Bước đầu ứng dụng kỹ thuật southern blot phân tích đa dạng di truyền nấm magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  ĐẶNG TRẦN ANH THƢ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn LÊ ĐÌNH ĐƠN Sinh viên thực ĐẶNG TRẦN ANH THƢ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  POPULATION STRUCTURE OF Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor LE DINH DON Student DANG TRAN ANH THU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ  TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Mơn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Đã tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập để hồn thành khóa luận tốt nghiệp TƠI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đơn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ chúng tơi hồn thành khóa luận Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí tạo điều kiện cho chúng tơi thực tập Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Thầy Nguyễn Đức Sáng giúp đỡ tơi hóa chất vật liệu nghiên cứu thời gian làm đề tài Anh Nguyễn Văn Lẫm nhiệt tình dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Các anh chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, anh chị mơn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ chúng tơi hồn thành khóa luận Các thành viên lớp Cơng Nghệ Sinh Học 28 động viên, giúp đỡ thời gian thực tập CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN Cha Mẹ, em người thân gia đình ủng hộ hỗ trợ mặt vật chất tinh thần để hồn thành tốt khóa học TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006 Đặng Trần Anh Thư i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT KHÓA LUẬN  ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2006 “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn lúa” Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐƠN  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP cở sở phương pháp Southern blot phân tích khác biệt thay đổi cấu trúc gen dẫn đến phân tích tính đa dạng di truyền số dịng nấm Magnaporthe grisea  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền số dòng nấm Magnaporthe grisea, làm sở để đánh giá có phương pháp phòng trị cho phù hợp  Phƣơng pháp nghiên cứu: - Thực ly trích phân cắt genomic DNA enzyme cắt giới hạn - Tiến hành phân tách đoạn DNA cắt giới hạn gel agarose, chuyển cố định DNA lên màng - Thực phản ứng lai với phân tử probe DNA plasmid đánh dấu phát huỳnh quang - Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền  Kết quả: - DNA ly trích tốt thực thành công phản ứng cắt giới hạn - Biến nạp ly trích thành cơng loại plasmid cung cấp để đánh dấu sư dụng cho phản ứng lai phát MAGGY genome M grisea - Thực phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối chứng plasmid pMGY-SB  Kết luận : Do quy trình Southern blot chưa hồn thiện điều kiện phịng thí nghiệm TT PTTNHS trường Đại học Nông Lâm hạn chế mặt thời gian nên kết phản ứng lai khơng đến thành cơng Do đó, khơng có sở để phân tích đa dạng di truyền nấm M grisea ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii Danh sách bảng viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lúa 2.2 Bệnh cháy lúa (đạo ôn) 2.2.1 Sự xuất bệnh cháy lúa 2.2.2 Triệu chứng bệnh lúa bị bệnh cháy lúa 2.2.3 Đặc điểm phát sinh bệnh 2.2.4 Nguyên nhân gây bệnh 2.3 Phương pháp Southern blot 2.4 Enzyme cắt giới hạn 2.5 Các phương pháp chuyển DNA lên màng 2.5.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên 2.5.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống 2.5.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều 2.5.4 Phương pháp chuyển điện 2.5.5 Phương pháp chuyển chân không 2.6 Probe đánh dấu sử dụng Southern Blot 10 2.7 Cơ sở đa hình quần thể nấm M grisea 10 2.8 Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm M grisea 12 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 14 3.2 Đối Tượng khảo sát 15 3.3 Nội dung thực 15 3.4 Vật liệu hóa chất 16 3.4.1 Dụng cụ thiết bị 16 3.4.2 Hóa chất 16 3.5 Phương pháp nghiên cứu 17 3.5.1 Triết tách DNA tổng số từ mẫu nấm M grisea (isolate) 17 3.5.1.1 Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm 17 3.5.1.2 Ly trích DNA theo phương pháp lysis 18 3.5.1.3 Phương pháp tinh DNA 18 3.5.