Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phát hiện đồng thời nhiều cytokine và đánh giá độ xác thực của phương pháp xét nghiệm hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (fluorescence covalent microbead immunosorbent assay - FCMIA).
Tạp chí y - dợc học quân số 3-2017 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG TRONG PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI NHIỀU CYTOKINE Đỗ Khắc Đại*; Nguyễn Đặng Dũng* Nguyễn Ngọc Tuấn*; Hồng Trung Kiên* TĨM TẮT Mục tiêu: phát đồng thời nhiều cytokine đánh giá độ xác thực phương pháp xét nghiệm hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (fluorescence covalent microbead immunosorbent assay - FCMIA) Đối tượng phương pháp: lọ cytokine chuẩn dạng đông khô với nồng độ biết phân tích FCMIA hệ thống Luminex 200 Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y Kết quả: xây dựng đường chuẩn phát đồng thời cytokine cytokine mẫu xét nghiệm, tỷ lệ % khơi phục dao động từ 95,68 - 107,26% với tổ hợp cytokine từ 92,86 - 109,61% với tổ hợp cytokine Kết luận: nghiên cứu thành công ứng dụng kỹ thuật FCMIA xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine, cytokine: IL-6, IL-17, TNF-α cytokine: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α với kết định lượng có độ xác thực cao * Từ khố: Xét nghiệm cytokine; Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent Assay in Simultaneous Detection of Cytokines Summary Objectives: To detect simultanly cytokines and evaluate the accuracy of fluorescence covalent microbead immunosorbent assay (FCMIA) method Subjects and methods: Lyophilization of cytokine standards with known concentration was analysed by FCMIA with Luminex-200 system at Department of Immunology, Vietnam Military Medical University Results: Created the standard curve for simultaneous detection of three cytokines and nine cytokines in one assay sample and the percentage of recovery in cytokines ranged from 95.68% to 107.26% and 92.86% to 109.61% in cytokines Conclusion: We have succeeded in application of FCMIA in simultaneous detection of cytokines as 3-plex (IL-6, IL-17, TNF-α) and 9-plex (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α) with high accuracy of quantitative result * Key words: Cytokine detection; Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay ĐẶT VẤN ĐỀ Cytokine protein có trọng lượng phân tử thấp, đóng vai trò trung gian trao đổi tín hiệu tế bào hệ thống miễn dịch Các cytokine phát huy tác dụng cách gắn vào thụ thể đặc hiệu tế bào đích, qua kích hoạt đường dẫn truyền tín hiệu bên tế bào, làm thay đổi hình thức biểu gen, dẫn đến việc tổng hợp protein định tác dụng sinh học [3] * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Khắc Đại (dokhacdai@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 29/12/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 14/02/2017 Ngày báo c ng: 20/02/2017 17 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 3-2017 Cho tới nay, Việt Nam có số sở nghiên cứu xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine dựa hệ thống “kín” Bio-plex Bio-Rad [1, 2] Tuy nhiên, việc Bio-Rad ngừng cung cấp hóa chất xét nghiệm Việt Nam dẫn đến xét nghiệm phát đồng thời nhiều cytokine phải dừng lại Những kỹ thuật truyền thống RIA ELISA có hạn chế, xét nghiệm phát đơn lẻ cytokine Xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine phương pháp RIA ELISA cần số lượng lớn trang thiết bị cơng lao động mà khó đạt độ đồng kết xét nghiệm nhân viên xét nghiệm khác Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu, triển