Đề tài đã tiến hành ứng dụng được kỹ thuật PCR để phát hiện người nhiễm não mô cầu (NMC) theo loài, nhóm và đánh giá kết quả chẩn đoán ở cấp độ sinh học phân tử ADN. Đã ứng dụng được kỹ thuật PCR trong chẩn đoán, phát hiện NMC được loài trong 7 mẫu bệnh phẩm với kết quả 100% dương tính (+) với loài NMC. Đồng thời đã ứng dụng kỹ thuật Multiplex-PCR để phát hiện nhóm với 15 mẫu bệnh phẩm đã phát hiện được kết quả 10/15 (67%) mẫu dương tính (+) với NMC nhóm B.
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐỐN NÃO MƠ CẦU NGUYỄN VĂN RƯ, NGUYỄN THỊ LOAN – Trường Đại học Dược Hà Nội LÊ THU HÀ – Viện Vệ sinh Phịng dịch Qn Đội TĨM TẮT Đề tài tiến hành ứng dụng kỹ thuật PCR để phát người nhiễm não mơ cầu (NMC) theo lồi, nhóm đánh giá kết chẩn đoán cấp độ sinh học phân tử ADN Đã ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đốn, phát NMC lồi mẫu bệnh phẩm với kết 100% dương tính (+) với loài NMC Đồng thời ứng dụng kỹ thuật Multiplex-PCR để phát nhóm với 15 mẫu bệnh phẩm phát kết 10/15 (67%) mẫu dương tính (+) với NMC nhóm B Kết PCR mẫu máu, dịch não tủy (+) với vi khuẩn NMC hỗ trợ để đánh giá, phân tích xác định đối tượng bị bệnh NMC Trong trường hợp khác, dịch nhày họng (+) với NMC xác định đối tượng bị nhiễm NMC chưa thể khẳng định NMC nguyên nhân gây bệnh trường hợp người lành mang trùng Từ khóa: kỹ thuật PCR, lồi nhóm não mơ cầu, chẩn đoán sinh học phân tử SUMMARY Has application PCR techniques in the diagnosis of meningitis, to detect species in seven samples with 100% positive results (+) with meningitis species At the same time has technical applications MultiplexPCR to detect groups with 15 specimens found results 10/15 (67%) samples positive (+) NMC Group B Results of PCR of blood, cerebro-spinal fluid (+) bacteria with the meningitis has supported to assess, analyze and identify the object it affects meningitis In other cases, the throat mucus (+) with the meningitis only identify infected objects meningitis and can not confirm that meningitis was the cause of disease and that is the case the carrier status of the medium Keywords: PCR techniques, Multiplex-PCR, meningitis, blood, cerebro-spinal fluid, throat mucus ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh nhiễm não mô cầu loại bệnh viêm vi khuẩn Neisseria meningitidis, bệnh có chứng viêm nặng chất dịch lớp màng bọc xung quanh não (viêm màng não), máu (nhiễm khuẩn huyết), phổi (viêm phổi), khớp xương (viêm khớp) Bệnh lây qua đường hô hấp, gây tổn thương riêng rẽ hay phối hợp quan đường hô hấp, máu, hệ thần kinh, khớp, màng ngồi tim, mắt… Có thể gây đại dịch, tác động lớn mặt y tế, xã hội [2] Kỹ thuật PCR ứng dụng Việt Nam để chẩn đoán bệnh ung thư, virus cúm A H5N1, H1N1, virus HIV, lỵ amip Mycobacterium tuberculosis,… thu kết nhanh xác [1, 2] Thời gian gần đây, tình hình bệnh não mơ cầu (NMC) có nguy bùng phát nhiều nơi đề tài tiến hành nhằm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát người nhiễm NMC theo loài, nhóm đánh giá kết chẩn đốn não mơ cầu cấp độ Y HỌC THỰC HÀNH (903) - SỐ 1/2014 sinh học phân tử ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân (BN) chẩn đoán lâm sàng viêm màng não nhiễm khuẩn huyết nghi não mô cầu bệnh viện quân đội từ tháng 3/2008 đến 04/2012 lấy mẫu bệnh phẩm Người tiếp xúc gần với BN từ 04/2011 đến 04/2012 lấy mẫu bệnh phẩm Nguyên vật liệu, thiết bị Mẫu bệnh phẩm Gồm có mẫu dịch nhày họng, mẫu dịch não tủy mẫu máu Các mẫu lấy theo kỹ thuật, hòa tan 2-4 ml dung dịch NaCl 0,85%, bảo quản 2-80C tiến hành phân tích 24-48h, cần để lâu phải bảo quản -180C Hóa chất, sinh phẩm Kit tách DNA hãng QIAamp DNA Mini Kit [9] Mồi cho phản ứng PCR: Trình tự mồi Tube 0,2 ml, 1,5 ml, ml khử trùng [5] Multiplex PCR kit [9] Taq PCR mastermix kit (Qiagen) [9] Agarose Ethidiumbromide Các loại pipetman 10, 100, 200, 1000 l Trình tự mồi để phản ứng Trình tự dùng PCR phát lồi NMC [5] gồm mồi sau: 5’- ccagcggtattgtttgggtgg-3’ 5’caggcggcctttaataatttc-3’, gen khuếch đại ctrA để phát NMC nhóm, kích thước 176 bp Trình tự mồi dùng Multiplex – PCR phát nhóm gồm: - Trình tự mồi: 5’cgcaataggtgtatatattcttcc-3’ 5’cgtaatagtttcgtatgccttctt-3’, gen khuyếch đại orf-2 (A), kích thước 400bp - Mồi: 5’-ggatcatttcagtgttttccacca-3’ 5’gcatgctggaggaataagcattaa-3’, gen khuyếch đại siaD (B) kích thước 450 - Mồi: 5’-tcaaatgagtttgcgaatagaaggt-3’ 5’tcaaatgagtttgcgaatagaaggt-3’, gen khuyếch đại siaD (C) kích thước 250 - Mồi: 5’-cagaaagtgagggatttccata-3’ 5’cagaaagtgagggatttccata-3’ gen khuyếch đại siaD (W135), kích thước 120bp -Trình tự mồi: 5’-ctcaaagcgaaggctttggtta-3’ 5’ctgaagcgttttcattataattgctaa-3’ gen khuyếch đại siaD (Y), kích thước 120bp Thiết bị máy móc Máy li tâm, Máy lắc, Bể ủ, Máy khuyếch đại gene Techne (Anh), Máy điện di, Máy Fisher multiplexPCR, Đèn UV, Tủ lạnh,Tủ âm sâu -25oC, -80oC - Đầu có màng lọc: 10, 100, 200µL Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR thường phát loài PCR đa 77 mồi (Multiplex – PCR) phát nhóm Trong quy trình này, ứng dụng kỹ thuật dựa nghiên cứu CDC số trình tự vùng gene tác giả Hàn Quốc để thiết kế primers-set lựa chọn primer phù hợp Bao gồm: - 01 cặp mồi để xác định loài N meningitidis nằm gene CtrA, gene mã hóa cho: capsule polysaccharide export outer membrane protein; GeneID: 4675121; Locus tag: NMC0055; Locus: NC_008767; chiều dài: 1176 bp - 01 cặp mồi xác định seogroups A, gen pJS-B_02 (được biết với tên khác orf-2): mã hóa cho Hypothetical protein; Locus: AJ277475; chiều dài 7245 bp - 04 cặp mồi xác định serogroup B, C, Y W135 nằm siaD mã hóa cho alpha-2,8 polysialyltransferase; Locus tag: MCC_0075; GeneID:5796762; LOCUS: NC_010120; chiều dài 1320 bp [5,7] Quy trình thực nghiệm Ngun lý: Bộ kít sử dụng màng lọc có gắn silica Mẫu lý giải điều kiện biến tính để bất hoạt DNAase đồng thời DNA bảo toàn Sau sử dụng dung dịch đệm nhằm cung cấp điều kiện tối ưu cho khả gắn vào lớp màng DNA Mẫu sau chuyển sang cột tách có chứa lớp màng silica DNA gắn lớp màng, chất có khả ức chế phản ứng loại bỏ thông qua hai lần ly tâm dung dịch rửa Cuối DNA tách khỏi lớp màng silica sẵn sàng cho mục đích lưu giữ [4, 7, 8] Sử dụng kít nhằm tách chiết tinh DNA từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng khác DNA sau tách chiết sử dụng làm template cho phản ứng RT-PCR, Realtime PCR, sequencing Quy trình minikit tách chiết DNA [9,10] DNA polymerase q trình tổng hợp DNA từ mạch khn Tất DNA polymerase cần mồi, đoạn DNA ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn Ðây phương pháp in vitro sử dụng cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn từ trình tự DNA đặc biệt dựa hoạt động enzyme polymerase Ứng dụng Multiplex-PCR phát vi khuẩn màng não cầu loại mẫu bệnh phẩm lâm sàng (dịch nhày họng, dịch não tủy, máu) Quy trình tách DNA [7] Hình 2: Sơ đồ quy trình PCR phát lồi nhóm Bước 2: Chuẩn bị Mix thành phần phản ứng phát loài Bảng Thành phần mix cho PCR phát loài Thành phần phản ứng Nước Primer CtrAr (10 μM) Primer CtrAf (10 μM) Taq PCR Master Mix DNA template Tổng Thể tích (μl) 0,75 0,75 12,5 25 Nồng độ cuối 0,3 μM 0,3 μM 1× - Bước 5: Thành phần phản ứng phát nhóm N.mengitidis Bảng Thành phần phản ứng PCR phát nhóm Hình Quy trình minikit tách chiết DNA từ bệnh phẩm Quy trình Multiplex-PCR phát não mô cầu Nguyên lý: Phương pháp PCR dựa hoạt động 78 Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nước 5x Q-solution Primer orf-2 (Ar) (20 μM) Primer orf-2 (Af) (20 μM) Primer siaD (Br) (20 μM) Primer siaD (Bf) (20 μM) Primer siaD (Cr) (20 μM) Primer siaD (Cf) (20 μM) Primer siaD (W135r)(20μM) Primer siaD (W135f)(20μM) Primer siaD (Yr) (20 μM) Primer siaD (Yf) (20 μM) Multiplex Master mix,2x DNA template Tổng 2,5 2,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 12,5 25 Nồng độ cuối 0,5× 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 0,2 μM 1x - Bước 7: Điện di Sản phẩm khuyếch đại điện di thạch Y HỌC THỰC HÀNH (903) - SỐ 1/2014 2% nhuộm ethidium bromide Đọc kết máy Fisher [4, 6, 8] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết PCR phát loài Kết điện di DNA mẫu PCR phát loài N.meningitidis 900 800 700 600 500 400 300 200 150 100 10 176bp Hình Kết điện di DNA mẫu PCR phát loài N.meningitidis Ladder; chứng dương; 3, 4, dịch não tủy bệnh nhân; 6, 7, mẫu máu bệnh nhân, dịch nhày họng bệnh nhân có triệu chứng điển hình nghi ngờ nhiễm NMC; 10 chứng âm Từ hình kết điện di cho thấy mẫu bệnh phẩm cho kết (+) chứng tỏ mẫu bệnh phẩm xét nghiệm bị nhiễm não mô cầu Ở bệnh nhân có triệu chứng điển hình nhiễm màng não cầu mà kết hợp với xét nghiệm PCR dịch não tuỷ bệnh phẩm máu dương tính kết luận bệnh nhân viêm màng não (nhiễm khuẩn huyết) não mô cầu Tuy nhiên với trường hợp có kết PCR mẫu bệnh phẩm dịch nhày họng dương tính chưa xác định bệnh nhân bị bệnh nguyên nhân não mơ cầu có khả người lành mang trùng Mẫu chứng âm cho kết (-) chứng tỏ q trình làm khơng bị nhiễm chéo Kết PCR phát nhóm Tiến hành 15 mẫu bệnh phẩm gồm dịch não tủy, máu, dịch nhày họng BN có triệu chứng điển hình bị nghi ngờ nhiễm NMC Kết điện di hình tổng hợp bảng 3: 15 16 17 18 19 20 21 22 23 900 800 700 600 500 400 300 200 450 bp 250 bp 10 11 12 13 14 900 800 700 600 500 400 300 200 450 bp 250 bp Hình Kết điện di DNA mẫu PCR phát nhóm Y HỌC THỰC HÀNH (903) - SỐ 1/2014 Ghi chú: 1, 15 Ladder 2, 16 chứng dương nhóm B; 3, 17 chứng dương nhóm C; 13 chứng âm tách chiết; 14 chứng âm PCR; 4, dịch nhày họng (+), máu (-) BN 1; 6, 7, dịch nhày họng (+), máu (+), dịch não tủy(+) BN 2; 9,10 dịch não tủy (-), máu (+) BN 3; 11,12 máu (+), dịch não tủy (+) BN 4; 18, 19, 20, 21 dịch nhày họng người tiếp xúc gần số (+), số (+), số (-), số (+); 22,23 dịch não tủy (+), máu (-) BN Bảng Kết phát nhóm Số TT Máu (-) âm tính (+) (+) (+) X X X (+) Dịch não tủy X, không xác định (+) (-) (+) X X X (-) Dịch nhày họng (+) dương tính (+) X X (+) (+) (-) X BÀN LUẬN Về lựa chọn phương pháp mồi PCR: Có nhiều phương pháp xác định có mặt NMC nhuộm Gram, nuôi cấy, PCR, ngưng kết hạt latex, định danh phương pháp có ưu, nhược điểm riêng Nuôi cấy phương pháp cổ điển, cho kết xác lại yêu cầu điều kiện thu thập, bảo quản, vận chuyển mẫu nghiêm ngặt Kỹ thuật Pastorex ngưng kết hạt latex có độ đặc hiệu đáng tin cậy nồng độ vi khuẩn thấp xuất kết âm tính giả Phương pháp ni cấy cho kết muộn (đến ngày) phương pháp PCR cho kết sau Có nhiều gen thiết kế mồi gen ctrA, orf-2 siaD lựa chọn gen có độ ổn định cao [5, 7], đặc biệt ổn định N.meningitidis nhóm B Độ nhậy đặc hiệu cặp mồi 93% 96% [8,11] khơng có phản ứng chéo types não mô cầu với loại vi khuẩn khác Tuy thay hồn tồn phương pháp ni cấy phân lập cổ điển song phịng xét nghiệm khơng thể ni cấy ni cấy thất bại gửi mẫu đến phòng xét nghiệm đại để thực phản ứng PCR loại mẫu dùng cho phương pháp PCR cần bảo quản lạnh, không yêu cầu nghiêm ngặt gửi mẫu để nuôi cấy Ngồi ứng dụng chẩn đốn, PCR ứng dụng giám sát dịch chủ động, để giám sát người lành mang trùng, người bình thường, khơng có triệu chứng bệnh lại mang vi khuẩn, điều kiện thích hợp phát bệnh [2, 3] Đối với trường hợp nhiễm NMC, để kiểm soát, cần lấy mẫu dịch hầu họng tiến hành làm PCR Xét nghiệm sinh học phân tử PCR giúp phát tỷ lệ người mang vi khuẩn, từ có kế hoạch phù hợp để kiểm sốt dịch, tránh lây lan sang người khác, vùng khác [2, 6] Về PCR phát nhóm đánh giá kết chẩn đốn NMC Nhờ kết PCR phát nhóm 79 phân tích đánh giá tình hình nhiễm bệnh có cách xử lý trường hợp BN số sống vùng có ổ dịch NMC cũ, biểu lâm sàng có hội chứng nhiễm trùng, nhiễm độc, nhiên khơng có hội chứng màng não Kết dịch nhày họng (+) với não mô cầu nhóm B, chứng tỏ bệnh nhân có mang NMC nhóm B vùng hầu họng, xét nghiệm máu bệnh nhân cho kết âm tính (-), BN mắc thể viêm hầu họng NMC, bệnh nhân bị viêm hầu họng vi khuẩn khác địa có mang sẵn NMC Cần theo dõi điều trị triệt để để phòng lây lan sang người khỏe khác Đối với BN số có kết máu, dịch não tủy dịch nhày họng (+) với NMC nhóm B, chứng tỏ BN bị bệnh não mô cầu, mức độ nặng, nhiễm khuẩn huyết viêm màng não BN số có kết máu (+) với não mơ cầu nhóm B, dịch não tủy (-) chứng tỏ BN bị nhiễm khuẩn huyết NMC nhóm B BN số có kết máu, dịch não tủy (+) với NMC nhóm B, chứng tỏ NMC nhóm B nguyên nhân gây bệnh (nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não) Người số 5, 6, có kết dịch nhày họng (+) với NMC nhóm B, chứng tỏ người tiếp xúc vùng có dịch trở thành người lành mang trùng Những đối tượng cần theo dõi cách ly Người số người tiếp xúc gần, có kết dịch nhày họng (-), chứng tỏ chưa bị nhiễm NMC KẾT LUẬN Đã ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đốn não mơ cầu (NMC), phát lồi mẫu bệnh phẩm với kết 100% dương tính với NMC Đồng thời ứng dụng kỹ thuật Multiplex-PCR để phát nhóm với 15 mẫu bệnh phẩm phát kết 10/15 (67%) mẫu dương tính với NMC nhóm B 80 Kết PCR mẫu máu, dịch não tủy (+) với vi khuẩn NMC hỗ trợ để đánh giá, phân tích xác định đối tượng bị bệnh NMC Trong trường hợp khác, dịch nhày họng (+) với NMC xác định đối tượng bị nhiễm NMC chưa thể khẳng định NMC nguyên nhân gây bệnh người lành mang trùng TÀI LIỆU THAM KHẢO Chu Hoàng Mậu, (2009), “Cơ sở phương pháp sinh học phân tử”, Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Đinh Nguyễn Huy Mẫn, (2012), “Phòng ngừa bệnh nhiễm não mô cầu”, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Andrew J Pollard and Martin C.J Maiden, (2001), “Meningococcal Disease”, Humana Press Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K, (2002), “Short Protocol in Molecular Biology” Vol and 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA Dieffenbach CW and Dveksler GS, (2003), “PCR Primer: A Laboratory Manual”, 2nd Edition Cold Spring Habor Laboratory Press, NewYork, USA Genco, C; Wetzler, L (editors), (2010), “Neisseria: Molecular Mechanisms of Pathogenesis”, Caister Academic Press Clin J., (2000), Simultaneous approach for nonculture PCR-based identification and serogroup prediction of Neisseria meningitides, Microbiol, 855-857 Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J, (1989), “Molecular Cloning-A Laboratory Manual”, Cold Spring Habor Laboratory Press, USA QIAamp, (2010), viral DNA Mini and Blood Mini Kit handbook, version April 10 Rapley R and Walker JM, (1998), “Molecular Biomethods Handbook”, Humana Press Inc New Jersey, USA 11 Ryan KJ, Ray CG, (2004) “Sherris Medical Microbiology”, McGraw Hill 329–333 Y HỌC THỰC HÀNH (903) - SỐ 1/2014 ... (-), chứng tỏ chưa bị nhiễm NMC KẾT LUẬN Đã ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đốn não mơ cầu (NMC), phát loài mẫu bệnh phẩm với kết 100% dương tính với NMC Đồng thời ứng dụng kỹ thuật Multiplex -PCR để... dịch não tủy dịch nhày họng (+) với NMC nhóm B, chứng tỏ BN bị bệnh não mô cầu, mức độ nặng, nhiễm khuẩn huyết viêm màng não BN số có kết máu (+) với não mơ cầu nhóm B, dịch não tủy (-) chứng... xét nghiệm đại để thực phản ứng PCR loại mẫu dùng cho phương pháp PCR cần bảo quản lạnh, không yêu cầu nghiêm ngặt gửi mẫu để ni cấy Ngồi ứng dụng chẩn đốn, PCR ứng dụng giám sát dịch chủ động,