Bài viết xây dựng kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia đình bệnh nhân HA dựa vào phân tích các vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết quả phát hiện đột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải trình tự gen.5 gia đình bệnh nhân HA bao gồm bệnh nhân và các thành viên nữ trong gia đình đã được lựa chọn vào nghiên cứu. Kết quả cho thấy, 6 thành viên nữ của 3 gia đình bệnh nhân HA (mẹ, bác họ, chị họ hoặc em gái) đã được phát hiện là người lành mang gen bệnh. Microsatellite - DNA có thể được sử dụng như một kỹ thuật hiệu quả để phát hiện người lành mang gen bệnh HA ở Việt Nam.
Trang 1XÂY DỰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE - DNA PHÁT HIỆN
NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
Trần Vân Khánh, Trần Quốc ðạt, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn
Trường ðại học Y Hà Nội Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do thiếu hụt yếu tố đơng
máu FVIII Xác định đột biến trên gen mã hố yếu tố FVIII (F8) đã được nghiên cứu khá phổ biến Cho đến
nay, khoảng hơn 1000 đột biến trên gen F8 đã được b áo cáo Xác định đột biến gen, phát hiện người lành
mang gen bệnh và tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh
Việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường được thực hiện bằng kỹ thuật phát hiện đột biến trực tiếp
trên gen F8 dựa vào đột biến chỉ điểm của bệnh nhân Tuy nhiên, trong một số trường hợp khơng phát hiện
thấy đột biến hoặc việc phát hiện đột biến gặp khĩ khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp cĩ
thể được áp dụng dựa vào xác định alen đột biến (Linkage analysis) Trong nghiên cứu này, chúng tơi xây
dựng kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định tình trạng mang gen bệnh của các thành viên nữ trong gia
đình bệnh nhân HA dựa vào phân tích các vùng trình tự lặp lại (short tandem repeat - STR), so sánh với kết
quả phát hiện đột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải trình tự gen.5 gia đình bệnh nhân HA bao gồm bệnh nhân
và các thành viên nữ trong gia đình đã được lựa chọn vào nghiên cứu Kết quả cho thấy, 6 thành viên nữ
của 3 gia đình bệnh nhân HA (mẹ, bác họ, chị họ hoặc em gái) đã được phát hiện là người lành mang gen
bệnh Microsatellite - DNA cĩ thể được sử dụng như một kỹ thuật hiệu quả để phát hiện người lành mang
gen bệnh HA ở Việt Nam
Từ khĩa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh, microsatellite - DNA
ðịa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, Trung tâm Nghiên cứu
Gen - Protein, Trường ðại học Y Hà Nội
Email: tathanhvan@hmu.edu.vn
Ngày nhận: 10/8/2015
Ngày được chấp thuận: 9/9/2015
I ðẶT VẤN ðỀ
Hemophillia A (HA) là bệnh di truyền lặn
trên nhiễm sắc thể giới tính X gây nên do
thiếu hụt yếu tố đơng máu FVIII Gen bệnh
nằm trên nhiễm sắc thể X k hơng cĩ alen
tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do vậy,
người mẹ mang gen bệnh cĩ thể truyền bệnh
cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50%
con gái của họ [1; 2] Bệnh cĩ thể di truy ền
qua nhiều thế hệ và cĩ nhiều người mắc bệnh
trong cùng một gia đình Tại Việt Nam ước
tính cĩ khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia
và khoảng 30.000 người mang gen bệnh
hemophilia A [3] Mặc dù trong thời gian qua,
cơng tác chăm sĩc bệnh nhân hemophilia A tại Việt Nam đã cĩ nhiều tiến bộ, số lượng bệnh nhân được chẩn đốn và quản lí đã tăng lên đáng kể, tuy nhiên mới chỉ chiếm chưa tới 30%, cịn đa số người mang gen chưa được chẩn đốn và quản lí [4] Chẩn đốn chính xác và điều trị sớm căn bệnh này cĩ ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh nhân trở thành tàn tật
Xác định đột biến trên gen mã hố yếu tố FVIII (F8) đã được nghiên cứu khá phổ biến
