Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm ứng dụng kỹ thuật định týp kháng nguyên bạch cầu người (HLA) mới dựa trên nguyên lý kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (FCMIA).
Tạp chí y - dợc học quân số 5-2020 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG TRONG ĐỊNH TÝP HLA Nguyễn Ngọc Tuấn1, Đỗ Khắc Đại1 Hoàng Trung Kiên1, Nguyễn Đặng Dũng1 TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật định týp kháng nguyên bạch cầu người (HLA) dựa nguyên lý kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang (FCMIA) Đối tượng phương pháp: Sử dụng kít định týp HLA-SSO dựa nguyên lý FCMIA để định týp mẫu thử DNA định týp phương pháp PCR-SSP, so sánh kết định týp HLA phân tích ưu, nhược điểm kỹ thuật Kết quả: Bộ kít định týp PCR-SSO cho kết định týp xác, định týp nhiều mẫu thời gian ngắn Kết luận: Cơng nghệ FCMIA có số ưu điểm định týp HLA độ xác, thời gian tiến hành ngắn, chi phí tương đương kỹ thuật khác * Từ khoá: Định týp HLA; Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng nguyên bạch cầu người (human leukocyte antigen - HLA) mã hóa hệ thống gen nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, bao gồm locus A, B (HLA lớp I) DR (HLA lớp II) HLA tham gia vào trình nhận diện kháng nguyên, dẫn đến hình thành đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại kháng ngun lạ thể người Chính vậy, HLA đặc biệt quan trọng phản ứng thải ghép [1] Để giảm thiểu phản ứng thải ghép cần lựa chọn người cho có HLA phù hợp với người nhận tạng Năm 1992, Học viện Quân y thực thành công kỹ thuật định týp HLA phương pháp huyết học Năm 2011, Học viện Quân y, Bộ môn Miễn dịch tiếp tục thành công định týp HLA kỹ thuật sinh học phân tử (PCR-SSP) [3] Từ nay, định týp HLA định cho hầu hết ca ghép thận, ghép tim thực Học viện Quân y Góp phần không nhỏ chống thải ghép, giúp tăng chất lượng sống cho bệnh nhân ghép Kỹ thuật PCR-SSP có nhiều ưu điểm so với phương pháp huyết học cịn tồn hạn chế, chưa thể thực việc định týp nhanh lúc nhiều mẫu xét nghiệm đa số thao tác thực chưa tự động hóa, kết định týp phụ thuộc vào nhận định chủ quan người đọc dựa kết điện di Yêu cầu định týp nhanh xác lúc nhiều mẫu xét nghiệm xảy có nhiều người nhận tạng mong muốn kiểm tra phù hợp với tạng hiến từ người cho chết não Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y Người phản hồi: Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com) Ngày nhận bài: 06/5/2020 Ngày báo c ng: 22/6/2020 17 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 5-2020 Trong thời gian gần đây, xét nghiệm sử dụng đầu dò oligonucleotid ứng dụng rộng rãi giới Kỹ thuật PCR-SSO dựa nguyên lý áp dụng định týp HLA nhiều nước với nhiều ưu điểm độ xác độ phân giải [4], ngồi định týp nhiều mẫu xét nghiệm thời gian ngắn Chính vậy, nghiên cứu đề tài nhằm: Phát triển ứng dụng kỹ thuật định týp HLA (kỹ thuật PCR-SSO dựa công nghệ hạt từ Luminex) [1], qua đáp ứng yêu cầu thực tiễn đặt ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng vật liệu nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: 05 mẫu thử DNA tách từ máu tồn phần có nồng độ từ 40 - 200 ng/µl, độ tinh từ 1,8 - 2,2 (tỷ lệ OD 260/280), biết trước kết định týp dựa kỹ thuật PCR-SSP * Vật liệu nghiên cứu: - Các hoá chất sinh phẩm xét nghiệm (hãng