- (2)

- (4)

- (1)+ +/-

-

-

- (1)+/-

- (1)+/-

-

- (1)+

-

- +/-

- (1)+ +

-

- + (3)+ + (3)+ (3)+

- Canh Hugh&Leighson Glucose

- Canh Carbohydrate purple

-

-

-

-

TCBS

(NaCl) 0%

- + + + +

+ +

- + +

-

-

- + + +

-

-

- Rhamnose Phenol Red broth base

- Xylose Phenol Red broth base

Phân l p và xác nh Campylobacter spp c n th c hi n các giai

- T ng sinh trên môi tr ng canh thang Bolton và tr n u, em 37oC trong 4

Skirrow) Sau ó chúng c 41,5oC /44 gi ± 4 gi trong i u ki n vi hi u khí

- Kh ng nh b ng các th nghi m sinh hoá h c c tr ng

- 2O2 / Hydrogen peroxide solution, 3 % (volume fraction)

- ch Natri hippurat / Sodium hippurate

Key: + = positive; - = negative; s = sensitive; R = resistant

- 0C trong vòng 5

-

Ghi chú

8.4.4 K thu t nhu m tiên mao

8.4.4 K thu t nhu m tiên mao

Hình 7.7

8.4.5 K thu t nhu m nang (capsule)

BÀI 9: P

-

9.1 KH O SÁT KH I KHÁNG VI SINH

V T CH TH C A VI KHU N SINH H P CH T KHÁNG KHU N

Hút 100

0

giá kh n c a vi khu n kh o sát thông qua kh o vòng tròn kháng khu n v i vi khu n ch th M ho t tính kháng khu c

ho t tính AU (Arbitrary unit) M t AU là m di n tích c a vùng c ch trên m th ng h p này là mm2/ml Ho t tính kháng khu c tính theo công th c sau (Usmiati và Marwat, 2009):

Ho t tính kháng khu n (mm2/ml)

Lz: di n tích vòng kháng khu n, bao g m c di n tích l (mm2) Ls: di n tích l (mm2)

Ti sinh các ch ng vi khu n kh o sát trong erlen ch a 10 ml môi

ng phù h p 300C trong 24 gi lo i b sinh kh i, thu

l y d ch trong Chu n b các ng nghi m m i ng ch a 2 ml TSB vô trùng Hút 2 ml

d ch sau ly tâm cho vào ng nghi m ch n

ch th ng TSB trong 24 gi và ch nh v m 107 cfu/ml cho vào ng nghi a s n d ch sau ly tâm vi khu ng TSB Ti n hành 370C trong 24 gi 600nm nh t l c ch vi khu n ch th

l c ch vi khu n ch th c tính theo công th c sau

% t l c ch

9.2 KH O SÁT KH SINH ENZYME NGO I

n protein trong dung d nh y cao cho phép phát

hi n t i vài µm protein/ml, d th c hi n và ti t ki m th i gian

N albumin (µg) 0 10 20 30 40 50

c c t (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Thu c th Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2

ng 1 ng v i th i gian xu u là 0 phút Th c hi n ph n ng l t các ng còn l i 2, 3, 4, 5, 6 các ng cách nhau 1 phút

M u thí nghi c ti u c pha loãng sao cho tr s m c trong kho ng c ng chu n

c Tính k t qu

Tr s m quang (OD) c a nh ng i ch ng ( n ng 6) sau khi tr

s c a ng th không ( ng 1) s xây d th bi u di n s bi n thiên

c a m quang ( OD) theo n protein chu n ( y, tr

s m quang c a m u thí nghi s m quang c a ng th không, r i chi ng cong m ng protein có trong dung d ch m u thí nghi m (µg/ml)

khác nhau trên) và thêm 1ml thu c th ng 5 l n vào dung d ch h n

h p Sau khi tr nh dung d ch 37 ± 0,50 h p

th c a dung d ch này c sóng 660 nm (ghi nh n k t qu As10; As20; As30; As40;

As50)

i v i ch h p th c a dung d ch này c sóng 660 nm (ghi nh n k t qu i ch ng As0)

D ng chu ng µg h p th

Chu n b dung d ch tyrosin chu n: cân 10 mg tyrosin pha trong 100 ml (pha b ng

nh m c 100 ml, tyrosin ch tan trong HCl 0,1M)

B ng 9.2 Chu n b dung d ch tyrosine chu n

S ng 1 2 3 4 5 6

N tyrosin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung d ch tyrosin (µg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 HCl 0,1M 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Dung d ch Na2CO3 0,4M 5 5 5 5 5 5 Thu c th Foline (ml) 1 1 1 1 1 1

c nh ho t tính enzyme protease

Cho 1 ml dung d t casein 1% vào ng nghi m, nhi t 37 ± 0,50C trong 10 15 phút Sau th i gian , cho 1 ml dung d ch enzyme vào và l

h n h p này nhi 37 ± 0,50 n h p này 2

ml dung d nh dung d c dung

d ch này qua gi y l lo i t a Cho 5 ml dung d ch Na2CO3 0,4M vào 1 ml d ch l c, thêm 1 ml thu c th n vào dung d ch h n h p này Tr u, yên 37 ± 0,50C trong 20 phút Khi dung d ch xu t hi

BÀI 10:

-

10.1 NH DANH VI SINH V T

10.1.1 Quy trình chung

10.2 XÂY D NG CÂY PHÁT SINH LOÀI

Reverse + complement

copy seleted seqs

1

GU191345GU191342 GU191346

1

8

1 :

2

Câu 1: Nêu quy trình

1 Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K., Stackebrandt E., 2006.The

Prokaryotes, A handbook on the Biology of Bacteria Springer Science and

Business Media, New York, USA

2 Wiley J M., Sherwood L M., Woolverton C J., 2009

Microbiology Mc Graw Hill Higher Education, New York, USA

3