Cho đến nay, khoảng hơn 1000 đột biến trên gen F8 đã được báo cáo Cĩ nhiều loại đột biến khác nhau đã được phát hiện trên gen F8 bao gồm: đột biến điểm, đột biến xố đoạn, đột biến đảo đoạn…[5] Xác định đột biến gen, phát hiện người lành mang gen bệnh và tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp
Trang 2ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh Người phụ nữ có nguy cơ cao mang gen bệnh nếu người ñó có con trai bị bệnh hemophilia A hoặc là con gái của người mẹ mang gen bệnh; hoặc chị em con dì với người bị bệnh hemophilia A [6] Việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường ñược thực hiện bằng
kỹ thuật phát hiện ñột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào ñột biến chỉ ñiểm của bệnh nhân [7; 8] Tuy nhiên, trong một số trường hợp không phát hiện thấy ñột biến hoặc việc phát hiện ñột biến gặp khó k hăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp có thể ñược
áp dụng dựa vào xác ñịnh alen ñột biến (Linkage analysis) [9 - 14] Vì vậy, nghiên cứu
này ñược tiến với mục tiêu: Phát triển kỹ thuật
microsatellite - DNA phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân Hemophilia A
II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1 ðối tượng
5 gia ñình bệnh nhân HA bao gồm 5 bệnh nhân nam và các thành viên nữ trong gia ñình
ñã ñược lựa chọn vào nghiên cứu
Các mẫu máu ñược thu thập tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường ðại học Y Hà Nội
2 Phương pháp
2.1 Thi(t k( nghiên c/u mô t3 c4t ngang
2.2 N7i dung nghiên c/u
- Xây dựng phả hệ gia ñình bệnh nhân
He Xác ñịnh tình trạng mang gen của các thành viên nữ trong gia ñình bệnh nhân bằng
kỹ thuật microsatellite - DNA
2.3 Các k< thu=t s? d@ng trong nghiên c/u
* Tách chi(t DNA
+ DNA ñược tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân (mẹ,
dì, chị gái)
+ Kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA ñược tách chiết: bằng phương pháp ño quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0
* Xác ñHnh ñ7t bi(n gen F8
- Kỹ thuật giải trình tự gen xác ñịnh ñột biến ñiểm
Sử dụng 35 cặp mồi ñược thiết kế bao phủ toàn bộ chiều dài gen F8, 26 exon c ủa gen F8 ñược khuếch ñại bằng kỹ thuật PCR và tiến hành giải trình tự theo 2 chiều [5]
- K< thu=t microsatellite - DNA
Sử dụng các cặp mồi FXS 9897 và DXS
1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể khuyếch ñại các vùng trình tự lặp lại STR [9; 11] Thành phần của phản ứng PCR: 1X ñệm PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;
0,5 unit Taq polymerase; 20ng DNA và H2O, tổng thể tích 20µl Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR:
940 C/30 giây; [940 C/12 giây, 620 C/30 giây,
720 C/30 giây] x 35 chu kỳ; 720 C/5 phút Sản phẩm k huếch ñại PCR ñược ñiện di trên hệ thống sequencing của hãng Beckman coulter Kết quả ñược phân tích bằng phần mềm GeneMapper v3.2 software
Trang 3không ñồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên
cứu Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ
ñược thông báo về kết quả xét nghiệm gen ñể
III KẾT QUẢ
1 Kết quả phát hiện người lành mang gen bằng kỹ thuật giải trình tự gen
Phả hệ gia ñình bệnh nhân mã số HA23:
giúp cho c ác bác sỹ tư vấn di truy ền hoặc lựa chọn phác ñồ ñiều trị phù hợ p Các thông tin
cá nhân sẽ ñược ñảm bảo bí mật
Phả hệ gia ñình bệnh nhân mã số HA23 c ó một con trai bị bệnh hemophilia A (bệnh nhân mã
số HA23), tiền sử bệnh gia ñình không rõ ràng, vì vậy bà ngoại, mẹ, bác và các chị họ bệnh nhân
có thể là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử
2 Kết quả phát hiện người lành mang gen bằng kỹ thuật microsatellite-DNA
Sử dụng các cặp mồi FXS9897 và DXS1108 ñã ñược ñánh dấu huỳnh quang ñể khuyếc h ñại
các vùng trình tự lặp lại STR Kết quả cho thấy ñã phát hiện ñược alen ở trạng thái ñồng hợ p tử
khi sử dụng cặp mồi FXS 9897, trong khi ñó cặp mồi DXS 1108 ở trạng thái dị hợp tử
Trang 4Hình 1 Hình ảnh giải trình tự gen của gia ñình mã số HA23