LIFECODES, Mỹ) bao gồm: Master Mix; Probe Mix; Taq Polymerase; nước cất: Nuclease-free, khử ion; phức hợp chất huỳnh quang PE gắn streptavidin; dung dịch pha loãng PE - Phần mềm MATCH IT! DNA sử dụng phân tích HLA - Hệ thống Luminex 200 phần mềm điều khiển kèm (hãng Luminex, Mỹ) - Các vật liệu thiết bị labô khác máy PCR, tủ thao tác PCR, máy ủ nhiệt, máy vortex, máy spin, pipet đầu týp loại, giấy bạc, ống PCR, phiến Costar (Costar No.6509) đạt tiêu chuẩn quốc tế Phương pháp nghiên cứu * Nguyên lý định týp HLA dựa kỹ thuật FCMIA: Nhân gen với cặp mồi Biotin hóa Lai DNA với hạt từ Gắn nhãn SA-PE Phân tích huỳnh quang DNA Mồi Biotin hóa Sản phẩm PCR: sợi đơn, sợi đôi 100 loại hạt từ với mã màu khác SA-PE Hình 1: Nguyên lý định týp HLA dựa kỹ thuật FCMIA Định týp HLA dựa kỹ thuật FCMIA [1] bao gồm công đoạn nhân gen xác định gen đặc hiệu Khác với kỹ thuật PCR-SSP, kỹ thuật định týp HLA FCMIA sử dụng cặp mồi Biotin hóa Các sản phẩm PCR sau nhân lên gắn Biotin Các đoạn DNA lai với hạt từ huỳnh quang (có mã màu khác nhau, gắn với probe hay gọi đầu dò cho gen đặc hiu) 18 Tạp chí y - dợc học quân sè 5-2020 Sản phẩm sau lai gắn nhãn SA-PE (streptavidin - phycoerythrin) thông qua tương tác streptavidin - biotin Khi đưa vào máy phân tích, phức hợp DNA - hạt từ tác động tia laser bước sóng tử ngoại phát ánh sáng huỳnh quang Mật độ huỳnh quang PE phát tác động laser xanh chứng tỏ có mặt sản phẩm DNA khuếch đại Song song với đó, mật độ huỳnh quang phát từ hạt từ tác động laser đỏ cho phép nhận biết hạt từ hạt từ nào, tương ứng với đầu dò cho gen đặc hiệu Gen đặc hiệu xác định có xuất đồng thời loại tín hiệu [4] * Quy trình xét nghiệm: - Bước 1: Chuẩn bị thành phần cần thiết cho khuếch đại DNA: Thành phần Thể tích cho vào ống PCR Master Mix µl DNA µl (dung dịch chuẩn độ có nồng độ 15 ng/µl) Taq Polymerase 0,2 µl Nước cất 20 µl - Bước 2: Chạy chu trình nhân gen: Bước Thời gian nhiệt độ Số chu kỳ 95°C phút 95°C 15 giây 12 60°C 30 giây 72°C 30 giây 95°C 10 giây 28 63°C 30 giây 72°C 30 giây 72°C phút 4°C ~ ∞ - Bước 3: Đợi phản ứng PCR 10 phút, lấy dung dịch hạt từ ủ ấm 600C, vortex 20 giây, spin giây - Bước 4: Trộn 15 µl dung dịch hạt từ + µl sản phẩm PCR locus bước trên, sử dụng phiến Costar 96 giếng Che phủ giếng miếng dán Đặt phiến Costar vào máy PCR sau chạy chương trình lai sau: Bước Thời gian nhiệt độ 97°C phút 47°C 10 phút 56°C phút 56°C ~ 19 Tạp chí y - dợc học quân sè 5-2020 - Bước 5: Chuẩn bị dung dịch PE Mỗi giếng gồm 170 µl dung dịch pha lỗng 0,85 µl PE Kết thúc q trình gắn (nhiệt độ giữ 56°C), mở nắp máy PCR, để nguyên phiến máy Gỡ bỏ miếng dán cho vào giếng 170,85 µl dung dịch PE - Bước 6: Lấy phiến đặt lên khay kim loại Cho khay kim loại vào máy Luminex để phân tích kết KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN (a) (b) Biểu đồ 1: Số lượng phân bố hạt từ huỳnh quang Biểu đồ 1a số lượng hạt từ sử dụng để phân tích liệu Với loại hạt từ, số lượng tối thiểu 40 hạt Tín hiệu hạt sử dụng để tính giá trị mật độ huỳnh quang trung bình (medium fluorescence intensity - MFI) Biểu đồ 1b phân bố 100 loại hạt từ huỳnh quang sử dụng Có thể thấy hạt từ phân bố đều, không bị phân tán Biểu đồ 2: Tỷ lệ đầu dị sử dụng để phân tích Có 100 đầu dị tương tứng 100 loại hạt từ sử dụng Kết phân tích cho thấy, 100% đầu dị hệ thống phân tích để đưa kết Việc đầu dị khơng đạt tỷ lệ 100% lượng hạt từ sử dụng lai khơng đầy đủ, tín hiệu có độ xác khơng cao 20 T¹p chÝ y - dợc học quân số 5-2020 Hỡnh 2: Kết phân tích HLA-DRB1 phần mềm Match IT! DNA Theo kết phân tích dựa tín hiệu MFI từ đầu dò (cụ thể locus A), cột màu đỏ tương ứng giá trị dương tính, cột màu xanh tương ứng giá trị âm tính Kết định týp tô màu vàng kết hệ thống phân tích đưa ra, có độ phù hợp cao (HLA-DRB1*10:01:01:01 HLA-DRB1*12:02:01) Tương tự, hệ thống cho kết định týp HLA-A HLA-B trùng với kết thực theo phương pháp PCR-SSP độ phân giải cao Bảng 1: So sánh kỹ thuật PCR-SSP PCR-SSO Kỹ thuật Nội dung Tiêu chuẩn mẫu DNA Thời gian định týp: (sau tách DNA) - mẫu - ≥ mẫu Phân tích kết PCR-SSP PCR-SSO Nồng độ độ tinh DNA tương đương 90 - 120 phút Thêm 90 phút/mẫu 90 - 100 phút Thêm phút/mẫu Dựa vào kết điện di Dựa vào tín hiệu huỳnh quang đo Chi phí xét nghiệm Với tiêu chuẩn DNA đầu vào nhau, rõ ràng kỹ thuật PCR-SSO dựa cơng nghệ hạt từ Luminex có nhiều ưu điểm hơn, thời gian định týp, độ xác dựa tín hiệu huỳnh quang đo độ phân giải tốt Với yêu cầu định týp lúc cho nhiều mẫu xét nghiệm, với khả tự Chi phí tương đương động hóa đến 90%, kỹ thuật PCR-SSO đáp ứng tốt yêu cầu Việc định týp thêm 10 mẫu thêm 30 phút, để thực điều với kỹ thuật PCR-SSP (mất tối thiểu thêm 15 tiếng làm liên tục) Kỹ thuật PCR-SSP nhiều thời gian trình nhân gen điện di thực 21 T¹p chÝ y - dợc học quân số 5-2020 trờn c plate 96 giếng, kỹ thuật PCR-SSO giếng Có nghĩa là, thời gian nhân gen, kỹ thuật PCRSSP nhân cho mẫu xét nghiệm kỹ thuật PCR-SSO 24 mẫu Quá trình điện di PCR-SSP tương tự, kỹ thuật viên phải chuyển sản phẩm nhân gen mẫu xét nghiệm từ plate 96 giếng sang 96 giếng điện di tương ứng, PCR-SSO cần đưa plate vào hệ thống phân tích cho tối đa 24 mẫu xét nghiệm/lần đọc Chi phí cho xét nghiệm định týp HLA PCR-SSO tương đương kỹ thuật PCR-SSP KẾT LUẬN Ứng dụng thành công kỹ thuật FCMIA định týp HLA với độ xác độ phân giải cao Kỹ thuật có nhiều ưu điểm, quan trọng khả tự 22 động hóa lên đến 90% định týp nhanh nhiều mẫu xét nghiệm thời gian ngắn TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Văn Mạnh CS Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng số số miễn dịch bệnh nhân sau ghép thận Luận án Tiến sĩ Y học Học viện Quân y 2009 Đỗ Khắc Đại CS Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang phát đồng thời nhiều cytokine Tạp chí Y - Dược học Quân 2017; 3:17-23 Nguyễn Đặng Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định HLA Tạp chí Y - Dược học Quân 2011; 6:45-52 Trajanoski D, Fidler SJ HLA typing using bead-based methods In Immunogenetics, Humana Press, Totowa, NJ 2012:47-65 ... CS Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang phát đồng thời nhiều cytokine Tạp chí Y - Dược học Quân 2017; 3:17-23 Nguyễn Đặng Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn Nghiên cứu. .. đọc Chi phí cho xét nghiệm định týp HLA PCR-SSO tương đương kỹ thuật PCR-SSP KẾT LUẬN Ứng dụng thành công kỹ thuật FCMIA định týp HLA với độ xác độ phân giải cao Kỹ thuật có nhiều ưu điểm, quan... giải [4], ngồi định týp nhiều mẫu xét nghiệm thời gian ngắn Chính vậy, chúng tơi nghiên cứu đề tài nhằm: Phát triển ứng dụng kỹ thuật định týp HLA (kỹ thuật PCR-SSO dựa cơng nghệ hạt từ Luminex)