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 18 3.5.2.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 18 3.5.2.2 Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình Sambrook cộng sự, 1989) 19 3.5.2.3 Kiểm tra kết biến nạp 19 3.5.2.4 Tăng sinh vi khuẩn ly trích plasmid kit 21 3.5.3 Thực đánh dấu plasmid 22 3.5.4 Tạo mẫu lai 22 3.5.4.1 Thực phản ứng cắt genomic DNA enzyme cắt giới hạn 23 3.5.4.2 Điện di sản phẩm cắt gel agarose 23 3.5.4.3 Chuyển DNA từ gel lên màng phương pháp mao dẫn hướng lên 24 3.5.4.4 Làm khô màng 25 3.5.4.5 Cố định DNA lên màng 25 3.5.5 Lai southern 26 3.5.5.1 Thực phản ứng lai 26 3.5.5.2 Rửa màng sau lai 26 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.5.5.3 Phát kết phim X-ray 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Ly trích DNA tổng số nấm M grisea 28 4.2 Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α 30 4.3 Thiết lập phản ứng cắt DNA genome M grisea enzym cắt giới hạn 31 4.4 Phản ứng lai DNA M grisea sau cắt EcoRV BamHI với probe SB 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 TÀI NIỆU THAM KHẢO 49 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair B: Bam HI Ctv cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol DIG: Digoxigenin E: Eco RV ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid H: Hind III HRP: Horseradish peroxydase Kb: kilobase PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid RT: Reverse transcrip SDS: Sodium dodecyl sulfate SSC: Saline sodium citrate TAE: Tris Acetate EDTA TBE: Tris-base Boric EDTA UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Triệu chứng bệnh đạo ôn lúa (a) cổ (b) Hình 2.2 Bào tử nấm M grisea chụp kính hiển vi Hình 2.3 Vịng đời nấm M grisea Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn MAGGY 10 Hình 4.1 DNA tổng số nấm M grisea 28 Hình 4.2 DNA nguồn nấm M grisea sau xử lý với RNAse 30 Hình 4.3 Kết ly trích plasmid điện di gel agarose 0,8 31 Hình 4.4 Kết thực phản ứng cắt DNA tổng số enzyme giới hạn 32 Hình 4.5 Kết điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai 34 Hình 4.6 Kết phát X-ray film 35 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 - Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa Nhiệt độ số vòng quay buồng lai giống lai, thời gian rửa 10 phút - Lặp lại bước 10 phút - Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng cho vào hộp nhựa với bề có DNA nằm Cho vào dung dịch rửa (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ nhiệt độ phòng 10 phút - Lặp lại bước 10 phút Lúc màng giữ dung dịch rửa 30 phút để chuẩn bị cho bước phát 3.5.5.3 Phát kết bắt cặp probe đoạn DNA đích huỳnh quang thể X-ray phim  Chuẩn bị màng với chất phát CDP - Star Màng sau rửa lần 2, phủ lên lớp dịch chất phát hiện, chất làm cho phân tử probe phát sáng Các bước thực sau: - Dùng saran wrap trải mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ lớp khăn giấy - Lấy màng từ dung dịch rửa ra, phải đặt lên miếng saran wrap với bề có DNA hướng lên - Hút 1000 µl chất phát CDP- Star nhỏ lên màng - Dùng saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải chất phát que thủy tinh, tránh để lại bọt khí - Sau đó, màng lai lấy ra, đặt hai miếng saran wrap với kích thước phù hợp (chú ý q trình thao tác với màng khơng để màng bị khô)  Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim cassette Màng đặt Cassette 30 x 40 Konica, sau đặt phim Konica 30 x 40 cm lên màng tránh dịch chuyển màng Đậy cassette lại tính thời gian ủ 30 phút (thường phản ứng có tín hiệu sáng tốt sau từ cho chất phát vào) Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát khác Các thao tác thực buồng tối LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 Khi hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim đem khỏi cassette ngâm dung dịch developer phút Sau đó, lấy phim ngâm dung dịch fixer