Bài viết sử dụng cùng lúc 4 cặp mồi, trong 4 tube PCR riêng biệt, được thiết kế tại các vùng gene bảo thủ tương ứng trên 4 ORFs (OFR1 - OFR4) của bộ gene PYMoV trong cùng 1 phản ứng PCR với yêu cầu cả 4 cặp mồi đều cho kết quả dương tính rõ trên DNA của mỗi mẫu nhi m bệnh và đều âm tính trên mẫu đối chứng khỏe. Các cặp mồi này chỉ được đề xuất sử dụng khi chúng đều cho kết quả tương tự trong phản ứng RT-PCR, ở bước tiếp theo, sử dụng RNA tổng số tách chiết từ cùng 1 mẫu giám định.
BVTV - Sè 5/2018 Kết nghiên cứu khoa học NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN NHANH VI-RÖT GÂY BỆNH KHẢM VÀNG (PYMoV) TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM Study on PCR Techniques for Detection of Piper Yellow Mottle Virus (PYMoV) on Black Pepper in Viet Nam 1 Tạ Hoàng Anh , Nguyễn Hồng Tuyên , Nguyễn Thúy Hạnh , Nguyễn Thị Thúy A Ishwara Bhat Ngày nhận bài: 25.09.2018 Ngày chấp nhận: 28.09.2018 Abstract Four pairs of primers designed at conserved regions corresponding to four Open Reading Frames - OFR1, OFR2, OFR3 and OFR4, of the Piper yellow mottle virus (PYMoV) genome were used in four separated tubes in the same polymerase chain reaction (PCR) for each sample after extraction of total DNA using CTAB method All four primer pairs gave bright and a single band of expected size including 379bp, 352bp, 539bp and 420bp, respectively, only on the lanes of infected sample but not any in the lane of healthy plant sample (as negative control) on a 0.8% agarose gel after electrophoresis Like many other Budnavirus, PYMoV was found to occur endogenous virus intergrated most of their genomic sequence in the sequence of the host plant Hence, in this study for the confirmation of any unspecific amplification in PCR (though no band was found on the healthy control DNA after PCR), the One-Step RT-PCR was done using the same pairs of primers after total RNA extraction using Tri-Reagent The same result was obtained after electrophoresis as done previously by PCR Afterwards, the serial dilution of DNA extract was done and gave the sensitivity of PCR protocol was -3 of 10 These results of PCR and RT-PCR helped to recommend a good protocol using either one of or all those four pairs of primers for a specific and sensitive detection of PYMoV from infected black pepper plants in Vietnam by PCR Keywords: Piper yellow mottle virus, detection, PCR, RT-PCR ĐẶT VẤN ĐỀ * Cây hồ tiêu (Piper nigrum L., Piperaceae) gia vị quan trọng, đem lại giá trị kinh tế cao trồng phổ biến nhiều nước Đơng Nam Á, có Việt Nam Theo thống kê Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, tính đến năm 2015, tổng diện tích trồng hồ tiêu nước lên đến 101.623 ha, tập trung chủ yếu miền Đông Nam Bộ Tây Nguyên, chiếm 93,50% diện tích trồng hồ tiêu nước Có giống hồ tiêu ưa chuộng trồng phổ biến gồm Tiêu Vĩnh Linh (Tiêu Sẻ), Tiêu Trâu Tiêu Ấn Độ Diện tích hồ tiêu Việt Nam năm 2015 đạt 176.789 tấn, chiếm 32% sản lượng giới Năng suất hồ tiêu bình quân nước ta đạt 2,6 tấn/ha, vùng Tây Nguyên cao đạt 3,1 tấn/ha Hiện tượng hồ tiêu sinh trưởng kém, độ dài đốt ngắn lại, phần mô gân bị khảm vàng, biến dạng… xuất phổ Viện Bảo vệ thực vật (PPRI) - P Đức Thắng, Q Bắc Từ Liêm, Hà Nội, Việt Nam Viện Nghiên cứu gia vị Ấn Độ (IISR) Kozhikode 673012, Kerala, Ấn Độ 58 biến hầu khắp vườn trồng tiêu giới, khu vực có vĩ độ cao, suất chất lượng hạt tiêu giảm đáng kể, lụi dần chết (Bhat et al., 2003, 2005) Những triệu chứng xác định vi-rút khảm vàng hồ tiêu, tên tiếng Anh Piper yellow mottle virus (PYMoV), thuộc nhóm Badnavirus, họ Caulimoviridae, ghi nhận nước Braxin, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thái Lan (Lockhart et al., 1997; Duarte et al., 2001; de Silva et al., 2002; Bhat et al., 2003) Bên cạnh PYMoV, nhóm tác giả ghi nhận Cucumber mosaic virus (CMV) gây nhi m hồ tiêu chủ yếu nhi m kép với PYMoV với tần suất xuất thấp đến thấp (Deeshma and Bhat, 2017) Các triệu chứng tương tự ghi nhận nước trồng hồ tiêu giới ghi nhận Việt Nam từ nhiều năm Bên cạnh đó, dạng triệu chứng vàng sinh lý; vàng còi cọc thiếu dinh dưỡng, chăm sóc cắt tỉa khơng hợp lý hay thâm canh mức khiến hồ tiêu kiệt quệ… dẫn đến biểu bất thường hay phức Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 hợp nhiều yếu tố…được người nông dân cán địa phương gọi chung tượng “tiêu điên” với mô tả không thống gữa khu vực trồng tiêu khác Piper yellow mottle virus có cấu trúc phân tử sợi kép DNA mạch vòng Bộ gene gồm khung đọc mở (ORF) mã hóa protein PYMoV nhiều Budnavirus khác có đặc tính “enogenous” (Deeshma et al., 2017), có nghĩa q trình tái sinh PYMoV “copy” phần lớn gene nhiều vị trí khác từ trình tự gene ký chủ Điều gây khó khăn việc xác định cơng cụ chẩn đốn có tính đặc hiệu thực theo phương pháp thơng thường tượng “dương tính giả” Khi đó, sản phẩm PCR khơng thu mẫu nhi m mà khuyếch đại mẫu đối chứng khỏe Hiện tượng xảy đoạn gene khuyếch đại phản ứng PCR nằm vùng gene mà PYMoV copy từ trình tự gene chủ Để có cặp mồi có tính đặc hiệu với PYMoV cần phải thiết kế vùng gene riêng vi-rút Các cặp mồi thiết kế vùng gene có tính bảo thủ cao Budnavirus (trong tự nhiên, Budnavirus có tính đa dạng cao) cặp mồi cho sản phẩm PCR với kích thước mong đợi mẫu giám định âm tính mẫu đối chứng khỏe lựa chọn cho bước Trong nghiên cứu này, sử dụng lúc cặp mồi, tube PCR riêng biệt, thiết kế vùng gene bảo thủ tương ứng ORFs (OFR1 - OFR4) gene PYMoV phản ứng PCR với yêu cầu cặp mồi cho kết dương tính rõ DNA mẫu nhi m bệnh âm tính mẫu đối chứng khỏe Các cặp mồi đề xuất sử dụng chúng cho kết tương tự phản ứng RT-PCR, bước tiếp theo, sử dụng RNA tổng số tách chiết từ mẫu giám định VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - Mẫu hồ tiêu nhi m bệnh: Mẫu giám định: mẫu thu thập ấp 1, xã Minh Lập, huyện Chơn Thành, tỉnh Bình Phước, giống tiêu Vĩnh Linh, vườn năm tuổi Mẫu đối chứng dương âm: DNA tách chiết từ mẫu bệnh mẫu khỏe thu nhà lưới Viện Nghiên cứu gia vị (IISR) – Calicut, Kerala, Ấn Độ - Các cặp mồi thiết kế vùng gene bảo thủ Budnavirus tương ứng khung đọc mở ORF1, ORF2, ORF3 ORF4 gene PYMoV, sử dụng trình tự gene GenBank với mã truy cập NC_022365 (Hany et al., 2014) - Phần mềm sử dụng để phân tích lựa chọn cặp mồi VectorNTI 11 MEGA6 - Các thí nghiệm thực phòng thí nghiệm Viện BVTV IISR (Ấn Độ) Bảng Danh sách cặp mồi đƣợc sử dụng ORFs Tên mồi Trình tự mồi (5' 3') PYMoV-1F PYMoV-1R PYMoV-2F PYMoV-2R PYMoV-3F PYMoV-3R