Hình ảnh giải trình tự exon 23 gen F8 của người mẹ (II3), bác gái (II1), và chị gái họ (III2) của bệnh nhân HA33 xuất hiện 2 ñỉnh chồng lên tại vị trí ñột biến ñã phát hiện ñược ở bệnh nhân HA33 (III3) (c.6425T > A), chứng tỏ mẹ và chị gái họ bệnh nhân mang gen F8 ñột biến ở trạng thái dị hợp tử
Trang 5Hình 2 Hình ảnh ñiện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS 1108
của gia ñình mã số HA23
Kết quả trên cho thấy ở vùng trình tự lặp lại DXS1108, mẹ, bác gái và chị gái họ của bệnh
nhân xuất hiện 2 ñỉnh, mỗi ñỉnh tương ứng với 1 alen Ở ñỉnh trùng với ñỉnh của bệnh nhân chính
là ñỉnh của alen ñột biến Xb, tức là bệnh nhân sẽ nhận alen ñột biến này từ người mẹ Bác gái và
chị gái họ bệnh nhân có 1 ñỉnh trùng với ñỉnh của alen ñột biến Xb chứng tỏ bác gái và chị gái họ
của bệnh nhân là người lành mang gen bệnh Kết quả này cũng trùng khớp với kết quả xác ñịnh
người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen tức là cả mẹ bệnh nhân, bác gái và chị
gái họ bệnh nhân là người lành mang gen bệnh
Tương tự như vậy, khi sử dụng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và microsatellite - DNA ñể xác
ñịnh tình trạng mang gen trên 4 gia ñình HA còn lại, kết quả cho thấy 2 người mẹ bệnh nhân và 1
thành viên gia ñình (em gái bệnh nhân) c ũng là người lành mang gen bệnh Trong khi ñó mẹ và
các thành viên của 2 gia ñình HA còn lại không phải là người lành mang gen bệnh (bảng 1)
Alen ñột biến Alen bình thường
Trang 6Bảng 1 Kết quả phát hiện người lành mang gen yếu tố VIII đột biến
1 23 p.Leu2142Stop c.6425T > A Mang gen bệnh Bác gái và chị họ mang gen bệnh
2 23 p.Arg2182His c.6545G > A Mang gen bệnh Em gái mang gen bệnh
3 3 c 549 A > T
4 13 c.2196insA;
p.674 Y → Stop Khơng mang gen bệnh Khơng mang gen bệnh
5 13 c.2186delTCT
p.Phe672del Khơng mang gen bệnh Khơng mang gen bệnh
IV BÀN LUẬN
Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X và khơng cĩ alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y Nhiều nghiên cứu đã tiến hành xác định đột biến gen F8 trên bệnh nhân Hemophilia A và cho đến nay khoảng hơn 1000 đột biến trên gen F8 đã được báo cáo Cĩ nhiều loại đột biến khác nhau đã được phát hiện trên gen F8 bao gồm:
đột biến điểm, đột biến xố đoạn, đột biến đảo đoạn…[5] Kết quả xác định đột biến gen F8 trên bệnh nhân là cơ sở khoa học cho những phân tích phát hiện đột biến gen đối với các thành viên trong gia đình bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh, chẩn đốn trước sinh để đưa ra những tư vấn di truyền là giải pháp hiệu quả nhất giúp ngăn ngừa và làm giảm tỉ lệ mắc bệnh [7; 8] Trong số các
bà mẹ được xác định người lành mang gen bệnh, khoảng 2/3 được phát hiện là người lành mang gen bệnh ở trạng thái dị hợ p tử,
người mẹ (denovo mutation) [7] ðiều này cĩ
thể giải thíc h cho 2 người mẹ bệnh nhân khơng phải là người lành mang gen bệnh ở trong nghiên cứu này mặc dù con của họ được phát hiện là cĩ đột biến trên gen F8 Ba người mẹ của 3 gia đình và các thành viên nữ của 3 gia đình cịn lại được xác định là người lành mang gen bệnh bằng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp và microsatellite - DNA Thơng thường, việc phát hiện người lành mang gen bệnh thường được thực hiện bằng
kỹ thuật phát hiện đột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào đột biến chỉ điểm của bệnh nhân Tuy nhiên, trong một số trường hợp khơng phát hiện thấy đột biến hoặc việc phát hiện đột biến gặp khĩ khăn do cấu trúc gen lớn, kỹ thuật phân tích gián tiếp c ĩ thể được áp dụng dựa vào xác định alen đột biến (Linkage analysis) [7; 8]
Trong nghiên cứu này, chúng tơi phát triển
kỹ thuật microsatellite - DNA để xác định tình
Trang 7phát hiện ựột biến trực tiếp bằng kỹ thuật giải
trình tự gen Trình tự lặp lại là các ựoạn lặp
nối tiếp ngắn từ 2 ựến 6 cặp base, nằm ở các
ựoạn intron, có tắnh ựa hình rất cao và ựược
