Bài giảng Các phương pháp phân tích dịch sinh học

Trang 6 Ống nghiệm Trang 7 Kim lấy máu Bơm kim tiêm Kim lấy máu bằng ống hút Trang 9 Chuẩn bị bệnh nhân - Lấy máu vào buổi sáng, bệnh nhân đã nhịn đói - Ngưng các loại thuốc trước kh

TS Vũ Thị Thơm Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội

Các phương pháp

phân tích dịch sinh học

Phần 1

phẩm xét nghiệm hóa sinh

Cách lấy và bảo quản mẫu bệnh

phẩm xét nghiệm hóa sinh

MỤC TIÊU HỌC TẬP :

Sau khi học xong bài này các anh chị phải:

1. Trình bày được cách lấy và bảo quản mẫu máu để làm xét

nghiệm hoá sinh

2. Trình bày được các yếu tố ảnh hưởng đến xét nghiệm hóa

sinh

3. Trình bày được cách lấy, bảo quản nước tiểu và một số

dịch khác trong cơ thể

Ống nghiệm

ống hút chân không hoặc ống nghiệm thường

Kim lấy máu

Bơm kim tiêm Kim lấy máu

bằng ống hút

chân không Lancet

Chuẩn bị dụng cụ

Hộp chứa rác thải

Bông y tế Găng tay Cồn sát trùng

Garo

Chuẩn bị bệnh nhân

- Lấy máu vào buổi sáng, bệnh nhân đã nhịn đói

- Ngưng các loại thuốc trước khi làm xét nghiệm

2-3 ngày

- Bệnh nhân nghỉ ngơi 15-20 phút trước khi lấy

máu

- Kiểm tra, đối chiếu bệnh nhân: tên, tuổi…

- Giải thích cho bệnh nhân cách lấy máu

Nhận biết bản thân

• Chào hỏi bệnh nhân

• Thân thiện với bệnh nhân

• Giới thiệu tên

• Nói mục đích của mình

- Yêu cầu họ nói tên đầy đủ, ngày tháng năm

sinh…bằng miệng, đối chiếu y lệnh

- Không hỏi họ: “anh là anh A ”

Quy trình l ấy máu tĩnh mạch

Thường lấy máu tĩnh mạch khuỷu tay,có thể lấy tĩnh mạch cổ tay, bàn tay, cổ chân…

- Bệnh nhân nằm hoặc ngồi

Quy trình lấy máu

Buộc garo

Buộc garo theo hình chữ X

Giữ tĩnh mạch

• Dùng ngón trỏ đẩy tĩnh

mạch căng lên nhưng

không quá chặt

• Việc này giúp tĩnh mạch

không di chuyển hay lăn

• Cầm kim và quan sát

• Mặt nghiêng của kim

phải hướng lên

• Luồn kim vào ở tư thế

góc 15 đến 30 độ bằng

động tác nhanh, nhẹ

nhàng

Đâm kim

Giữ tĩnh mạch và đâm kim lấy máu

Làm đầy các ống nghiệm

• Ngay khi thấy máu chảy

ra, phải tháo bỏ ngay

garo

• Khi thay đổi ống nghiệm,

giữ kim và tay cầm ở tư

Thứ tự ống nghiệm

4 Ống chứa gel để lấy huyết thanh

học, một số xét nghiệm sinh hóa)

7 Ống chống đông bằng oxalate – fluoride để

định lượng glucose và lactate

Lấy máu tĩnh mạch

Đẩy pitông lấy máu bằng bơm tiêm

Rút kim

• Sau khi ống nghiệm

cuối cùng đã lấy xong,

bỏ ống khỏi tay cầm

• Rút kim nhanh

• Đặt miếng gạc lên chỗ chọc kim

• Tạo áp lực trên tay Giữ

ở vị trí thẳn.Không để bệnh nhân gập cánh tay lại

Loại bỏ kim lấy máu

• Phải bỏ kim lấy máu

ngay sau khi rút ra

Đánh dấu ống nghiệm

Viết trên ống nghiệm:

• Tên đầy đủ của bệnh nhân

• Mã số bệnh nhân

• Giờ lấy bệnh phẩm, ngày

• Tên họ viết tắt của người lấy

máu

Bước cuối cùng

- Vứt bỏ tất cả các vật dụng ô nhiễm

- Dặn dò bệnh nhân

- Xếp ống máu vào giá

- Bỏ găng tay và rửa tay

Khi không lấy được máu

 Giữ bình tĩnh

 Kiểm tra:

• Vị trí của kim: định vị lại

• Tạo chân không của ống nghiệm: thay ống mới

• Vị trí của ống nghiệm: nâng lên hay hạ xuống

Kim không đủ sâu: nhẹ

nhàng đẩy kim sâu thêm

Mặt vát của kim bị bịt bởi thành mạch: dòng chảy của máu sẽ kém nếu mặt vát không ở vị trí quay lên

điều chỉnh lại kim, vì

gây đau cho bệnh nhân

• Rút kim và bắt đầu lại

• Người lấy máu chỉ nên

thử lấy máu hai lần trên

một bệnh nhân

Nhắc nhở về an toàn

• Luôn tuân thủ các nguyên tắc chuẩn mực

và phổ quát về máu khi lấy máu

• Luôn đeo găng khi lấy máu

• Xác định bệnh nhân bằng hỏi tên và kiểm tra băng ở tay

• Không để garo quá một phút

• Dán nhãn đúng ống nghiệm sau khi lấy

máu

Bệnh phẩm máu

toàn phần, huyết tương, huyết thanh

Lấy huyết thanh

silica Lớp gel làm hàng rào ngăn cách huyết

thanh và tế bào máu

Bệnh phẩm máu

Mẫu máu tách huyết thanh

sau khi để đông tự nhiên Huyết thanh không chứa fibrinogen Huyết tương

chứa fibrinogen

+Không định lượng: Ca, ALP, amylase, LDH

Chất chống đông

 Sodium Fluoride : 8g/l, tỷ lệ

0,2V/1,5V máu

+Xét nghiệm đường huyết, lactat

+Cơ chế chống đông: liên kết với

ion Ca++, ức chế hiện tượng phân

hủy đường

Chất chống đông

 Citrat :

+ ACD(acid citric-citrat-destrose), 15g/l tỷ lệ 1/4

+ Sodium citrat solution, 34-38g/l, tỷ lệ 1V/9V máu

+ Cơ chế: tạo phức hợp với Ca++

Chất chống đông

Heparin: lithium, sodium, muối ammonium, 25

IU/ml, tỷ lệ 0,2mg/1ml máu

Cơ chế: ức chế Prothrombin Thrombin

dùng làm trong các xét nghiệm sinh hóa

Chất chống đông

EDTA (Ethylen diamin tetra acetic): disodium, 1-2 g/l, tỷ

lệ 2mg/1ml máu

+ Cơ chế: tạo phức hợp với Ca++, ức chế quá trình đông máu

+ Không định lượng: Ca, Fe, ALP, Bil…

+ Dùng trong huyết học hoặc miễn dịch: TBC, CD4

Bệnh phẩm máu

 Lấy máu toàn phần: Một số xét nghiệm có nồng độ chất đó trong hồng cầu và trong huyết tương giống nhau Ví dụ: ure, glucose

 Bảo quản: mẫu máu ly tâm tách riêng thành

phần hữu hình

- Nhiệt độ phòng /4 giờ

- 2-8 oC/24 giờ

- - 24oC/trên 24 giờ

Các yếu tố ảnh hưởng

đến xét nghiệm

Những xét nghiệm được thực hiện bởi các phòng xét nghiệm chịu ảnh hưởng của những điều kiện sinh học của bệnh nhân, kỹ thuật xét nghiệm cũng như thao tác của cán bộ xét nghiệm

 Biến kỹ thuật:

- Trước xét nghiệm: lấy, bảo quản, vận chuyển

- Trong quá trình làm xét nghiệm

 Biến sinh học:

- Biến thiên cá thể

- Biến thiên quần thể

Biến thiên kỹ thuật

Tư thế bệnh nhân: tư thế khác nhau trong khi lấy máu làm

thay đổi nồng độ một số chất:

- Urê ↓ 3%, Kali ↑3%, Canxi ↑4%, Creatinin↑ 5%, Protein↑10%, AST↑15%, ALT↑15%, Cholesterol ↑18%

Thời gian garo: buộc garo quá lâu ->tăng ALT, AST, ALP, GGT,

LDH, Albumin, Protein toàn phần Giảm Kali, Cl, Glucose,

Creatinin, Ure…

Biến thiên kỹ thuật

Thời gian lấy máu: nồng độ một số chất thay đổi tùy theo

thời gian lấy máu, ví dụ cortisol cao nhất vào buổi sáng (6-8 h) và giảm dần vào buổi chiều và nửa đêm

Thời gian nhịn ăn trước khi lấy máu: lấy máu trước và

ngay sau khi ăn đều ảnh hưởng tới kết quả XN:

- Trước ăn 48 h: Bil tăng, Alb giảm

- Sau ăn: Glucose, Cholesterol, Triglycerid…tăng

Biến thiên kỹ thuật

Chất chống đông và chất bảo quản: Tuỳ từng loại xét

nghiệm khác nhau mà dùng các chất chống đông thích hợp

- Nếu dùng không đúng loại sẽ dẫn đến sai số hoặc

không xét nghiệm được

Lưu giữ máu: một số xét nghiệm cần đảm bảo thời

gian lưu giữ máu

- Khí máu

- Đường máu

- NH3 máu, lactat máu

Biến thiên kỹ thuật

Tan huyết: mẫu máu bị vỡ hồng cầu gây ảnh hưởng

Biến thiên sinh học

 Biến thiên cá thể: Do nhịp điệu sinh

học, quá trình trưởng thành, trạng thái

dinh dưỡng

 Biến thiên quần thể: tuổi, giới, hoạt

động dinh dưỡng

Biến thiên sinh học

Giới tính: khác nhau ở nam và nữ:

- Creatinin

Tuổi: thay đổi tùy theo tuổi, đặc biệt là ở trẻ

sơ sinh và người trưởng thành

- Bilirubin ↑ ở trẻ sơ sinh

- Glucose ↓ ở trẻ sơ sinh

- Protein TP ↓ ở trẻ sơ sinh

Biến thiên sinh học

Chế độ ăn: BN phải nhịn ăn trước khi làm XN Một số

chất như glucose, triglycerid, cholesterol sai số thừa sau ăn

- Chế độ ăn ít đạm: ure, protein TP↓

- Nhịn đói kéo dài: glucose, protein TP↓

- Uống rượu: GGT ↑

Tập luyện về thể lực: có thể gây ra sự thay đổi đáng

kể về hoạt động enzyme, hormoon…

- CK, AST tăng

- Hemoglobin niệu xuất hiện

- Haptoglobin, transferin và urê tăng

Biến thiên sinh học

Stress: trạng thái tâm lý như sợ hãi…gây tăng triglyceride,

cholesterol, uric, cortisol

Nhiệt độ:

- Bệnh nhân đang sốt: pH ↓, pCO2, pO2 ↑

- Bệnh nhân đang hạ nhiệt độ: pH ↑ , pCO2, pO2 ↓j

Phụ nữ: có sự thay đổi trong chu kỳ phát triển

- Có thai: Albumin, calci, vitamin C, globulin miễn dịch giảm, ALP, AFP, cholesterol, triglyceride tăng

- Chu kỳ kinh nguyệt: có những thay đổi về hormone

Biến thiên sinh học

Nhịp điệu ngày đêm:

- ALP giảm 25 – 50% trong buổi sáng,

- Cortisol cao nhất vào 6-9 h sáng và thấp nhất vào 9-11 h tối

- Sắt cao nhất vào buổi chiều, thấp nhất vào 4h sáng

- Catecholamine ban ngày cao hơn ban đêm

Thuốc: ngưng thuốc vài ngày trước khi lấy máu

- Thuốc ngừa thai: GGT ↑

- Lithium, Propanolon: Ca ↓

- Một số thuốc đông y, tây y: GOT, GPT ↑

Bệnh phẩm nước tiểu

Mẫu nước tiểu 24 giờ : Toàn bộ số lượng nước

tiểu trong một ngày đêm (đủ 24 giờ)

- Dụng cụ: bình sạch, vô khuẩn

- Lấy nước tiểu 24 giờ:

- Ấn định vào một giờ nhất định

- Ví dụ: 6h sáng , BN tiểu hết, bỏ đi

- Thu thập tất cả các bãi nước tiểu sau đó

- 6h sáng hôm sau, thu thập lần tiểu cuối cùng

- Trộn đều, đo thể tích , ghi chép kết quả

Bệnh phẩm nước tiểu

- Lấy thể tích vừa đủ yêu cầu PXN

- Gửi mẫu bệnh phẩm kèm thông tin đến PXN

Bảo quản:

- Nhiệt độ phòng/24 giờ

- 2-8o C / 3 ngày

- Dưới 0o C/ >3 ngày

Một số dịch chọc dò

Dịch não tủy: dịch trong khoang màng nhện bao bọc

xung quanh não tủy

- Phức tạp, đòi hỏi kinh nghiệm

- Thu thập vào ống nghiệm sạch, nút kín

- Mẫu lẫn máu, cần ly tâm

- Bảo quản 4oC đưa ngay tới PXN

- Tiến hành xét nghiệm ngay

- Trên 24h chưa làm xét nghiệm cần bảo quản -20oC

Câu hỏi lượng giá

Kỹ thuật buộc garo như thế nào là đúng:

A. Chọc kim xong phải tháo garo ngay

B. Buộc garo trong suốt quá trình lấy máu

C. Phải buộc garo khi lấy máu, nếu không sẽ ảnh hưởng

đến kết quả xét nghiệm

D. Thời gian từ lúc buộc garo cho tới lúc chọc kim to�i

đa 30 phút

Đáp án A

Câu hỏi lượng giá

Quan sát trong hình ảnh, KTV lấy máu làm sai bước

nào trong quy trình lấy máu tĩnh mạch

Câu hỏi lượng giá

Vị trí garo là

A Trên vị trí lấy máu 5-10cm

B Dưới vị trí lấy máu 3-5cm

C Tại vị trí lấy máu

D Trên vị trí lấy máu 1-3cm

Đáp án A

Câu hỏi lượng giá

Chất chống đông tham gia vào quá trình ức chế phân hủy đường là

A Heparin

B Natri citrate

C Sodium Floride oxalate

D EDTA (Ethylen diamin tetra acetic)

Đáp án C

Câu hỏi lượng giá

Mẫu máu lấy xong đem ly tâm chắt huyết thanh, huyết tương bảo quản ở

Câu hỏi lượng giá

Biến thiên kỹ thuật không bao gồm

A Tư thế của bệnh nhân

B Chế độ ăn

C Chất chống đông và bảo quản

D Tan huyết

Câu hỏi lượng giá

Biến thiên sinh học không bao gồm:

Câu hỏi lượng giá

Yếu tố nào sau đây không ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm:

A Người vận chuyển

B Thời gian bảo quản

C Nhiệt độ bảo quản

D Chất bảo quản

Câu hỏi lượng giá

Cách lấy nước tiểu ngẫu nhiên để làm xét nghiệm

A. Sáng sớm, bệnh nhân vệ sinh sạch sẽ , đi tiểu hứng vào ống

nghiệm

B. Sáng sớm, bệnh nhân vệ sinh sạch sẽ , đi tiểu bỏ phần đầu

bãi, hứng vào ống nghiệm

C. Bất kỳ thời điểm nào trong ngày, bệnh nhân vệ sinh sạch sẽ

, đi tiểu hứng vào ống nghiệm

D. Buổi tối trước khi đi ngủ, bệnh nhân vệ sinh sạch sẽ, đi tiểu

hứng vào ống nghiệm

Đáp án B

Câu hỏi lượng giá

Nước tiểu 24 giờ là

A Tổng số nước tiểu trong 24 giờ không kể lượng

nước tiểu khi bệnh nhân đại tiện

B Tổng số nước tiểu trong 24 giờ tính cả lượng

nước tiểu khi bệnh nhân đại tiện

đến tối

D Cả 3 đáp án trên

Đáp án B

Câu hỏi lượng giá

Chọn tập hợp đúng về chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy máu:

1. Tuyệt đối tránh làm co cơ hoặc xoa bóp cơ

2. Không hút thuốc lá, uống rượu 12 giờ trước khi lấy

máu

3. Nhịn đói 2 giờ trước khi lấy máu

4. Để tránh tiêu hủy đường cho EDTA khi xét nghiệm

glucose máu

A 1,2 B 1,3 C 1,4 D 2,3

Đáp án A

Câu hỏi lượng giá

Khi lấy máu có chất chống đông, để lắc đều và không quá mạnh người ta thường:

A. Đặt ống nghiệm trên máy lắc từ

B. Lắc ống nghiệm bằng tay

C. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều trong 5 phút

D. Đặt ống nghiệm vào máy ly tâm 5000v/phút

Đáp án B

Câu hỏi lượng giá

Vị trí thường lấy máu tĩnh mạch là:

Phần 2 Phương pháp đo quang

Mục tiêu

1 Trình bày được cấu tạo máy quang phổ

2 Trình bày các phương pháp đo quang

Khái niệm về ánh sáng

2 đỉnh (peak) liên tiếp của sóng ánh sáng, đơn vị quốc tế là nm Ký hiệu:λ Tần số ánh sáng: Số sóng/giây Kí hiệu: v

là photon

• Mối liên hệ giữa năng lượng photon và

tần số ánh sáng: E=hv (1) (E: năng lượng, h: hằng số Planck 6.62x 10 27 ,v: tần số ánh

sáng/giây)

v= c/ λ (2) (c: tốc độ ánh sáng trong chân không 3X10 10 cm/s)

