Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang phát hiện kháng thể kháng HLA huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận

Mục tiêu: sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân nhận thận ghép bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang và đánh giá hiệu quả định danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang.

Tạp chí y - dợc học quân số 3-2019 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG HLA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN SUY THẬN MẠN TÍNH DỰ KIẾN GHÉP THẬN Đỗ Khắc Đại1; Nguyễn Ngọc Tuấn1 Hồng Trung Kiên1; Nguyễn Đặng Dũng1 TĨM TẮT Mục tiêu: sàng lọc phát kháng thể kháng HLA huyết bệnh nhân nhận thận ghép kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang đánh giá hiệu định danh kháng thể kháng HLA huyết bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang Đối tượng phương pháp: sử dụng kít sàng lọc định danh kháng thể kháng HLA 55 mẫu huyết thu thập từ 55 bệnh nhân suy thận phân tích kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang hệ thống Luminex 200 Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y Kết quả: 27/55 mẫu huyết (49,09%) có kháng thể kháng HLA dương tính, dương tính với lớp I + lớp II chiếm tỷ lệ cao (44.44%) Định danh 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng HLA-B 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II Kết luận: ứng dụng thành công kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang xét nghiệm sàng lọc định danh kháng thể kháng HLA huyết bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận * Từ khố: Suy thận mạn tính (dự kiến ghép thận); Phát kháng thể kháng HLA; Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent Assay in Detection of Anti-HLA Antibodies in Recipient Candidates for Kidney Transplant Summary Objectives: Anti-HLA antibodies in serum of kidney transplant recipients may significantly be involved in antibody-mediated graft rejection Identification of the antibodies before kidney transplant in these patients, therefore, helps clinicians to better manage the patients both pre-and post-transplant The aims of the present study are to screen and to identify anti-HLA antibodies in serum of recipient candidates for kidney transplant at 103 Military Hospital Subjects and methods: A fluorescence covalent microbead immunosorbent assay test kit, along with Luminex 200 analyzer, were adopted in the study which allowed screening and identifying anti-HLA antibodies present in 55 serum samples from 55 recipient candidates for kidney transplant Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com) Ngày nhận bài: 21/12/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/01/2019 Ngày báo đăng: 28/02/2019 Tạp chí y - dợc học quân sè 3-2019 Results: 27 (out of 55) serum samples (49.09%) were reactive to anti-HLA antibodies; samples simultaneously reactive to anti-HLA class I and class II accounted for 44.4% of total number of reactive samples HLA class I antibodies identified include 17 anti-HLA-A and 31 anti-HLA-B; for HLA class II antibodies, 22 anti-HLA-DR antibodies were identified Conclusions: Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay with Luminex 200 analyzer were effective in screening and identification of anti-HLA antibodies in kidney transplant recipients * Keywords: Kidney transplant; Recipient candidates for kidney transplant; Anti-HLA antibody; Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ ca ghép thận giới thành công năm 1954, ghép thận trở thành