khoảng phút Cuối đem phim rửa vòi nước dùng kẹp treo lên giá làm khơ nhiệt độ phịng PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ly trích DNA tổng số nấm M grisea Giai đoạn tách chiết DNA giai đoạn dễ thực không đơn giản Để triết tách lượng DNA tốt sử dụng cho nghiên cứu sau này, ngồi phương pháp cần phải có kinh nghiệm thao tác Giai đoạn đóng vai trò quan trọng cho phép phản ứng lai thành công hay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lượng DNA có mẫu lượng DNA phải đủ lớn để phát qua lai với probe Các thao tác phải nhẹ nhàng để tránh DNA bị gãy Kết tách chiết có ý nghĩa cao phải đảm bảo độ tinh khiết cao không cịn hóa chất ly trích sót lại Sau tiến hành tách chiết DNA theo qui trình, chúng tơi thu lượng DNA mẫu sau: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 CT80 LA9 CT178 AG518 TG24 CT72 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT74 CT64 KG398 KG531 CT63 LA2 CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531 Hình 4.1 DNA tổng số nấm M grisea Nấm sau nuôi cấy máy lắc định ôn 370C, qua 72 ly trích DNA, DNA sau ly trích điện di gel agarose 0,8%, dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện 100V, thời gian 30 phút Kết điện di hình 4.1 cho thấy, tất mẫu thu DNA tổng số có nồng độ cao bị đứt gãy Tuy nhiên, mẫu lẫn tạp chất nhiều Các vệt sáng kéo dài phía RNA DNA bị đứt gãy Lỗi la lắc mạnh trình sau cho phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), khiến DNA bị đứt gãy nhiều Mặt khác q trình ly trích tơi khơng sử dụng enzym RNAse nên lượng RNA lẫn tạp mẫu nhiều Riêng mẫu CT72 CT64 có hai băng, điều lý giải q trình ni cấy mẫu bị nhiễm khuẩn DNA genomic vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ nên di chuyển trước tạo thành băng Từ thực nghiệm, rút điểm cần lưu ý q trình ly trích: - Cần đảm bảo vơ trùng tuyệt đối trình cấy tăng sinh khối sợi nấm Nếu môi trường tăng sinh không bị nhiễm khuẩn sau ta thu sinh khối phần sợi nấm phần dịch cịn lại có màu vàng óng - Bước thu sinh khối khơng nên để sợi nấm khô, tốt nên nghiễn sinh khối nấm nitow lỏng sau thu thí chất lượng DNA tốt LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 - Thao tác phải nhẹ nhàng ly trích, dặc biệt sau thêm hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), nên nghiêng ống nghiệm (hoặc eppendorf) cách cẩn thận không nên lắc mạnh - Thu phần dịch không nên hút phần cặn phía dưới, đặc biệt khơng hút vào phenol phía Phenol phá hủy DNA sau ly trích - Khi thêm isopropanol (ethanol 100%) ta nên ủ tủ -200C 3060 phút, để DNA tủa hồn tồn - DNA phải rửa nhiều lần với ethanol 70% để loại bỏ bớt tạp chất nên làm khơ DNA hồn tồn (có thể để tủ cấy qua đêm) - Khi điện di DNA tổng số nồng độ gel từ 0,6-0,8% phù hợp Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng cắt phản ứng lai xảy tốt biết nguyên nhân phản ứng không cho kết tốt, tơi cố gắng hồn thiện tốt giai đoạn Sản phẩm ly trích cịn nhiều tạp nhiễm, tiến hành loại bỏ tạp nhiễm RNAse CT178 AG518 LA415 LA18 CT72 TG24 CT104 CT375 KG531 VL265 VL37 KG535 KG483 CT72 VL52 VL45 KG398 KG109 CT72 CT80 KG216 KG390 Hình 4.2 DNA nguồn nấm M grisea sau đƣợc xử lý với RNAse DNA sau tinh điện di gel agarose 0,8%, dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện 100V, thời gian 30 phút Nhìn chung, kết tinh tương đối tốt DNA bị đứt gãy nhiều Một số mẫu khơng có DNA mà vệt sáng mờ mẫu CT375, KG535, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 CT72, KG531 Nguyên nhân thao tác khơng cẩn thận làm DNA bị đứt gãy DNA khơng tủa hồn tồn khơng thu DNA Để khắc phục tượng đề nghị nên sử dụng NaOAc kết hợp với ethanol để DNA kết tủa tốt Tuy nhiên với dộ tinh ta sử dụng để thực làm mẫu cho phản ứng lai 4.2 Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α Sau biến nạp, chọn phương pháp chọn lọc trực tiếp môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 70µg/ml, để chọn lọc dịng vi khuẩn E.coli DH5α có chứa plasmid Kết ly trích vi khuẩn E.coli DH5α nuôi cấy lắc qua đêm nhiệt độ 370C: Hình 4.3 Kết ly trích plasmid điện di gel agarose 