Bài giảng Ứng dụng kỹ thuật Elisa trong phân tích dịch sinh học

Trang 1 Ứng dụng kỹ thuật Elisa trongphân tích dịch sinh họcBộ môn Y Dược học cơ sởKhoa Y DượcĐại học Quốc Gia Hà Nội Trang 2 Mục tiêu học tập• Giải thích nguyên lý kĩ thuật Elisa• Trìn

Ứng dụng kỹ thuật Elisa trong

phân tích dịch sinh học

Bộ môn Y Dược học cơ sở

Khoa Y DượcĐại học Quốc Gia Hà Nội

BS Nguyễn Thị Thúy Mậu

Mục tiêu học tập

• Giải thích nguyên lý kĩ thuật Elisa

• Trình bày các bước tiến hành kĩ thuật Elisa

trong phân tích dịch sinh học

• Thực hiện kĩ thuật Elisa để phân tích dịch sinhhọc

Cơ chế của miễn dịch Elisa

• Kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể,

trong đó kháng thể được gắn với enzyme

• Thêm cơ chất, enzym thủy phân cơ chất thànhchất có màu

• Dựa vào sự xuất hiện màu, đánh giá nồng độcủa kháng nguyên/kháng thể cần phát hiện

Phản ứng trong Miễn Dịch Elisa

• 2 loại phản ứng xảy ra trong kĩ thuật Elisa

Phản ứng Miễn Dịch học: là sự kết hợp khángnguyên –kháng thể

Phản ứng hóa học:

Ứng dụng kĩ thuật elisa

• Đo nồng độ kháng thể: vaccin, dị ứng…

• Phát hiện vius: HIV, viêm gan B…

• Thay đổi hormon: khi mang thai

• Phát hiện ra các chất chỉ điểm ung thư: Kgan,

K tiền liệt tuyến, K vú…

Các loại miễn dịch ELisa

Direct Elisa

Indirect Elisa

Elisa sandwich

Elisa cạnh tranh

Direct Elisa

Indirect Elisa

Elisa sandwich

Elisa cạnh tranh

UD MD Elisa trong phát hiện kháng thể

kháng ấu trùng sán dây lợn

Chuẩn bị nước rửa và mẫu

• Chuẩn bị nước rửa: pha toàn bộ 25 ml Wash Concentrate (20X) với 475ml nước cất

• Pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1: 64 sử dụng

dilution buffer (5µl huyết thanh bệnh nhân và315µl dilution buffer)

UD MD Elisa trong phát hiện kháng thể

kháng ấu trùng sán dây lợn

• Lấy số giếng cần thiết, 2 giếng cho control, và số giếng theo số mẫu

• Thêm 100µl chứng âm, 100µl chứng dương, và 100µl mẫu được

pha loãng theo tỉ lệ 1:64 Chứng âm và dương đã được pha loãng trước Không pha loãng thêm

• ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

• Lắc giếng và rửa 3 lần với buffer pha loãng

• Thêm 2 giọt (100µl) Enzyme conjugate vào mỗi giếng

• ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút

• Lắc đĩa và rửa 3 lần với nước rửa buffer

• Thêm 2 giọt (100µl) chất tạo màu Chromogen TMB vào mỗi giếng

• ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

• Thêm 2 giọt (100µl) Stop Solution và trộn đều

UD MD Elisa trong phát hiện kháng thể

kháng ấu trùng sán dây lợn

• Đọc kết quả

• Đọc bằng mắt thường: nhìn mỗi giếng trên nền giấy

trắng, đánh giá kết quả trắng hay phản ứng +, ++, +++

• Máy đo quang: đọc ở bước sóng 450/650-620nm

• Kiểm soát chất lượng

• Âm tính: 0.0-0.3 OD units

• Dương tính: >=0.5 OD units

• Diễn giải kết quả

• Đọc các giếng ở 450/650 -620nm

• Dương tính: độ hấp thu >= 0.3 OD units

• Âm tính: độ hấp thu < 0.3 OD units