Bài viết xây dựng kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân HA dựa vào phân tích các vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết quả phát hiện đột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải trình tự gen.5 gia đình bệnh nhân HA bao gồm bệnh nhân và các thành viên nữ trong gia đình đã được lựa chọn vào nghiên cứu. Kết quả cho thấy, 6 thành viên nữ của 3 gia đình bệnh nhân HA (mẹ, bác họ, chị họ hoặc em gái) đã được phát hiện là người lành mang gen bệnh. Microsatellite - DNA có thể được sử dụng như một kỹ thuật hiệu quả để phát hiện người lành mang gen bệnh HA ở Việt Nam.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÂY DỰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE - DNA PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A Trần Vân Khánh, Trần Quốc ðạt, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn Trường ðại học Y Hà Nội Hemophillia A (HA) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính X gây nên thiếu hụt yếu tố đơng máu FVIII Xác định đột b iến gen mã hố yếu tố FVIII (F8) nghiên cứu phổ biến Cho ñến nay, khoảng 1000 ñột b iến gen F8 ñã ñược b áo cáo Xác ñịnh ñột b iến gen, phát người lành mang gen bệnh tư vấn di truyền giải pháp hiệu giúp ngăn ngừa làm giảm tỉ lệ mắc b ệnh Việc phát người lành mang gen b ệnh thường ñược thực kỹ thuật phát ñột biến trực tiếp gen F8 dựa vào ñột b iến ñiểm bệnh nhân Tuy nhiên, số trường hợp không phát thấy ñột biến việc phát ñột biến gặp khó khăn cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage analysis) Trong nghiên cứu này, xây dựng kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định tình trạng mang gen bệnh thành viên nữ gia đình bệnh nhân HA dựa vào phân tích vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết phát ñột biến trực tiếp b ằng kỹ thuật giải trình tự gen.5 gia đình b ệnh nhân HA bao gồm b ệnh nhân thành viên nữ gia đình lựa chọn vào nghiên cứu Kết cho thấy, thành viên nữ gia đình b ệnh nhân HA (mẹ, b ác họ, chị họ em gái) ñã ñược phát người lành mang gen bệnh Microsatellite - DNA ñược sử dụng kỹ thuật hiệu ñể phát người lành mang gen b ệnh HA Việt Nam Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh, microsatellite - DNA I ðẶT VẤN ðỀ công tác chăm sóc bệnh nhân hemophilia A Hemophillia A (HA) bệnh di truyền lặn Việt Nam có nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhiễm sắc thể giới t ính X gây nên nhân chẩn đốn quản lí tăng lên thiếu hụt yếu tố đơng máu FV III Gen bệnh đáng kể, nhiên chiếm chưa tới 30%, nằm nhiễm sắc t hể X k hơng có alen tương ứng nhiễm sắc thể Y, vậy, đa số người mang gen chưa chẩn đốn quản lí [4] Chẩn đốn xác người mẹ mang gen bệnh truyền bệnh điều trị sớm bệnh có ý nghĩa quan cho 50% trai truyền gen bệnh cho 50% trọng nhằm hạn chế tối ña t ình trạng chảy gái họ [ 1; 2] Bệnh di truy ền máu giảm thiểu khả bệnh qua nhiều hệ có nhiều người mắc bệnh nhân trở thành tàn tật gia đình Tại Việt Nam ước Xác định đột biến gen mã hố yếu tố tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia FVIII (F8) ñã ñược nghiên cứu phổ biến khoảng 30.000 người mang gen bệnh Cho ñến nay, khoảng 1000 ñột biến hemophilia A [3] Mặc dù thời gian qua, gen F8 báo cáo Có nhiều loại ñột biến khác ñã ñược phát gen F8 ðịa liên hệ: Tạ Thành Văn, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 10/8/2015 Ngày ñược chấp thuận: 9/9/2015 14 bao gồm: ñột biến ñiểm, ñột biến xố đoạn, đột biến đảo đoạn…[ 5] Xác định đột biến gen, phát người lành mang gen bệnh tư vấn di t ruyền giải pháp hiệu giúp TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ngăn ngừa làm giảm tỉ lệ mắc bệnh Người - Xác định tình trạng mang gen phụ nữ có nguy cao mang gen bệnh thành viên nữ gia đình bệnh nhân người có trai bị bệnh hemophilia A kỹ thuật microsatellite - DNA gái người mẹ mang gen bệnh; chị em dì với người bị bệnh hemophilia A [6] Việc phát người lành mang gen bệnh thường ñược thực * Tách chi(t DNA kỹ thuật phát ñột biến trực tiếp t rên gen + DNA ñược tách chiết theo phương pháp F8 dựa vào ñột biến ñiểm bệnh nhân phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi [7; 8] Tuy nhiên, số trường hợp bệnh nhân người nhà bệnh nhân (mẹ, không phát thấy ñột biến việc phát ñột biến gặp khó k hăn cấu trúc gen dì, chị gái) + Kiểm tra ñộ tinh DNA ñược lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp tách chiết: phương pháp ño quang, dựa áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0 (Linkage analysis) [9 - 14] V ì vậy, nghiên cứu tiến với mục tiêu: Phát triển kỹ thuật microsatellite - DNA phát người lành mang gen bệnh cho thành viên nữ gia đình bệnh nhân Hemophilia A II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ðối tượng gia đình bệnh nhân HA bao gồm bệnh nhân nam thành viên nữ gia đình lựa chọn vào nghiên cứu * Xác ñHnh ñ7t bi(n gen F8 - Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến ñiểm Sử dụng 35 cặp mồi ñược thiết kế bao phủ toàn chiều dài gen F8, 26 exon c gen F8 ñược khuếch ñại kỹ thuật PCR tiến hành giải trình tự theo chiều [5] - K< thu=t microsatellite - DNA Sử dụng cặp mồi FXS 9897 DXS 1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể Các mẫu máu ñược thu thập Viện khuyếch đại vùng trình tự lặp lại S TR [9; Huyết học - Truyền máu Trung ương Trung 11] Thành phần phản ứng PCR: 1X ñệm tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường ðại PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xi ngược; học Y Hà Nội Phương pháp 2.1 Thi(t k( nghiên c/u mô t3 c4t ngang 2.2 N7i dung nghiên c/u - Xây dựng phả hệ gia đình bệnh nhân Hemophilia A - Xác định tình trạng mang gen 2015 2.3 Các k< thu=t s? d@ng nghiên c/u 0,5 unit Taq polymerase; 20ng DNA H2O, tổng thể tích 20µl Chu kỳ nhiệt phản ứng P CR: 940 C/30 giây; [940 C/ 12 giây, 620 C/30 giây, 720 C/30 giây] x 35 chu kỳ; 720 C/5 phút Sản phẩm k huếch ñại P CR ñược ñiện di hệ thống sequencing hãng Beckman coulter Kết phân tích phần mềm GeneMapper v3.2 soft ware ðạo ñức nghiên cứu thành viên nữ gia đình bệnh nhân dựa Bệnh nhân người nhà hoàn t oàn tự vào dạng ñột biến c hỉ ñiểm ñã phát ñược nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân bệnh nhân hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu TCNCYH 96 (4) - 2015 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC khơng đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên giúp cho c ác bác sỹ tư vấn di truy ền lựa cứu Bệnh nhân người nhà bệnh nhân chọn phác ñồ ñiều t rị phù hợ p Các thơng tin thơng báo kết xét nghiệm gen ñể cá nhân ñược ñảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Kết phát người lành mang gen kỹ thuật giải trình tự gen Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA23: Phả hệ gia đình bệnh nhân mã số HA23 c ó trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã số HA23), tiền sử bệnh gia đình khơng rõ ràng, bà ngoại, mẹ, bác chị họ bệnh nhân người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợp tử Kết phát người lành mang gen kỹ thuật microsatellite-DNA Sử dụng cặp mồi FXS 9897 DXS1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể khuyếc h đại vùng trình tự lặp lại S TR K ết cho thấy ñã phát ñược alen trạng thái ñồng hợ p tử sử dụng cặp mồi FXS 9897, cặp mồi DXS 1108 trạng thái dị hợp tử 16 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Hình ảnh giải trình tự gen gia đình mã số HA23 Hình ảnh giải t rình tự exon 23 gen F8 người mẹ (II3), bác gái (II1), chị gái họ (III2 ) bệnh nhân HA 33 xuất ñỉnh chồng lên t ại vị t rí đột biến phát bệnh nhân HA33 (III3) (c.6425T > A), chứng tỏ mẹ chị gái họ bệnh nhân mang gen F8 ñột biến trạng thái dị hợp tử 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Alen bình thường Alen đột biến Hình Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108 gia đình mã số HA23 Kết t rên cho thấy vùng t rình tự lặp lại DXS1108, mẹ, bác gái chị gái họ bệnh nhân xuất ñỉnh, ñỉnh tương ứng với alen Ở ñỉnh trùng với ñỉnh bệnh nhân đỉnh alen đột biến Xb, tức bệnh nhân nhận alen ñột biến từ người mẹ Bác gái chị gái họ bệnh nhân có đỉnh trùng với đỉnh alen đột biến Xb chứng tỏ bác gái chị gái họ bệnh nhân người lành mang gen bệnh Kết trùng khớp với kết xác ñịnh người lành mang gen bệnh kỹ thuật giải trình tự gen tức mẹ bệnh nhân, bác gái chị gái họ bệnh nhân người lành mang gen bệnh Tương tự vậy, sử dụng kỹ thuật giải t rình tự gen microsat ellite - DNA để xác định tình trạng mang gen gia đình HA lại, kết cho thấy người mẹ bệnh nhân thành viên gia ñình (em gái bệnh nhân) c ũng người lành mang gen bệnh Trong mẹ thành viên gia đình HA lại khơng phải người lành mang gen bệnh (bảng 1) 18 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Kết phát người lành mang gen yếu tố VIII ñột biến TT Exon Dạng ñột biến Mẹ bệnh nhân Thành viên gia đình bệnh nhân 23 c.6425T > A p.Leu2142Stop Mang gen bệnh Bác gái chị họ mang gen bệnh 23 c.6545G > A p.Arg2182His Mang gen bệnh Em gái mang gen bệnh 3 c 549 A > T p.Lys126Asp Mang gen bệnh 13 c.2196insA; p.674 Y → Stop Không mang gen bệnh Không mang gen bệnh 13 c.2186delTCT p.Phe672del Không mang gen bệnh Không mang gen bệnh IV BÀN LUẬN 2015 người mẹ (denovo mut ation) [7] ðiều có Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên kết thể giải thíc h cho người mẹ bệnh nhân với nhiễm sắc thể giới tính X khơng có alen người lành mang gen bệnh tương ứng nhiễm sắc thể Y Nhiều nghiên nghiên cứu họ cứu ñã tiến hành xác ñịnh ñột biến gen F8 bệnh nhân Hemophilia A cho ñến ñược phát có đột biến gen F8 Ba người mẹ gia đình thành viên nữ khoảng 1000 ñột biến gen F8 ñã gia đình lại xác định người báo cáo Có nhiều loại đột biến khác lành mang gen bệnh kỹ thuật giải ñã ñược phát gen F8 bao gồm: trình tự gen trực tiếp microsatellite - DNA ñột biến ñiểm, đột biến xố đoạn, đột biến đảo Thơng thường, việc phát người lành ñoạn…[5] Kết xác ñịnh ñột biến gen F8 mang gen bệnh thường ñược thực bệnh nhân sở khoa học cho kỹ thuật phát ñột biến trực tiếp t rên gen phân tích phát đột biến gen F8 dựa vào ñột biến ñiểm bệnh nhân thành viên gia đình bệnh nhân phát Tuy nhiên, số trường hợp không người lành mang gen bệnh, chẩn đốn phát thấy ñột biến việc phát ñột trước sinh ñể ñưa tư vấn di truyền biến gặp khó khăn cấu trúc gen lớn, kỹ giải pháp hiệu giúp ngăn ngừa thuật phân t ích gián tiếp c ó thể áp dụng làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [7; 8] Trong số dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage bà mẹ ñược xác ñịnh người lành mang gen analysis) [7; 8] bệnh, khoảng 2/3 ñược phát người lành mang gen bệnh trạng thái dị hợ p tử, Trong nghiên cứu này, phát triển kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định tình lại 1/3 trường hợp người mẹ không trạng mang gen bệnh thành viên nữ mang gen bệnh, ñột biến xuất người gia đình bệnh nhân Hemophilia A dựa trai bị bệnh ñột biến phát sinh vào phân tíc h vùng trình tự lặp lại (short trình tạo giao tử từ người bố từ tandem repeat - S TR), so sánh với kết TCNCYH 96 (4) - 2015 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phát đột biến trực tiếp kỹ thuật giải trùng khớ p với kết xác định người lành trình tự gen Trình tự lặp lại ñoạn lặp mang gen bệnh kỹ thuật giải t rình tự nối tiếp ngắn từ ñến cặp base, nằm gen ñoạn intron, có t ính đa hình cao phân bố khắp gen Các trình tự nhỏ 1000 bas e tạo nên c ác trình tự lõi V KẾT LUẬN khoảng ñến base lặp lại nhiều lần (từ 10 ðã hoàn thiện quy trình xác định người lành mang gen bệnh thành viên nữ đến 60 lần) Do k ích thước nhỏ nên trình gia đình bệnh nhân Hemophilia A tự gọi trình tự lặp lại ngắn - kỹ thuật Microsatellite - DNA STR s ố lần lặp lại c t rình tự nhỏ Lời cám ơn đặc trư ng c ho từ ng c thể mang t ính di truy ền Trình tự lặp lại ngắn ứng Nghiên cứu ñược thực với hỗ trợ dụng chẩn đốn xác định huy ết thống, xác kinh phí ðề tài cấp nhà nước “Xây dựng định người mang gen chẩn đốn trước quy trình chẩn ñoán trước làm tổ kỹ sinh…[ - 14] Trong nghiên cứu này, thuật microsatellte DNA ñể sàng lọc số cặp mồi sử dụng khuếc h ñại trình tự lặp lại bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới gen F8, nhằm xác ñịnh alen mang đột tính” thuộc thuộc chương trình K C04 17/11- biến Xb alen khơng mang gen đột biến X 15 Với kết phân tíc h trình tự lặp lại ngắn, người mẹ thành viên nữ gia đình khác có đỉnh tương ứ ng vớ i alen TÀI LIỆU THAM KHẢO họ có nhiễm sắc thể X, bệnh nhân nam Gill Swallow (2013) Guideline for the Obstetric Management of Carriers of nhận nhiễm sắc thể Y từ bố nhiễm Haemophilia A sắc thể X từ mẹ, nên có trình tự lặp University Hospitals Cookie Disclaime lại giống mẹ gen F8 có nhiễm sắc thể X; t rên hình ảnh điện di cho ñỉnh tương ứng với trình tự lặp lại ngắn nhiễm sắc thể X nhận từ mẹ ðỉnh alen ñột biến s ẽ ñược xác ñịnh dựa ñỉnh alen c bệnh nhân Trong t rường hợp thành viên gia đình bệnh nhân có đỉnh b trùng với đỉnh c alen ñột biến X chứng tỏ họ người lành mang gen bệnh ngược lại không trùng với ñỉnh alen ñột biến and B, NHS Nottingham Trần Thị Liên, Trần Thị Thanh Hương (2014) Di truyền ñơn gen, Di truyền y học, Nhà xuất giáo dục, 146 - 149 Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Mai (2009) Quản lí, chẩn đốn điều trị hemophilia Việt Nam: Quá khứ - Hiện – Tươ ng lai, Y học Việt Nam, 2, - 12 Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Nữ cộng (2012) Nghiên chứng tỏ họ người lành mang gen bệnh Nghiên cứu c ho t hấy cứu phát Hemophilia dựa vào phả hệ gia thành viên nữ gia đình bệnh nhân viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, Hemophilia A (mẹ, bác họ, c hị họ em Báo cáo Hội nghị nghiên cứu sinh Trường ñại gái) ñã ñược phát người lành mang học Y Hà Nội lần thứ XVIII, 156 - 162 đình bệnh nhân chẩn đốn gen bệnh dựa phân t ích kết trình tự Azza A.G Tantawy (2010) Molecular lặp lại ngắn K ết hoàn t oàn genetics of hemophilia A: Clinical perspec- 20 TCNCYH 96 (4) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tives The Egyptian Journal of Medical Human genetic counselling in Chinese haemophilia Genetics, 11, 105 - 114 A pedigrees Haemophilia, 18(4), 621 - 625 Street AM, Ljung R, Lavery SA (2008) Management of carriers and babies with hae- (2011) A set of five microsat ellite markers mophilia Haemophilia, 14(3), 181 - 187 Goodeve A C (1998) Advances in carrier detection in haemophilia Haemophilia, (4), 358 - 364 Shetty S, Ghosh K, Bhide A, Mohanty D (2001) Carrier detection and prenatal ldiagnosis in families with hemophilia Natl Med J India, 14, 81 - 83 linked to F8 gene can detect haemophilia A carriers across India Haemophilia, 17(5), 928-935 12 Massaro JD, Wiezel CE, Muniz YC et al (2011) A nalysis of five polymorphic DNA markers for indirect genetic diagnosis of haemophilia A in the B razilian population Haemophilia, 17(5), 936 - 943 13 Hussein IR, El-Be shlawy A, Salem A, Machado FB, Medina - Acosta E (2009) 11 Saha A, Nayak S, Mani KR et al High-resolution combined linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection Haemophilia, 15(1), 297 - 308 et al (2008).The use of DNA markers for carrier detection of haemophilia and prenatal A in diagnosis Egy ptian fami- lies.Haemophilia, 14(5), 1082 - 1087 14 de Carvalho FM, de Vargas Wolfgramm E et al (2007) A nalysis of Factor Characterisation and validation of a novel VIII polymorphic mark ers as a means for carrier detection in Brazilian families with panel of the six short tandem repeats for haemophilia A Haemophilia, 13(4), 409 - 412 10 Ding QL, Lu YL, Dai J et al (2012) Summary DETECTION OF HEMOPHILIA A CARRIER USING MICROSATELLITE DNA Hemophilia A is an inherited X - linked coagulation disorder caused by factor VIII (FV III) deficiency Genetic mutations in the gene encoding FV III (F8) have been extensively studied Over a thousand different mutations have been reported in the F8 gene Carrier detection and genetic counseling are effective solutions to prevent and reduc e the incidence of disease Carrier are preferably performed by direct mutation det ection; however, in certain situations, indirect family studies may also be useful in c ases of undetectable mutation due to F8 gene large structure We aimed to utilize a combination of direct and indirect techniques for the diagnosis of carrier of Hemophilia A Linkage analysis is a common indirect method for the detection of female carriers in families wit h Hemophilia A In t his study, we compared results obtained from link age using short tandem repeat-S TRs linkage (microsatellite - DNA) with those by sequencing analysis 10 hemophilia A families including patients and female members were recruited for this study By sequencing analysis, five Hemophilia A patients and their family members (mother, aunt, cousins and sister) showed small point mutation including missense mutation and insertion in F8 gene while Micros atellite-DNA revealed the transmission of a mut ant allele inside each family In 2015 TCNCYH 96 (4) - 2015 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC conclusions, the combination of direct and indirect molecular genetics approaches is a successful method and mic rosatellite - DNA is a c ost-effective approach to provide carrier diagnostics of hemophilia A in Vietnam Keywords: Hemophilia, carriers, microsatellite - DNA 22 TCNCYH 96 (4) - 2015 ... ng a làm giảm tỉ lệ mắc bệnh Người - Xác định tình trạng mang gen phụ nữ có nguy cao mang gen bệnh thành viên nữ gia đình bệnh nhân người có trai bị bệnh hemophilia A kỹ thuật microsatellite - DNA. .. đình bệnh nhân 23 c.6425T > A p.Leu2142Stop Mang gen bệnh Bác gái chị họ mang gen bệnh 23 c.6545G > A p.Arg2182His Mang gen bệnh Em gái mang gen bệnh 3 c 549 A > T p.Lys126Asp Mang gen bệnh 13... DNA gái người mẹ mang gen bệnh; chị em dì với người bị bệnh hemophilia A [6] Việc phát người lành mang gen bệnh thường ñược thực * Tách chi(t DNA kỹ thuật phát ñột biến trực tiếp t rên gen + DNA