0,8% DNA plasmid ly trích từ vi khuẩn E.coli DH5α tăng sinh mơi trường LB chứa 70µg/ml Ampicilin Plasmid điện di gel agarose 1%, dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện 50V, thời gian 45 phút Mẫu pMGY-SB (1,2), pEBA 18 (3,4), pMGR-T1 (5,6) Kết cho thấy q trình biến nạp thành cơng vi khuẩn chứa plasmid sống mơi trường kháng sinh (70 g/ml) Các mẫu 2,4,6 mẫu plasmid chuẩn cung cấp để thực biến nạp, mẫu 1, mẫu plasmid ly trích có sử dụng RNAse, mẫu khơng sử dụng enzyme RNAse q trình ly trích nên cịn lẫn tạp chất nhiều Kết ly trích khơng có lẫn DNA genomic vi khuẩn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 Riêng mẫu có hai băng, nguyên nhân plasmid tồn hai dạng: dạng vòng dạng xoắn 4.3 Thiết lập phản ứng cắt DNA genome M grisea enzym cắt giới hạn Trong 30 dịng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tơi chọn 10 dịng để thực phản ứng cắt với hai enzym BamHI EcoRV, nhằm chuẩn bị mẫu cho phản ứng lai Tôi thực phản ứng cắt với thể tích 40µl, nồng độ mẫu DNA cắt µg, ủ 370C qua đêm Sau đó, hút µl sản phẩm cắt điện di kiểm tra gel agarose 0,8%, kết điện di sau: 8 10 a) b) Hình 4.4 Kết thực phản ứng cắt DNA tổng số enzyme giới hạn Sản phẩm cắt điện di gel agarose 0,8%, đệm TAE 0,5X, hiệu điện 50V, thời gian Hình a) mẫu DNA cắt enzyme BamHI, hình b) mẫu DNA cắt EcoRV Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 Kết cho thấy sản phản ứng cắt khơng hồn tồn mẫu số hai enzym EcoRV BamHI Phản ứng cắt khơng tốt mẫu DNA ly trích khơng tốt nên khơng thực phản ứng cắt Những mẫu cắt khơng hồn tồn mẫu cắt q vụn khơng có ý nghĩa trình tạo mẫu lai Phản ứng cắt khơng hồn tồn ngun nhân nồng độ DNA nhiều so với nồng độ mà đơn vị enzym cắt 4.4 Phản ứng lai DNA M grisea sau đƣợc cắt EcoRV BamHI với probe SB Thí nghiệm 1: Lai 550C, thời gian lai 16 giờ, thời gian ủ phát 30 phút Sản phẩm cắt DNA genome M grisea với hai enzyme EcoRV BamHI dùng làm mẫu lai, 15 µl mẫu load miếng gel agarose 0,8% kích thước 20 x 15 x 0,7 cm Plasmid pMGY-SB bố trí mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai Probe đánh dấu sử dụng cho phản ứng lai plasmid pMGY-SB có kích thước 3,54 kp Điện di thực đệm TAE 0,5X, hiệu điện 50 V, thời gian DNA sau điện di chuyển lên màng thời gian 16 Sau đó, tiến hành phản ứng lai 550C, thời gian 16 tiếng Tôi thực bước phát hiện, tác nhân phát cho trực tiếp lên màng lai, để – phút nhiệt độ phịng, sau loại bỏ tác nhân phát thừa ủ màng lai với phim thời gian 30 phút Rửa phim với dung dịch rửa phim Sản phẩm lai xuất phim sau rửa Đây kết bắt cặp probe đánh dấu với DNA plasmid DNA genomic nấm M.grisea sau ly trích Các mẫu DNA cắt enzyme BamHI EcoRV bắt cặp với probe không xảy Kết chứng minh DNA biến tính hồn tồn gel bắt cặp với probe đánh dấu, nhiệt độ lai 550C, thời gian lai 16 probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu, khơng đặc hiệu Điều chứng tỏ nhiệt độ lai thấp Tuy nhiên, mẫu sử dụng làm thí nghiệm khơng có tượng bắt cặp Điều lý giải từ nguyên nhân sau: - Phản ứng cắt genomic DNA enzyme giới hạn chưa hoàn chỉnh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 - Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn nồng độ gel cao kích thước gel dày (0,7cm), kích thước DNA lớn nên khó chuyển lên màng - Trình tự DNA mục tiêu diện màng ít, probe khơng thể phát - Sự liên kết trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên trình rửa màng, probe bị trơi theo dung dịch rửa Thí nghiệm 2: Lai 600C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút Tôi thực phản ứng lai với mẫu LA415 (1), LA18 (2), VL265 (3), VL 37 (4), VL 52 (5), VL45 (6), AG 518 (7), TG24 (8), KG535 (9) cắt hai enzyme BamH I Eco RV Khắc phục nguyên nhân nêu thí nghiệm tơi thực bước có cải tiến 30 µl mẫu load vào giếng miếng gel kích thước 20 x 15 x 0,5 cm, điện di thực đệm TAE 0,5X, hiệu điện 50 V, thời gian Thời gian chuyển DNA lên màng 20 Tôi thực phản ứng lai 600C, thời gian 20 tiếng Kết thực sau: ĐC(+) BamHI 9ĐC (+)1 EcoRI Hình 4.5 kết điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 Sản phẩm cắt