phương pháp điều trị tối ưu bệnh nhân (BN) suy thận mạn (STM) giai đoạn cuối Tại Việt Nam, ca ghép thận thực thành công Bệnh viện Quân y 103 vào tháng - 1992 Từ đến nay, có hàng ngàn BN ghép thận thành công trung tâm y tế lớn toàn quốc Một vấn đề quan trọng ghép thận tình trạng đào thải thận ghép, nguyên nhân đáp ứng miễn dịch thể túc chủ chống lại mô ghép khác gen Trong đó, phản ứng đào thải thận ghép tối cấp, cấp tính mạn tính qua trung gian kháng thể nhiều tác giả công bố [1] Nhiều phương pháp xét nghiệm phát quang (FCMIA) Trong đó, kỹ thuật FCMIA kỹ thuật với nhiều ưu điểm bật có độ nhạy độ xác cao việc phát kháng thể kháng lại kháng nguyên HLA so với kỹ thuật CDC ELISA Tại Học viện Quân y, việc triển khai thành công kỹ thuật có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, góp phần hạn chế tối đa phản ứng đào thải mô ghép ghép thận, theo dõi xuất kháng thể kháng HLA sau ghép nhằm nâng cao hiệu chẩn đoán điều trị cho BN nhận thận ghép Xuất phát từ phân tích trên, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Sàng lọc phát kháng thể kháng HLA huyết kỹ thuật FCMIA hiệu định danh kháng thể kháng HLA BN STM tính dự kiến ghép thận kháng thể kháng - kháng nguyên HLA trước ghép (xét nghiệm tiền mẫn cảm) ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ứng dụng lâm sàng nhằm hạn NGHIÊN CỨU chế phản ứng đào thải thận ghép tối cấp Đối tượng vật liệu nghiên cứu cấp tính qua trung gian kháng thể * Đối tượng nghiên cứu: 55 mẫu huyết thu thập từ 55 BN STM tính dự kiến ghép thận có định ghép thận Bệnh viện Quân y 103 kỹ thuật gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC); kỹ thuật ELISA kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh T¹p chí y - dợc học quân số 3-2019 * Vật liệu nghiên cứu: - kít xét nghiệm: + Kít xét nghiệm sàng lọc phát kháng thể kháng HLA (LMX) (Hãng Immucor, Mỹ) + Kít xét nghiệm định danh kháng thể kháng HLA (ID1 ID2) (Hãng Immucor, Mỹ) - Hoá chất sinh phẩm xét nghiệm: + Hỗn hợp với số lượng loại hạt từ khác nhau, loại hạt từ huỳnh quang gắn lên bề mặt loại kháng nguyên HLA + Hỗn hợp kháng thể phát gắn phức hợp huỳnh quang PE + Dung dịch pha mẫu, dung dịch pha sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng Immucor, Mỹ sản xuất cung cấp) * Phương pháp xét nghiệm sàng lọc phát kháng thể kháng HLA kỹ thuật FCMIA: - Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết + µl hỗn hợp hạt từ mang kháng nguyên HLA (LMX bead) lấy từ kít LMX vào giếng xét nghiệm tương ứng - Bước 2: ủ nhiệt độ phòng máy lắc 30 phút (trong buồng tối) Sau thời gian ủ tiến hành rửa plate lần cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào giếng Hút cạn dịch giếng xét nghiệm hệ thống bơm hút chuyên dụng - Bước 3: tra vào giếng xét nghiệm 50 µl kháng thể phát gắn chất huỳnh quang PE - Bước 4: ủ rửa plate theo chi tiết mô tả bước + Hệ thống Luminex 200 phần mềm điều khiển kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế tạo cài đặt) - Bước 5: tra vào giếng xét nghiệm 150 µl dung dịch rửa, trộn máy lắc 30 giây - Vật liệu thiết bị labô phụ trợ khác máy lắc, máy hút chân không, loại pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước cất, ống nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế hãng sản xuất cung cấp - Bước 6: đọc phân tích kết hệ thống Luminex 200 Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp tách huyết từ máu toàn phần: Lấy máu tồn phần số lượng ml cho vào ống khơng có chất chống đơng, đặt tủ ấm 30 phút nhiệt độ 370C để co cục máu tự nhiên Ly tâm với tốc độ 2.500 rpm 20 phút, hút 0,5 ml dịch màu vàng cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml tiến hành xét nghiệm * Phương pháp xét nghiệm định danh kháng thể kháng HLA kỹ thuật FCMIA: - Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết + µl hỗn hợp hạt từ mang kháng nguyên HLA (ID1 ID2 bead) lấy từ kít ID1 ID2 vào giếng xét nghiệm tương ứng - Bước 2: ủ nhiệt độ phòng máy lắc 30 phút (trong buồng tối) Sau thời gian ủ, tiến hành rửa plate lần cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào giếng Hút cạn dịch giếng xét nghiệm hệ thống bơm hút chuyên dụng T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2019 - Bc 3: tra vào giếng xét nghiệm 50 µl kháng thể phát gắn chất huỳnh quang PE - Bước 4: ủ rửa plate theo chi tiết mô tả bước - Bước 5: tra vào giếng xét nghiệm 150 µl dung dịch rửa, trộn máy lắc 30 giây - Bước 6: đọc phân tích kết hệ thống Luminex 200 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN * Kết sàng lọc phát kháng thể kháng HLA (n = 55): Dương tính: 27 BN (49,09%); âm tính: 28 BN (50,91%) Theo Bùi Văn Mạnh CS (2009), tỷ lệ 69,2% [2], Yamamoto CS (2014) 39,4% [3] Kết thu khác phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu, cỡ mẫu nghiên cứu Đặc biệt phương pháp xét nghiệm phát kháng thể kháng HLA Bùi Văn Mạnh CS nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ (n = 39) so với nghiên cứu Yamamoto Chúng nghiên cứu cỡ mẫu lớn (n = 55); đối tượng nghiên cứu BN suy thận có định ghép thận sử dụng kỹ thuật FCMIA để phát kháng thể kháng HLA * Kết sàng lọc phát kháng thể kháng HLA theo lớp kháng nguyên HLA: Dương tính với lớp I: BN (29,63%); dương tính với lớp II: BN (25,93%); dương tính với lớp I + lớp II: 12 BN (44,44%) Trên mẫu có kháng thể kháng HLA dương tính, nhóm có kháng thể kháng HLA dương tính với lớp (lớp I + lớp II) chiếm tỷ lệ cao (44.44%), cao trường hợp dương tính với lớp Kết giúp nhà lâm sàng theo dõi điều trị BN sau ghép thận tốt Trường hợp kháng thể kháng HLA dương tính với lớp, tiên lượng xấu dương tính với lớp Bảng 1: Kết định danh kháng thể kháng HLA-A Số thứ tự Kháng thể kháng HLA-A Tần suất xuất Tỷ lệ (%) A*01 7,32 A*02 8,54 A*03 7,32 A*11 7,32 A*23 4,88 A*24 2,44 A*25 1,23 A*26 7,32 A*29 3,66 10 A*30 6,10 11 A*31 7,32 12 A*32 4,88 13 A*33 10,98 14 A*34 1,23 15 A*66 3,66 16 A*68 10 12,20 17 A*74 3,66 82 100 Tổng Đã định danh 17 loại kháng thể kháng HLA-A Trong đó, chiếm tỷ lệ cao kháng thể kháng HLA-A*68 (12,20%) thấp kháng thể kháng HLA-A*2534 (1,23%) T¹p chÝ y - dợc học quân số 3-2019 Bng 2: Kt qu định danh kháng thể kháng HLA-B Số thứ tự Kháng thể kháng HLA-B Tần suất xuất Tỷ lệ % B*07 2,99 B*08 7,46 B*14 8,96 B*15 5,97 B*27 5,97 B*35 5,97 B*37 2,99 B*38 1,49 B*39 1,49 10 B*40 4,48 11 B*41 1,49 12 B*42 2,99 13 B*44 4,48 14 B*45 4,48 15 B*47 1,49 16 B*48 1,49 17 B*49 1,49 18 B*52 1,49 19 B*53 1,49 20 B*54 2,99 21 B*57 2,99 22 B*58 4,48 23 B*62 1,49 24 B*63 1,49 25 B*64 1,49 26 B*65 5,96 27 B*72 1,49 28 B*73 1,49 29 B*77 2,99 30 B*78 2,99 31 B*81 1,49 67 100 Tổng Đã định danh 31 loại kháng thể kháng HLA-B Trong chiếm tỷ lệ cao kháng thể kháng HLA-B*14 (8,96%) v B*08 (7,46%) Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 3-2019 Nghiên cứu phát số kháng thể kháng lại kháng nguyên HLA A*23, A*25, B*08, B*14… Theo nghiên cứu Nguyễn Đặng Dũng CS, kháng nguyên mẫu tế bào thu nhận từ máu cuống rốn chưa thấy xuất [3], chứng tỏ cộng đồng người Việt có người mang kháng nguyên này, để phát kháng ngun gặp đòi hỏi phải có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn thực nhiều khu vực khác đưa kết luận xác Bảng 3: Kết định danh kháng thể kháng HLA lớp II theo phân lớp Số TT Phân lớp Tần suất xuất Tỷ lệ (%) B1*01 10,71 B1*03 3,57 B1*04 1,79 B1*07 3,57 B1*08 3,57 B1*09 5,36 B1*10 14,29 B1*11 3,57 B1*12 3,57 10 B1*13 3,57 11 B1*14 5,36 12 B1*16 3,57 B3*01 1,79 B3*02 3,57 B3*03 1,79 Kháng thể kháng HLA lớp II DRB1 13 14 DRB3 15 16 DRB4 B4*01 7,14 17 DRB5 B5*01 5,36 B1*02 5,36 B1*03 5,36 B1*04 1,79 21 B1*05 3,57 22 B1*06 1,79 56 100 18 19 20 DQB1 Tổng Đã định danh 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II, chiếm tỷ lệ lớn l HLA-DRB1*10 (14,29%) 10 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 3-2019 Bảng 4: Kết định danh kháng thể kháng HLA lớp II theo nhóm Số Kháng thể thứ tự kháng HLA lớp II Số lượng Tỷ lệ % DRB1 14 48.28 DRB3 6.90 DRB4 13.79 DRB5 10,35 DQB1 20,68 29 100 Tổng Đã định danh nhóm kháng thể kháng HLA lớp II (HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5 HLA-DQB1) Trong đó, chiếm tỷ lệ cao kháng thể kháng HLA-DRB1 (48,28%), DQB1 (20,68%) thấp kháng thể kháng DRB3 (6,90%) Bảng 5: Kết định danh kháng thể kháng HLA theo loại kháng thể/mẩu huyết Loại kháng thể kháng HLA/mẫu huyết Số lượng Tỷ lệ (%) 29,62 2-3 14,81 4-6 14,81 >6 11 40,76 27 100 Tổng Số mẫu huyết có > loại kháng thể kháng HLA chiếm tỷ lệ cao (40,76%) Kết kỹ thuật FCMIA có độ nhạy cao, định danh nhiều loại kháng thể khác tương ứng với allen kháng nguyên biết gắn hạt từ huỳnh quang Do vậy, xét nghiệm tiền mẫn cảm trước ghép kỹ thuật FCMIA giúp sàng lọc lựa chọn người cho thận phù hợp nhất, góp phần làm giảm tỷ lệ đào thải thận ghép lâm sàng KẾT LUẬN Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật FCMIA xét nghiệm sàng lọc định danh kháng thể kháng HLA huyết BN nhận thận ghép sau: - 27/55 BN (49,09%) dương tính với kháng thể kháng HLA, dương tính với HLA lớp I: 29,63%; lớp II: 25,93%; lớp I lớp II: 44,44% - Đã định danh 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng HLA-B 22 loại kháng thể kháng HLA-DR DQ với tần suất xuất cao kháng thể kháng HLA-A*68; HLA-B*14 HLA-DRB1*10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Mạnh An Những tiến ghép tạng Việt Nam Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2014, số 8, tr.41-43 Bùi Văn Mạnh CS Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng số số miễn dịch BN sau ghép thận Luận án Tiến sỹ Y học Học viện Quân y 2009 Nguyễn Đặng Dũng CS Xây dựng sở liệu phần mềm tra cứu HLA mẫu tế bào gốc dây rốn hiến tặng cho Ngân hàng Tế bào gốc Mekostem Tạp chí Y - Dược học Quân 2007, số 7, tr.21-28 Yamamoto H, Uchida N, Matsuno N, Ota H, Kageyama K, Wada et al Anti-HLA antibodies other than against HLA-A, -B, -DRB1 adversely affect engraftment and nonrelapse mortality in HLA-mismatched single cord blood transplantation: Possible implications of unrecognized donor-specific anti-bodies Biol Blood Marrow Transplant 2014, 20 (10), pp.1634-1640 doi:10.1016/j bbmt 2014.06.024 11 ... từ 55 BN STM tính dự kiến ghép thận có định ghép thận Bệnh vi n Quân y 103 kỹ thuật gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC); kỹ thuật ELISA kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh T¹p chÝ... mục tiêu: Sàng lọc phát kháng thể kháng HLA huyết kỹ thuật FCMIA hiệu định danh kháng thể kháng HLA BN STM tính dự kiến ghép thận kháng thể kháng - kháng nguyên HLA trước ghép (xét nghiệm tiền... loại kháng thể kháng HLA- A; 31 loại kháng thể kháng HLA- B 22 loại kháng thể kháng HLA- DR DQ với tần suất xuất cao kháng thể kháng HLA- A*68; HLA- B*14 HLA- DRB1*10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Mạnh