Kết hợp (1) và (2): E= hc/ λ

• N ăng lượng ánh sáng tỷ lệ nghịch với bước sóng Bước sóng càng ngắn,

n ăng lượng càng cao và ngược lại VD: UV 200nm có năng lượng lớn hơn

h ồng ngoại (infrared) 750 nm

Khái niệm về ánh sáng

Ứng dụng

• Ph ổ UV và khả kiến thường được dùng

nhi ều nhất trong các phòng XN hóa sinh lâm

Một số khái niệm cơ bản

• Độ thấu quang T(Transmittance):

T= It/Io

- T thường được biểu diễn dưới dạng %:

- %T= It/Io x 100%

Io: C ường độ của tia tới

It: C ường độ của tia ló

Một số khái niệm cơ bản

• Độ hấp thụ ánh sáng A (Absorbance) hay mật độ quang OD (optical density):

A = log1/T= -logT= -log It/Io

A

C Mối quan hệ giữa A và C

Một số khái niệm cơ bản

• Đường cong hấp thụ phổ (Spectral absorbance curves): Khi độ

h ấp thụ ánh sáng A của 1 chất được đo ở nhiều bước sóng liên

t ục, ta được đường cong hấp thụ phổ hay phổ hấp thụ

(absorbance spectrum) hay ph ổ quét (spectral scan)

+ Mỗi chất có phổ hấp thụ đặc trưng, được dùng xác định bước sóng tại đấy chất hấp thụ ánh sáng mạnh nhất (λ max) và

bước sóng tại đấy chất hấp thụ ánh sáng ít nhất (λ min)

+ Để có độ nhạy lớn nhất, người ta thường lựa chọn λ max trong phân tích định lượng Ngoài ra cần tính đến độ nhọn của peak,

s ự xuất hiện các yếu tố nhiễu, đặc tính dung môi

Một số khái niệm cơ bản

Định luật Lamber-Beer

• Định luật Lambert- Beer: Nồng độ của chất tan trong dung d ịch tỷ lệ thuận với lượng ánh sáng hấp thụ hay tỷ

lệ nghịch với logarit của ánh sáng truyền qua

• V ề toán học, định luật này được thể hiện bằng công th ức:

It=Io 10-aCl

A= -log1/T= -log10-aCl =aCl

A là mật độ quang, a là hệ số hấp thụ phân tử (Absorptivity), l là chi ều dày lớp dung dịch (cm), C là nồng

độ dung dịch chất hấp thụ (g/L)

• Khi C có đơn vị mol/L thì a gọi là ε (hệ số hấp thụ

phân tử gam) A=εCl

Cấu tạo của máy đo quang

 1 Nguồn sáng:

 - Cung cấp năng lượng bức xạ điện từ, phải đảm bảo các yêu cầu sau:

• Cung cấp chùm tia sáng có năng lượng đủ

• Cung cấp phổ liên tục các bước sóng trong vùng

Cấu tạo của máy đo quang

2.H ệ thống thấu kính : tạo sự ổn định và đồng nhất

c ủa chùm sáng

3 B ộ tạo đơn sắc (Monochromator): dùng tách

bước sóng hoặc lọc tia đơn sắc yêu cầu

- Dùng kính lọc hay bộ đơn sắc (lăng kính hoặc

cách tử)

Cấu tạo của máy đo quang

4 B ộ phận chứa mẫu (Sample holder) là các cuvet hay cell

- Loại cuvet: Thủy tinh hay nhựa dùng đo ở phổ khả kiến

Th ạch anh dùng đo ở phổ UV và khả kiến

- Kích thước: thường đường kính trong là 1 cm

- Cách dùng đúng:

+ Cuvet ph ải sạch, không xước, đổ dung dịch không tràn,

không ẩm ướt Không có bọt bên trong dung dịch

+ Cuvet ph ải rửa sạch ngay lập tức sau dùng

+ Không ngâm cuvet trong xà phòng, acid chromic hay dung d ịch kiềm lâu Kiềm hòa tan thủy tinh, acid chromic hấp

th ụ vào thủy tinh, làm biến màu

+ Cuvet bẩn thường ngâm trong hỗn hợp HCl: ethanol: nước (1:8:6) Sau đó rửa bằng nước, xà phòng pha loãng, rửa lại bằng nước, tráng lại bằng nước cất Úp ngược trên bề mặt mềm, sạch để làm khô

Cấu tạo của máy đo quang

Phân loại các máy hóa sinh

Các máy hóa sinh được sử dụng trong phòng xét nghi ệm gồm 2

l oại chính

• Quang kế

• Quang ph ổ kế