điện di gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện 50V, thời gian giờ, đệm TAE 0,5X Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)) Kết tạo mẫu lai cho thấy sản phẩm cắt chưa tốt để thực phản ứng lai Các mẫu bị cắt vụn nên mẫu điện di bị chạy sau thời gian điện di dài Mẫu đánh giá tốt So sánh kích thước sản phẩm cắt với plasmid pMGY-SB có kích thước 3,52 kb, ta thấy đoạn DNA cắt từ genome có kích thước nhỏ 3,5 kb, từ nhận xét kích thước đoạn phân cắt nhỏ điều ảnh hưởng tới khả bắt cặp DNA mục tiêu với probe Các băng điện di không thẳng điện cực máy điện di khơng ổn định q trình điện di bồn điện di bị rung trình điện di Trong điều kiện này, kết điện di tạo mẫu lai không phản ánh thực di chuyển theo kích thước đoạn DNA từ kết phản ứng lai khơng có ý nghĩa phân tích đa dạng Những kết luận rút : - Sản phẩm cắt phải có nồng độ - Sản phẩm cắt phải tạo thành vết sáng đêu gel sau điện di (smear) dùng làm mẫu cho phản ứng lai - Hiệu điện không nên cao chạy 30V thời gian khoảng 32 h (Le Dinh Don, 2000) - Nồng độ gel từ 0,7-0,8% phù hợp để DNA chuyển lên màng sau điện di - Dung dịch đệm điện di phải đảm bảo q trình chuyển lên màng thành cơng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 ĐC(+) BamHI 9ĐC (+)1 EcoRI Hình 4.6 Kết phát X-ray film Kết lai với probe pMGY-SB, Lai 55oC, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút Sản phẩm cắt điện di gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện 50V, thời gian giờ, đệm TAE 0,5X Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)) Quy trình thực có cải tiến kết không thay đổi nhiều Tất mẫu lai cắt hai enzym cắt BamHI EcoRV sau chuyển lên màng, lai với probe cho kết âm tính phát X-ray film Mẫu đối chứng dương sản phẩm có kích thước nhỏ chứa trình tự bổ sung với probe, nên khả bắt cặp với probe cao Bảng 4.1 Những khó khăn giải pháp khắc phục thực phản ứng lai Southern Phương pháp Khó khăn Cách giải thực phản ứng cắt Thể tích phản ứng lớn đọng sản phẩm cắt với thể tích lớn để khó bơm vào giêng phương pháp sau: tạo lượng mẫu điện di - thêm NaOAc (1/10V) có nồng độ cao - thêm ethanol 100% (2V) Điện di tạo mẫu lai thực trình Điện di hiệu điện điện di khó đạt 30V, thời gian >4 giờ, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 điện di đệm TBE 1X để phân tách DNA tốt Chuyển lên màng DNA chuyển lên màng Thực điện di khơng hồn tồn, khó gel nồng độ thấp độ gắn kết lên màng dày nhỏ 0,5 cm Có thể thực chuyển điện Q trình phơi khơ màng nên phơi khô 800C vaif thực phản ứng lai Lai không chuyên biệt, Nhiệt độ lai tăng bắt cặp khơng hồn tồn lên 680C, để bắt cặp chuyên biệt So sánh với kết Nguyễn Văn Lẫm Lê Minh Kha (2005), sản phẩm PCR có kích thước 6,26 bp sử dụng để đánh dấu probe đồng thời sử dụng làm đối chứng dương Kết phản ứng lai có mẫu đối chứng dương (sản phẩm PCR) cho tín hiệu bắt cặp sau lai Nguyên nhân mà Nguyễn Văn Lẫm Lê Minh Kha (2005) đưa nồng độ DNA thấp không đủ tín hiệu để phát bắt cặp trình tự đích probe, ngun nhân thứ hai DNA khơng chuyển hồn tồn lên màng bắng phương pháp mao dẫn hướng lên Khắc phục nguyên nhân thứ tiến hành tạo mẫu DNA với nồng độ cao (2µg), để tạo phản ứng cắt cắt lượng DNA có nồng độ cao phải thực thể tích lớ, điều lại gây khó khăn việc load mẫu điện di DNA load đầy giếng làm đo lượng mẫu sau điện di không cô đọng lại đáy miếng gel từ tạo khoảng cách lớn DNA cần chuyển với màng nitrocellulose dẫn đến hiệu chuyển không tốt Qua thực nghiệm rút kinh nghiệm sau: (Bảng 4.1) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Những nội dung thực đưa tơi hồn thành nội dung sau: - Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea, DNA ly trích sử dụng cho phản ứng lai - Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA enzyme cắt giới hạn tốt - Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 - Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn - Thực phản ứng đánh dấu plasmid pMGY-SB thành công cho phản ứng lai - Tạo mẫu cho trình lai hoàn thành chưa thực tốt cần phải có nhiều cải tiến 5.2 Đề nghị LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Với thuận lợi sẵn có trang thiết bị, điều kiện làm việc tầm quan trọng việc nghiên cứu đa dạng di truyền nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ơn nước ta, chúng tơi có vài đề nghị sau: - Tiếp tục hoàn thiện quy trình Southern blot - Tiếp tục hồn thiện việc phân tích đa dạng di truyền nấm M grisea phương pháp RFLP TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Huỳnh Văn Thái, Phạm Duy, 2005 Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP HCM Lê Minh Kha, Nguyễn Văn Lẫm, 2005 Thiết lập quy trình Southern blot Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công NGhệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP HCM Lê Minh Triết, 2003 Bài Giảng Môn Học Cây Lúa Khoa Nông Học- Đại Học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh Học Phân Tử-Giới Thiệu Phương Pháp Ứng Dụng Nhà xuất Nông Nghiệp TP HCM, trang 63-74 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Nguyễn Thị Thư Hương, 2004 Xác định gen gây độc nấm Metarrhizium ký sinh sâu hại trồng kỹ thuật PCR Luận án thạc sĩ Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Võ Thị Thu Oanh, 2000 Bệnh Cây Chuyên Khoa Khoa Nông Học- Đại Học Nông Lâm TP HCM TÀI LIỆU TIẾNG ANH Derek Robinson, Paul R.Walsh, and Joseph A Bonventre, 2001 Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide Wiley-Liss, Inc, p 224-244 Hitoshi Nakayashiki, Kanako Kiyotomi, Yukio Tosa, and Shigeyuki Mayama, 1999 Transposition of the Retrotransposon MAGGY in Heterologous Species of Filamentous Fungi Laboratory of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kobe University, Kobe 657-8501, Japan Hamer JE, Farral L, Orbach MJ, Valent B, Chumley FG, 1989 Host speciespecific conservation of a family of repeat DNA sequences in the genome of a fungal plant pathogen Proc Nat Acad Sci USA 86: 9981-9985) 10 Jose Romao and John E Hamer, 1992 Genetic organization of repeated DNA sequence family in the rice.department ò Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette 11 Le Dinh Don, 2000.DNA-fingerprinting Analysis and PCR-based Diagnosis of the Population of Magnaporther grisea The Graduate School of Science and Technology Kobe University, pp 31-37 12 Le Dinh Don,Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999 Annals of the Phytopathological Scociety of Japan 13 Motoaki Kusaba, Yukio Eto, Le Dinh Don, Natsuka Nishimoto, Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999 Genetic diversity in Pyricularia isolates from varios Hosts Revealed by Polymorphisms of Nuclear Ribosomal DNA and the Distribution of the MAGGY Retrostranposon Annals of the Phytopathological Society of Japan LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 14 Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Volume 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 15 Verel Shull John E Hamer, 1996 Springer- Verlag 16 Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki, Hideyuki Hyodo, Shigeyuki Mayama, Hạime Kato and Sally A Leong, 1995 Ann Phytopathol Soc Jpn Support 17 Y Eto, K Ikeda, I Chuma, T Kataoka, S Kuroda, N Kikuchi, L D Don, M Kusaba, H Nakayashiki, Y Tosa, S Mayama, 2000 Comparative analyses of the distribution of various transposable element in Pyricularia and their activity during and after the sexual cycle Springer-Verlag CÁC TRANG WEB http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm http://www.biology.kenyon.edu/Mycrobial_Biorealm/eukaryote/magnaporthe/magnap orthe.html http://www.cbwinfo.com/Biological/PlantPath/PyG.html LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích đa dạng di truyền nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn lúa? ??, nhằm phân tích cấu trúc di truyền dịng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn lúa. .. HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA... “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn lúa? ?? Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐƠN  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân