BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\ BÀI BÁO CÁO ĐÊ TÀI 09: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEO Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện: TS.NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN XUÂN KHÁNH Lớp: DH06SH MSSV: 06126055 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục: I.Đặt vấn đề I.1 Đặt vấn đề I.2 Mục tiêu II Tổng quan II.1Giới thiệu dịch tả heo II.1.1 Hình thái cấu trúc virus dịch tả heo .4 II.1.2.Tính chất kháng nguyên II.1.3 Tính sinh miễn dịch II.2.Nguyên lý sử dụng Kit Elisa: .5 III Vật liệu phương pháp tiến hành III.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc thiết bị làm thí nghiệm III.2.Phương pháp tiến hành: III.2.1.Chuẩn bị .7 III.2.2.Phương pháp: III.2.2.1.Phân phối đối chứng mẫu III.2.2.2.Thêm kháng huyết III.2.2.3 Thêm conjugate: .8 III.2.2.4 Phát hiện: III.2.2.5 Xử lý số liệu IV Tài liệu tham khảo: 10 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I.Đặt vấn đề I.1 Đặt vấn đề Nghành chăn nuôi đóng vai trị quan trọng việc cung cấp thực phẩm cho nhu cầu nước xuất Bên cạnh thành công chăn nuôi, diện số dịch bệnh thường xuyên gây tổn thất đáng kể nghành chăn nuôi Một yếu tố nguy phải kể đến bệnh dịch tả heo Bệnh xuất nước, xảy tương đối nghiêm trọng nhiều tỉnh thành phía nam Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, xảy lứa tuổi heo, gia súc non, tỷ lệ chết lên tới 100% Heo nái mang trứng tạo cảm nhiễm qua thai, gây chết phơi, sẩy thai… Vì vậy, tổ chức dịch tể giới xếp bệnh thuộc bảng A, bảng danh mục bệnh nguy hiểm Xuất phát từ tình hình trên, nên việc nghiên cứu phương pháp phát bệnh yêu cầu cấp thiết để phịng chống bệnh, giảm tổn thất chăn ni, giữ cho đàn heo mắc bệnh tỷ lệ thấp Có nhiều phương pháp phát bệnh nghiên cứu, tơi trình bày phương pháp ELISA gián tiếp để phát virus dịch tả heo I.2 Mục tiêu: Sử dụng kit Elisa để phát bệnh dich tả heo sớm 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II Tổng quan II.1Giới thiệu dịch tả heo II.1.1 Hình thái cấu trúc virus dịch tả heo a Phân loại Họ Flavividae Giống Pestivirus Virus dịch tả heo gần mặt cấu trúc gen cấu trúc kháng nguyên vơi loài sau: Bovine diarrhea virus Equine arteritis virus Border diesease virus b.Hình thái, cấu tạo: Kích thước nhỏ 40-50 nm Có dạng hình cầu với cấu trúc nucleocapsid đối xứng 20 mặt Bộ gen virus chuỗi RNA, độ dài khoảng 12.5kb, khung đọc mở (ORF) Có vỏ bọc, vỏ có tua gai với chất glycoprotein.Virus dịch tả heo có glycoprotein E1 (55 kDa) E2 (46 kDa) bề mặt protein 36 kDa nucleocapsid Protein cấu trúc: P14 tạo nucleocapsid, gp48, gp 25, gp 53 P125 protein không cấu trúc, có đầu amio acid ưa nước hoạt tính protease Người ta cho protein tham gia vào q trình nhân đơi DNA c Tính chất lý hóa Virus dịch tả heo coi virus có sức đề kháng yếu Ổn định PH 5-10, ngồi khoảng PH virus bị phá hủy nhanh Những chất tan lipid ether, chloroform deoxycholate làm bất hoạt virus nhanh 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II.1.2.Tính chất kháng nguyên Kháng thể kháng virus dịch tả heo phát kỹ thuật huyết học khác phản ứng trung hòa, kết tủa khuếch tán thạch, kết hợp bổ thể, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu thụ động Chỉ có typ kháng nguyên dịch tả heo, nhiên, nghiên cứu định lượng phản ứng trung hịa huyết thanhcho phép phân biệt hai nhóm phụ huyết thanh: Nhóm phụ A: bao gồm chủng cường độ chủng độc lực thấp, chủng biến đổi Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản II.1.3 Tính sinh miễn dịch Miễn dịch xuất heo khỏi bệnh dịch tả heo dài chắn Tuy nhiên, chủng virus dịch tả heo mãn tính hay cận lâm sàng có tính sinh miễn dịch yếu Tính sinh miễn dịch truyền cho heo (qua sữa đầu) heo nái khỏi bệnh, tính miễn dịch trì khoảng tuần lễ II.2.Nguyên lý sử dụng Kit Elisa: Dưa nguyên tắc kết hơp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Kit SERELISA® HCV Ag sử dụng kỹ thuật miễn dịch gián tiếp cho việc phát kháng nguyên (p125 khơng cấu trúc protein), mà có tối thiểu epitope chung cho tất dòng Hog Cholera Virus Việc phát thực trực tiếp mẫu máu, huyết tương , huyết thanh, bạch cầu, dịch chiết mô, cho phép xác định sớm heo bị nhiễm virus Gồm bước: Các đối chứng mẫu cho vào giếng có kháng thể đơn dòng kháng HCV (p125) Protein virus diện mẫu gắn với vị trí chuyên biệt 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau bước rửa để loại bỏ đoạn không liên kết, thêm vào kháng huyết thỏ kháng HCV Nó gắn kết với kháng nguyên diện mẫu Tiến hành rửa lần hai, sau cho kháng thể dê kháng kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase cho phép phát dạng kháng huyết thỏ kháng HCV theo phức hợp: (Mab) - (Ag HCV [p125]) - (Rabbit Ig anti-HCV [p125]) - (Goat Ab anti-rabbit Ig /peroxidase) Sau bước rửa thứ 3, enzyme gắn conjugate phát việc thêm vào chất làm biến đổi thành sản phẩm có màu Cường độ màu ghi lại dùng để xác định có hay khơng có diện kháng nguyên, dựa giá trị ngưỡng có nhờ mẫu đối chứng dương III Vật liệu phương pháp tiến hành: III.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc thiết bị làm thí nghiệm • Dụng cụ Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nước đá, bình tam giác, kit SERELISA® HCV Ag • Các thiết bị, máy móc Bồn ổn nhiệt Máy li tâm Tủ lạnh Máy đo OD Tủ sấy dụng cụ • Thành phần kit: Conjugate: phức hợp kháng huyết dê kháng kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase, (nồng độ 10X) Kháng huyết thỏ kháng HCV [p125] nồng độ 10X ( anti-HCV [p125] rabbit antiserum- AS ) Dung dịch chất peroxidase (Buffered peroxidase substrate (PS) ) Đối chứng âm ( Negative control (N)) 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đối chứng dương ( Positive control (P)) Mẫu máu pha loãng (Blood sample diluent (SD)) Dung dịch rửa (W) (10X nồng độ) Conjugate kháng huyết pha loãng (CD) Dung dịch dừng phản ứng (S) Các màng dính • Vật liệu u cầu chất phản ứng Nước cất nước khử ion Điều chỉnh cài đặt pipet để ước lượng phân phối đến 1000 μl Sai số đo lường ≤ 10% cho thể tích ≤ 10 μl và≤ 5% cho tất thể tích khác Xi lanh chia độ (100 ml and 1000 ml) Dụng cụ rửa tay, tự động bán tự động cho vi chuẩn độ Máy đo OD 450 630 nm, đọc với bước sóng 450 nm • Mẫu Kiểm tra thực trực tiếp mẫu máu với chất kháng đông, huyết thanh, huyết tương pha loãng 1:2, bạch cầu dịch chiết mô Mẫu nên lưu trữ sau: III.2.Phương pháp tiến hành: Sử dụng đối chứng âm đối chứng dương cho lần kiểm tra, cho đĩa 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III.2.1.Chuẩn bị Cẩn thận cho việc phân phối xác định đối chứng mẫu Tất thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng (18-25oC) trước sử dụng. III.2.2.Phương pháp: III.2.2.1.Phân phối đối chứng mẫu a, Phân phối đối chứng: Đối chứng sẵn sàng sử dụng Lắc ống đựng đối chứng, cho 100µ đối chứng âm vào giếng A1, A2, cho 100µl đối chứng dương vào giếng B1, B2 b,Phân phối mẫu: Mẫu huyết thanh, huyết tương, mẫu máu kiểm tra sau pha loãng với tỷ lệ 1:2 trực tiếp giếng, dùng 100µl/giếng Phân phối 50µl mẫu pha lỗng(SD) thêm 50µl mẫu kiểm tra Mẫu bạch cầu dịch chiết mô: phân phối 100µl supernatant từ dịch chiết mơ khơng pha lỗng Mẫu kiểm tra lần hai lần Giếng phải phủ phim dính, cắt theo chiều dài phù hợp với số giếng sử dụng Trộn cách lắc nhẹ đĩa(plate) máy trộn c Ủ đĩa(plate) Ủ ± phút 37°C ± 3°C qua đêm (14-18 giờ) 20°C ± 5°C d.Rửa: dung dịch đệm rửa, pha loãng nồng độ dung dịch rửa 1:10 nước cất nước khử ion Cẩn thận loại bỏ phim dính rửa lần III.2.2.2.Thêm kháng huyết a Chuẩn bị kháng huyết thanh: pha loãng kháng huyết 1:10 với chất pha loãng b Phân phối kháng huyết thanh: cho 100µl kháng huyết pha lỗng vào tồn giếng phủ với phim dính c Ủ: kháng huyết h ± phút 37°C ± 3°C d Rửa: cần ý loại bỏ lớp phim dính rửa lần III.2.2.3 Thêm conjugate: a Chuẩn bị conjugate: chuẩn bị dung dịch conjugate pha loãng nồng độ 1:10 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com b Phân phối conjugate: thêm 100µl conjugate pha lỗng vào tất giếng phủ mẫu phim dính c Ủ: conjugate h ± phút 37°C ± 3°C d Rửa: loại bỏ phim dính, rửa lần III.2.2.4 Phát hiện: a Thêm chất: Thêm 100 µl chất peroxidase giếng (khơng phủ lớp phim dính bước này) Trộn cách lắc nhẹ sử dụng máy trộn b Ủ: chất 30 phút ± phút nhiệt độ phòng ( 20°C ± 5°C), tránh ánh sáng c Thêm dung dịch dừng phản ứng: thêm 50µl dung dịch dừng phản ứng giếng Trộn cách lắc nhẹ sử dụng máy trộn Đảm bảo khơng có bọt khí giếng d Đo OD: bước sóng hấp thu 450 630nm 1bước sóng hấp thu 450nm máy đọc Elisa Thu kết có giá trị :OD đạt đối chứng dương ≥ 0.300, OD đạt đối chứng âm < 70% ODP III.2.2.5 Xử lý số liệu: Hai phương pháp để tính tốn giải thích: a Dựa vào số OD mẫu: Cho mẫu: Trong đó: — ODMẫu= trung bình OD mẫu, kiểm tra thực với hai mẫu — ODP= trung bình OD đối chứng dương • Bất kỳ mẫu máu có số ≥0 xem dương tính, < -0.15x coi âm tính Bất kỳ mẫu dịch chiết mô, bạch cầu, huyết tương, huyết có số ≥0.1x xem dương tính, < -0.1 x coi âm tính — • Chỉ số OD Mẫu mẫu máu nằm khoảng [-0.15,0) kết nghi ngờ — • Chỉ số OD Mẫu mẫu dịch chiết mô, bạch cầu, huyết tương, huyết nằm khoảng — — 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com [ 0.1xODP , 0.1xODP) kết nghi ngờ b Phân tích OD: Trong đó: OD CO tính theo cơng thức: IV Tài liệu tham khảo: • Cơng nghệ sinh học thú y Nguyễn Ngọc Hải • Phylogenetic of hog cholera virus in Tien Giang province Trân Thị Dân, Lương Quý Phương, Nguyen Ngọc Tuân, Thái Quôc Hiêu, Hô Huỳnh Mai Đại học Nông Lâm TPHCM, CCTY Tiền Giang • Mignon B., Waxweiler S., Thiry E., Boulanger D., Dubuisson J and Pastoret P.P 1992 J Virol Methods, 40 ; 85-94 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... sinh miễn dịch Miễn dịch xuất heo khỏi bệnh dịch tả heo dài chắn Tuy nhiên, chủng virus dịch tả heo mãn tính hay cận lâm sàng có tính sinh miễn dịch yếu Tính sinh miễn dịch truyền cho heo (qua... phát virus dịch tả heo I.2 Mục tiêu: Sử dụng kit Elisa để phát bệnh dich tả heo sớm 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com II Tổng quan II.1Giới thiệu dịch tả heo II.1.1... virus dịch tả heo phát kỹ thuật huyết học khác phản ứng trung hòa, kết tủa khuếch tán thạch, kết hợp bổ thể, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu thụ động Chỉ có typ kháng nguyên dịch tả heo,