PYMoV-4F PYMoV-4R GAGAGATCAATCGAGGATTG CAACCTTGGCTATCATCAAC TTTGTCAAGCCAAGAGACCAC TTGAGTGATTTGGTCCTCCAC GAGTACCAACAGGTGATGA GTGCTTCCTCTTCTCAATC TATGGAAGCAGCTCTCGTTCA CTTTGCCCGCACAGATTTGAT 2.2 Phƣơng pháp - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá: 100 mg tươi nghiền chày cối sứ với 500 µl Sản phẩm PCR (bp) 379 352 539 420 Ext-Bf (DNA Extraction Buffer) 1% (V/v) ME (β-mercaptoethanol) chuyển toàn sang tuýp 2-ml Tuýp ủ waterbath nhiệt o độ 65 C 30 phút Lắc nhẹ tube trước 59 BVTV - Sè 5/2018 Kết nghiên cứu khoa học thêm 500 µl PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol - 25:24:1) lắc thật mạnh vortex g Ly tâm 2.500 10 phút nhiệt độ phòng Phần dịch phía chuyển sang tuýp 1,5-ml khác, cho thêm vào tuýp l o RNase, lắc nhẹ để nhiệt độ C 30 phút Thêm 500 µl CI (Chloroform : Isoamyl alcohol – 24:1) lắc thật mạnh vortex g trước ly tâm 2.500 10 phút nhiệt độ phòng Phần dịch phía chuyển sang tuýp 1,5-ml Thêm 50 l Sodium acetate 3M (pH 4,0), lắc nhẹ, thêm lượng tương đương Isopropanol, lắc nhẹ để lạnh nước đá 30 phút Ly tâm 10.000 o vòng/phút 15 phút C Đổ bỏ phần dung o dịch rửa phần kết tủa 150 l cồn 70 Để khô nhiệt độ phòng trước hòa tan kết tủa với 100 l DEPC-H2O - Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá: 50 mg tươi nghiền chày cối sứ với 495 µl - DNA Extraction Buffer: Dung dịch mẹ 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,5 M EDTA (pH 8,0) 1,4 M NaCl Nước Deionized – thêm cho đủ 50 ml - Thành phần chu trình nhiệt PCR: Thành phần PCR Master Mix Primer forwards Primer reverse Deionized H2O DNA Tổng dung tích Dung tích (l) 12,50 0,25 0,25 11,00 1,00 25,00 Tri-Reagent 1% (V/v) ME (βmercaptoethanol) chuyển toàn sang tuýp 1,5-ml Thêm 50 µl Sodium sulphite 3M 50 µl Sodium acetate 2M (pH 4,0), lắc thật mạnh vortex Thêm 500 l Phenol (water saturated) lắc thật mạnh vortex Ly tâm o 12.000 vòng/phút 15 phút C Chuyển phần dịch phía sang tuýp Thêm 100 µl CI (24:1) lắc thật mạnh vortex trước ủ nước đá 15 phút Thêm vào o tuýp l DNase, lắc nhẹ để nhiệt độ 37 C 30 phút Thêm 100 µl CI (24:1) lắc thật mạnh vortex trước ly tâm 12.000 o vòng/phút 15 phút C Thêm lượng tương đương Isopropanol, lắc nhẹ để lạnh nước đá 45 phút Ly tâm 12.000 o vòng/phút 15 phút C Đổ bỏ phần dung o dịch rửa phần kết tủa 150 l cồn 70 Để khơ nhiệt độ phòng trước hòa tan kết tủa với 100 l DEPC-H2O Dung lượng (ml) 5,0 0,4 14,0 30,6 Nhiệt độ o 94 C o 94 C o 52 C o 72 C o 72 C o C Thời gian 3:00 0:30 0:30 0:30 quay lại (35X) 10:00 Hold Nhiệt độ o 42 C o 94 C o 52 C o 72 C o 72 C o C Thời gian 45:00 0:30 0:30 0:30 quay lại (35X) 10:00 Hold - Thành phần chu trình nhiệt RT-PCR: Thành phần PCR 10X PCR-buffer 0.1M DTT 25 Mm dTNPs 1U Taq 100U RT 10U RI Primer forwards Primer reverse Deionized H2O RNA Tổng dung tích 60 Dung tích (l) 5,00 5,00 2,00 3,00 0,50 0,25 0,50 0,50 10,25 50,00 Kết nghiên cứu khoa học KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định nồng độ DNA RNA tổng số Hàm lượng chất lượng DNA hay RNA yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR hay RT-PCR Hàm lượng DNA hay RNA BVTV - Sè 5/2018 thấp độ tinh không đảm bảo dẫn đến phản ứng PCR RT-PCR thất bại Hàm lượng DNA RNA tách chiết tinh theo qui trình nêu xác định máy đo NANO-DROP ND-100 (bảng 2) Bảng Nồng độ DNA RNA tổng số xác định máy NANO-DROP ND-100 Nồng độ DNA tổng số 43 ng/l 54 ng/l (Mẫu Ấn Độ) (Mẫu Việt Nam) Kết đo nồng độ DNA RNA tổng số tách chiết từ mẫu hồ tiêu bảng cho thấy lượng nucleic-axits tổng số thu mức thấp thấp Với qui trình tách chiết RNA tổng số sử dụng Trizol Viện BVTV (Tạ Hồng Anh cs, 2009) ln cho hàm lượng cao, 500 ng/l với mẫu lúa 200 ng/l với cá thể rầy Tuy nhiên, hàm lượng DNA/RNA tổng số bảng lượng thông thường thực mẫu hồ tiêu Mặt khác, hàm lượng vi-rút hồ tiêu thấp đến thấp (Bhat et al., 2018) kỹ thuật ELISA thử nghiệm chẩn đốn vi-rút PYMoV khơng hiệu quả, tỷ lệ phát thấp, nói cách khác độ nhạy thấp (Bhadramuphy et al., 2005) Đây lý mà dung lượng RNA sử dụng phản ứng RT-PCR nêu mục 2.2 23 l, so với lượng thông thường áp dụng với vi-rút lúa - l (Tạ Hoàng Anh cs, 2009) Tuy nhiên, phản ứng PCR có độ nhạy cao nên với hàm lượng DNA tổng số bảng 2, phản ứng PCR cần l (Xem mục 2.2) 3.2 Kết PCR giám định PYMoV Kết chạy điện di gel-agarose 0,8% dung dịch TBE ghi nhận cặp mồi PYMoV-1F/R, PYMoV-2F/R, PYMoV-3F/R PYMoV-4F/R cho kết dương tính với mẫu hồ tiêu thu nhà lưới Viện Nghiên cứu Cây gia vị (IISR), Ấn Độ đối chứng dương mẫu thu Bình Phước (Việt Nam) với kích thước sản phẩm PCR thiết kế (bảng 1), tương ứng 379bp, 352bp, 539bp 420bp (hình 1) Nồng độ RNA tổng số 28 ng/l 32 ng/l (Mẫu Ấn Độ) (Mẫu Việt Nam) M A B H A B H - Primer - Primer (380 bp) (352 bp) A B H A B H - Primer - Primer (540 bp) (420 bp) 500 bp Hình Kết giám định PYMoV PCR mẫu hồ tiêu thu nhà lƣới IISR Ấn Độ (A: đối chứng bệnh; H: đối chứng khỏe) Việt Nam (mẫu B) M: 100bp marker (Thermo Scientific); 380, 352, 540 420 kích thƣớc mong đợi sản phẩm PCR tƣơng ứng với cặp mồi (Primer-1 ~ 4) bảng Kết PCR thu hình với độ đậm vạch DNA gel cho thấy độ nhạy cao kỹ thuật PCR Mặt khác, việc sử dụng lúc cặp mồi đặc hiệu gene nâng cao tính đặc hiệu phản ứng PCR Cả cặp mồi không cho phản ứng dương tính giả mẫu đối chứng khỏe 3.3 Kết one-tube RT-PCR giám định PYMoV Một đặc điểm chung nhiều vi-rút thuộc nhóm Budnavirus tượng “endogenous“ hiểu trình tái sinh chủ, vi-rút “copy“ nhiều đoạn trình tự chủ để tái thiết gene Các đoạn trình tự nằm rải rác gene chủ Nói cách khác, phần gene vi-rút nằm trình tự gene chủ Điều gây khó khăn cho việc xác định cặp mồi đặc hiệu cho vi-rút q trình chẩn đốn bệnh Thực tế tạo tượng “dương tính giả“ mẫu khỏe 61 BVTV - Sè 5/2018 Kết nghiên cứu khoa học Để khắc phục tượng này, nhằm lựa chọn cặp mồi có tính đặc hiệu cho vi-rút PYMoV Cả cặp mồi sử dụng phản ứng One-Step RT-PCR Việc dựa nguyên lý gene vi-rút hình thành từ trình phiên mã ngược từ RNA sang cDNA có mẫu nhi m vi-rút tạo sản phẩm PCR mong đợi M A H A H -Primer-1 - -Primer-4 (340 bp) (420 bp) A H A H -Primer-3 - -Primer-2 (540 bp) (352 bp) 500 bp Hình Kết giám định PYMoV OneStep RT-PCR mẫu hồ tiêu thu Việt Nam (B); H: đối chứng khỏe M: 100bp marker (Thermo Scientific); 380, 352, 540 420 kích thƣớc mong đợi sản phẩm PCR tƣơng ứng với cặp mồi sử dụng bảng Từ kết thu sau sử dụng cặp mồi để chẩn đoán PYMoV kỹ thuật PCR (hình 1) One-Step RT-PCR (hình 2) cho thấy cặp mồi cho sản phẩm sắc nét với kích thước tương ứng với kích thước thiết kế Cả cặp mồi không cho phản ứng “dương tính giả“ mẫu đối chứng khỏe, phản ứng PCR RT-PCR Từ kết này, đề xuất sử dụng cặp mồi (bảng 1) việc giám định PYMoV mẫu hồ tiêu nhi m bệnh kỹ thuật PCR RT-PCR Tuy nhiên, chi phí cho kỹ thuật PCR rẻ tiền hơn, độ nhạy cao lựa chọn hợp lý Trong nghiên cứu Nguy n Xuân Dũng Dương Hoa Xô (2017), phản ứng PCR sử dụng đối chứng âm “nước cất” khơng xác, khơng kiểm chứng khả dương tính giả cặp mồi sử dụng đặc tính “endogenous” PYMoV (Deeshma et al 2017) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Các qui trình tách chiết DNA tổng số RNA tổng số mẫu hồ tiêu đem lại chất 62 lượng DNA RNA tốt, cho kết rõ nét phản ứng PCR RT-PCR - Việc sử dụng đồng thời cặp mồi PYMoV-1F/R, PYMoV-2F/R, PYMoV-3F/R PYMoV-4F/R cho kết dương tính rõ nét mẫu đối chứng dương thu Ấn Độ mẫu nhi m bệnh thu Bình Phước (Việt Nam) âm tính mẫu đối chứng âm sử dụng kỹ thuật PCR One-Step RT-PCR 4.2 Đề nghị - Có thể sử dụng cặp mồi nêu bảng để giám định vi-rút gây bệnh khảm vàng hồ tiêu (PYMoV) - Cần giải trình tự hồn chỉnh gene PYMoV Việt Nam phân tích đặc điểm phân tử so sánh mức độ đa dạng với isolate Ấn Độ nước khác có GenBank Từ đó, xác định cặp mồi đặc hiệu cho isolate Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tạ Hồng Anh, Ngơ Vĩnh Vi n, Nguy n Tuấn Anh, Nguy n Thu Huyền, Nguy n Văn Chung Nguy n Doãn Phương, 2009 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật one-step RT-PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh vàng lùn lùn xoắn hại lúa Tạp chí Bảo vệ thực vật, 5: 21-26 Nguy n Xuân Dũng Dương Hoa Xô, 2017 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán Piper yellow mottle virus gây hại hồ tiêu (Piper nigrum L.) Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 6: 59-63 Bhat, A I., Devasahayam, S., Venugopal, M N and Suseela Bhai, R., 2005 Distribution and incidence of viral diseases of black pepper in Karnataka and Kerala, India J Plantation Crops, 33: 59-64 Bhat A I., Devasahayam S., Sarma Y R and Pant R P 2003 Association of a badnavirus in black pepper (Piper nigrum L.) transmitted by mealybug (Ferrisia virgata) in India Current Science, 84(12): 1547-1550 Bhat A.I and Siju S 2007 Development of a single tube multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of Cucumber mosaic virus and Piper yellow mottle virus associated with stunt disease of black pepper Current Science 93: 973-976 Duarte M L R., Albuquerque F C and Chu E Y., 2001 New diseases affecting black pepper crop in Brazil Int Pepper Bull., pp 51–57 ... 2009 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật one-step RT -PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh vàng lùn lùn xoắn hại lúa Tạp chí Bảo vệ thực vật, 5: 21-26 Nguy n Xuân Dũng Dương Hoa Xô, 2017 Ứng dụng kỹ thuật. .. chứng âm sử dụng kỹ thuật PCR One-Step RT -PCR 4.2 Đề nghị - Có thể sử dụng cặp mồi nêu bảng để giám định vi-rút gây bệnh khảm vàng hồ tiêu (PYMoV) - Cần giải trình tự hồn chỉnh gene PYMoV Việt. .. không cho phản ứng “dương tính giả“ mẫu đối chứng khỏe, phản ứng PCR RT -PCR Từ kết này, đề xuất sử dụng cặp mồi (bảng 1) việc giám định PYMoV mẫu hồ tiêu nhi m bệnh kỹ thuật PCR RT -PCR Tuy nhiên,