khai phương pháp xét nghiệm kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang có khả phát đồng thời nhiều cytokine mẫu xét nghiệm, nhằm khắc phục hạn chế kỹ thuật trước Dựa hệ thống Luminex-200 trang bị, tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm: Phát đồng thời nhiều cytokine mẫu chất chuẩn khác đánh giá độ xác thực phương pháp xét nghiệm FCMIA ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng vật liệu nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: lọ cytokine chuẩn dạng đông khô Hãng R & D (Mỹ) cung cấp bao gồm: Lọ 1: chứa cytokine IL-6; IL-17 TNF-α với nồng độ biết, đơn vị đo pg/ml 18 Lọ 2: chứa cytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α với nồng độ biết, đơn vị đo pg/ml * Vật liệu nghiên cứu: Hoá chất sinh phẩm xét nghiệm Hãng R & D (Mỹ) sản xuất theo yêu cầu nhóm nghiên cứu bao gồm: - Hỗn hợp với số lượng loại hạt từ khác nhau, loại hạt từ huỳnh quang gắn lên bề mặt loại kháng thể đơn clon đặc hiệu với cytokine người: interleukin (IL) 2, 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17; yếu tố kích thích tạo dòng clon tế bào đơn nhân tế bào hạt (GM-CSF); interferon gamma (IFN-γ) yếu tố hoại tử u alpha (TNF-α) Chia làm tổ hợp tương ứng 3-plex (IL-6; IL-17 TNF-α) 9-plex (IL-2, IL-4, IL-5, IL10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α) - Hỗn hợp kháng thể phát (detecting antibody) gắn biotin tương ứng tổ hợp nói - Phức hợp chất huỳnh quang PE gắn streptavidin - Các dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng R & D, Mỹ sản xuất cung cấp) - Hệ thống Luminex - 200 phần mềm điều khiển kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế tạo cài đặt) Các vật liệu thiết bị labo phụ trợ khác như: máy lắc, máy hút chân không, loại pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước cất, ống nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế cung cấp từ hãng sản xut Tạp chí y - dợc học quân số 3-2017 Phương pháp nghiên cứu * Nguyên lý phản ứng phát cytokine: Cytokine phát phản ứng miễn dịch huỳnh quang kiểu sandwich bề mặt vi hạt từ (hình 1) Bề mặt vi hạt gắn sẵn phân tử kháng thể đơn clon đặc hiệu với định kháng nguyên phân tử cytokine Khi ủ mẫu xét nghiệm với hạt phủ kháng thể, phân tử cytokine bị kháng thể đặc hiệu bắt giữ bám vào bề mặt hạt Sau đó, thêm kháng thể đơn clon thứ hai đặc hiệu với định kháng nguyên khác cytokine gắn biotin, tạo thành phức hợp miễn dịch gồm phân tử cytokine kẹp hai kháng thể đơn clon Cuối cùng, phức hợp streptavidin-PE thêm vào gắn vào kháng thể đơn clon thứ hai qua tương tác streptavidin-biotin Dước tác động tia laser bước sóng tử ngoại PE phát ánh sáng huỳnh quang, chứng tỏ cytokine có mặt mẫu xét nghiệm Lượng PE gắn vào tỷ lệ thuận với lượng kháng thể thứ hai, hay lượng cytokine có bề mặt hạt từ Dựa vào mật độ huỳnh quang phát từ hạt ủ với nồng độ cytokine cho phép định lượng cytokine Hình 1: Nguyên lý phản ứng phát cytokine * Kỹ thuật: Kỹ thuật FCMIA sử dụng hạt từ huỳnh quang có kích thước (tương tự tế bào), phát tín hiệu huỳnh quang khác làm giá đỡ để gắn phân tử sinh học kháng thể đặc hiệu lên bề mặt Các hạt phân tích phương pháp đếm tế bào/hạt theo dòng chảy (flowcytometry) với hai nguồn laser detector khác để kích thích nhận hai loại tín hiệu huỳnh quang độc lập hạt từ huỳnh quang phát (tín hiệu định tính) từ phản ứng đặc hiệu bề mặt hạt từ phát (tín hiệu định lượng) Nhờ phần mềm máy tính có khả phân biệt nhiều loại hạt từ huỳnh quang khác nhau, cho phép gắn loại hạt với kháng thể đặc hiệu khác nhau, trộn lại để phát đồng thời nhiều kháng nguyên khác mẫu xét nghiệm * Quy trình xét nghiệm: Bước 1: chia 50 µl hỗn hợp hạt từ gắn kháng thể vào giếng microplate 96 giếng Bước 2: cho 50 µl mẫu cytokine chuẩn pha lỗng bậc ba với lọ chất chuẩn nồng độ khác vào giếng ủ điều kiện lắc nhẹ máy lắc với thời gian 120 phút nhiệt độ phòng Rửa lần để loại bỏ thành phần không bám vào hạt phương pháp lọc qua màng lọc với máy hút chân khơng 19 T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2017 Bc 3: cho 50 µl hỗn hợp kháng thể đơn clon đặc hiệu cytokine gắn biotin vào ủ tiếp điều kiện 60 phút để hình thành phức hợp miễn dịch kiểu sanhdwich Rửa lần theo mơ tả bước Bước 4: cho 50 µl dung dịch streptavidin-PE vào, ủ 30 phút cho gắn vào phức hợp miễn dịch thông qua tương tác biotin-treptavidin Rửa lần theo mô tả bước để loại bỏ phức hợp streptavidin-PE tự Bước 5: cho 100 µl dung dịch rửa vào giếng, sau đọc phân tích kết hệ thống Luminex - 200 chế độ chọn tốc độ dòng chảy (60 µl/phút) thể tích mẫu đọc 50 µl KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN (a) (b) Hình 2: Biểu đồ phân bố hạt từ theo tín hiệu huỳnh quang định tính cytokine (a) cytokine (b) Hình 2a 2b biểu thị phân bố loại hạt từ loại hạt từ khác tương ứng với loại cytokine cần phát hiện, nhận biết thơng qua tín hiệu huỳnh quang quang định tính hạt từ phát Kết cho thấy nhóm hạt từ nhóm hạt từ khác phân bố độc lập khơng có giao thoa, chứng tỏ khơng có ảnh hưởng chéo loại cytokine cần phát Hình 3: Đường cong biểu thị nồng độ chuẩn cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng (a) đường chuẩn phát đồng thời cytokine hệ thống Luminex - 200 (b) Hình 3a biểu thị nồng độ chuẩn loại cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng, nồng độ cytokine giảm theo bậc 3, mật độ huỳnh quang đo giảm tương ứng Hình 3b biểu thị đường chuẩn phát đồng thời cytokine hệ thống 20 T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2017 Luminex - 200 Kết cho thấy có tương quan thuận nồng độ cytokine mật độ huỳnh quang trung bình đo phức hợp huỳnh quang hạt từ phát ra, cho phép sử dụng đường chuẩn vào xét nghiệm định lượng đồng thời cytokine IL-6; IL-17 TNF-α Hình 4: Đường cong biểu thị nồng độ chuẩn cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng (a) đường chuẩn phát đồng thời cytokine hệ thống Luminex - 200 (b) Hình 4a biểu thị nồng độ chuẩn loại cytokine theo tín hiệu huỳnh quang định lượng, nồng độ cytokine giảm theo bậc 3, mật độ huỳnh quang đo giảm tương ứng Hình 4b biểu thị đường chuẩn phát đồng thời cytokine hệ thống Luminex - 200 Kết cho thấy có tương quan thuận nồng độ cytokine mật độ huỳnh quang trung bình đo phức hợp huỳnh quang hạt từ phát ra, cho phép sử dụng đường chuẩn xét nghiệm định lượng đồng thời cytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ TNF-α Bảng 1: Đánh giá độ xác thực xét nghiệm phát đồng thời cytokine (IL-6; IL-17 TNF-α) số % khôi phục Loại cytokine Chất chuẩn IL-6 IL-17 Nồng độ Nồng độ % khôi Nồng độ Nồng độ chuẩn đo phục chuẩn đo (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) TNF-a % khôi Nồng độ Nồng độ % khôi phục chuẩn đo phục (pg/ml) (pg/ml) Std1 3.420 3.430,14 100,30 4.840 4.851,03 100,23 3.620 3.632,68 100,35 Std2 1.140 1.123,57 98,56 1.613 1.587,35 98,41 1.207 1.183,64 98,06 Std3 380 396,78 104,42 538 567,28 105,44 402 431,20 107,26 Std4 127 123,89 97,55 179 167,47 93,56 134 128,22 95,68 Std5 42 40,75 97,03 60 63,99 106,65 45 43,27 96,15 Std6 14 14,50 103,57 20 19,51 97,56 15 15,88 105,83 Std7 4,98 99,49 7,04 100,54 4,95 99,08 Việc phát đồng thời cytokine (IL-6; IL-17 TNF-α) có độ xác thực cao Tỷ lệ % khôi phục nồng độ đo nồng độ chuẩn biết dao động từ 95,6 - 107,26% 21 Tạp chí y - dợc học quân số 3-2017 Bảng 2: Đánh giá độ xác thực xét nghiệm phát đồng thời cytokine (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ TNF-α) số % khôi phục Loại cytokine Chất chuẩn % khôi phục IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-γ TNF-α Std1 100,42 100,91 101,05 100,88 100,14 99,15 100,12 99,99 99,99 Std2 100,06 102,56 97,63 96,02 99,17 101,69 99,28 100,60 101,53 Std3 97,81 95,81 104,42 108,34 102,08 99,84 102,49 101,85 100,49 Std4 104,49 98,38 97,43 99,01 102,67 97,04 99,45 94,16 95,93 Std5 96,41 106,92 99,31 92,47 91,49 104,89 95,89 106,32 100,60 Std6 106,33 96,01 101,42 109,61 109,49 97,86 104,50 98,59 103,59 Std7 92,86 104,81 99,73 97,59 100,39 99,18 100,07 98,44 Việc phát đồng thời cytokine (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ TNF-α) có độ xác thực cao Tỷ lệ % khôi phục nồng độ đo nồng độ chuẩn biết dao động từ 92,86 - 109,61% Với chất cần phát cytokine, có biến động nồng độ cao khoảng cách tương đối giá trị đo giá trị thực < 10% xem có độ xác thực cao Kỹ thuật FCMIA kỹ thuật mới, cho phép phát đồng thời nhiều protein khác mẫu thử dựa tảng công nghệ Luminex, với việc sử dụng phần mềm phân tích “mở” cho phép ứng dụng loại kít xét nghiệm khác nhiều đơn vị cung cấp Đây công nghệ “mở” cho phép người sử dụng tự thiết kế panel xét nghiệm để phát nhiều chất thử sinh học khác tuỳ theo mục đích nghiên 22 97,71 cứu Kết phân loại loại hạt dựa vào tín hiệu huỳnh quang định tính hạt từ phát (hình 2a 2b), cho thấy khơng có chồng chéo nhóm hạt, chứng tỏ hệ thống Luminex 200 có khả nhận diện riêng rẽ loại hạt huỳnh quang khác Như vậy, cho phép phát đồng thời nhiều cytokine mà khơng có phản ứng chéo [4] Việc xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine theo yêu cầu nghiên cứu khác mẫu thử dựa hệ thống “kín” bio-plex phải dừng lại sau Bio-Rad ngừng cung cấp hóa chất xét nghiệm Việt Nam, có hóa chất xét nghiệm cytokine [2] Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật FCMIA, kỹ thuật mới, phù hợp xét nghiệm phát đồng thời nhiều cytokine mẫu thử dựa hệ thống Luminex - 200 T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2017 KT LUN TI LIỆU THAM KHẢO - Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (FCMIA) xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine với hai tổ hợp khác cytokine: IL-6, IL-17, Đỗ Khắc Đại, Lê Văn Đông, Phạm Thế Anh CS Kết xét nghiệm đồng thời cytokine dịch màng phổi bệnh nhân ung thư lao phổi cơng nghệ flowcytometry-assited immunoassay Tạp chí Y - Dược học Quân 2007, 5, tr.17-23 TNF-α cytokine: IL-2, IL-4, IL-5, IL- Bio-Rad Bio-Plex Cytokine Assay Instruction Manual 2006 10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α - Kết có độ xác thực cao ứng dụng việc định lượng đồng thời nhiều cytokine mẫu xét nghiệm Goldsby R.A, Kindt T.J, Osborne B.A, Kuby J Cytokines in: Kuby Immunology 5th Ed Freeman and Company 2003, pp.276-298 R & D Systems Magnetic Luminex Screening Assay 2016 23 ... TÀI LIỆU THAM KHẢO - Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (FCMIA) xét nghiệm đồng thời nhiều cytokine với hai tổ hợp khác cytokine: IL-6, IL-17,... độ đồng kết xét nghiệm nhân vi n xét nghiệm khác Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu, triển khai phương pháp xét nghiệm kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang có khả phát. .. lượng cytokine có bề mặt hạt từ Dựa vào mật độ huỳnh quang phát từ hạt ủ với nồng độ cytokine cho phép định lượng cytokine Hình 1: Nguyên lý phản ứng phát cytokine * Kỹ thuật: Kỹ thuật FCMIA sử dụng