phân bố khắp trong bộ gen Các trình tự nhỏ
dưới 1000 bas e tạo nên bởi c ác trình tự lõi
khoảng 2 ựến 4 base lặp lại nhiều lần (từ 10
ựến 60 lần) Do k ắch thước nhỏ nên các trình
tự này ựược gọi là các trình tự lặp lại ngắn -
STR và s ố lần lặp lại c ủa các trình tự nhỏ
này ựặc trưng c ho từng c á thể và mang tắnh
di truy ền Trình tự lặp lại ngắn ựược ứng
dụng chẩn ựoán xác ựịnh huy ết thống, xác
ựịnh người mang gen và chẩn ựoán trước
sinhẦ[9 - 14] Trong nghiên cứu này, các
cặp mồi sử dụng khuếc h ựại trình tự lặp lại
trên gen F8, nhằm xác ựịnh alen mang ựột
biến Xb và alen không mang gen ựột biến X
Với kết quả phân tắc h trình tự lặp lại ngắn,
người mẹ hoặc các thành viên nữ trong gia
ựình khác sẽ có 2 ựỉnh tương ứng vớ i 2 alen
do họ có 2 nhiễm sắc thể X, bệnh nhân nam
nhận nhiễm sắc thể Y từ bố và một nhiễm
sắc thể X từ mẹ, nên sẽ chỉ có 1 trình tự lặp
lại giống của mẹ vì gen F8 chỉ có trên nhiễm
sắc thể X; trên hình ảnh ựiện di sẽ cho một
ựỉnh duy nhất tương ứng với trình tự lặp lại
ngắn trên nhiễm sắc thể X nhận từ mẹ đỉnh
của alen ựột biến s ẽ ựược xác ựịnh dựa trên
ựỉnh alen c ủa bệnh nhân Trong trường hợp
các thành viên gia ựình bệnh nhân có 1 ựỉnh
trùng với ựỉnh c ủa alen ựột biến Xb chứng tỏ
họ là người lành mang gen bệnh và ngược
lại không trùng với ựỉnh của alen ựột biến
chứng tỏ họ không phải là người lành mang
gen bệnh Nghiên cứu của chúng tôi c ho thấy
6 thành viên nữ của 3 gia ựình bệnh nhân
Hemophilia A (mẹ, bác họ, c hị họ hoặc em
gái) ựã ựược phát hiện là người lành mang
gen bệnh dựa trên phân tắch kết quả trình tự
lặp lại ngắn Kết quả này cũng hoàn toàn
trùng khớ p với kết quả xác ựịnh người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen
V KẾT LUẬN
đã hoàn thiện quy trình xác ựịnh người lành mang gen bệnh ở các thành viên nữ trong gia ựình bệnh nhân Hemophilia A bằng
kỹ thuật Microsatellite - DNA
Lời cám ơn
Nghiên cứu ựược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phắ bởi đề tài cấp nhà nước ỘXây dựng quy trình chẩn ựoán trước làm tổ bằng kỹ thuật microsatellte DNA ựể sàng lọc một số bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tắnhỢ thuộc thuộc chương trình
KC04.17/11-15
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Gill Swallow (2013) Guideline for the
Obstetric Management of Carriers of Haemophilia A and B, NHS Nottingham University Hospitals Cookie Disclaime
2 Trần Thị Liên, Trần Thị Thanh Hương (2014) Di truyền ựơn gen, Di truyền y học,
Nhà xuất bản giáo dục, 146 - 149
3 Nguyễn Anh Trắ, Nguyễn Thị Mai (2009) Quản lắ, chẩn ựoán và ựiều trị
hemo-philia ở Việt Nam: Quá khứ - Hiện tại Ờ Tươ ng
lai, Y học Việt Nam, 2, 3 - 12
4 Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trắ, Nguyễn Thị Nữ và cộng sự (2012) Nghiên
cứu phát hiện Hemophilia dựa vào phả hệ gia ựình các bệnh nhân ựã ựược chẩn ựoán tại viện Huyết học Ờ Truyền máu Trung ương,
Báo cáo Hội nghị nghiên cứu sinh Trường ựại học Y Hà Nội lần thứ XVIII, 156 - 162
5 Azza A.G Tantawy (2010) Molecular
genetics of hemophilia A: Clinical
Trang 8perspec-tives The Egyptian Journal of Medical Human
Genetics, 11, 105 - 114
6 Street AM, Ljung R, Lavery SA (2008)
Management of carriers and babies with
hae-mophilia Haemophilia, 14(3), 181 - 187
7 Goodeve A.C (1998) Advances in
car-rier detection in haemophilia Haemophilia, 4
(4), 358 - 364
8 Shetty S, Ghosh K, Bhide A, Mohanty
D (2001) Carrier detection and prenatal
ldiag-nosis in families with hemophilia Natl Med J
India, 14, 81 - 83
9 Machado FB, Medina - Acosta E (2009) High-resolution combined linkage
physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection
Haemophilia, 15(1), 297 - 308
10 Ding QL, Lu YL, Dai J et al (2012)
Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for
genetic counselling in Chinese haemophilia
A pedigrees Haemophilia, 18(4), 621 - 625
11 Saha A, Nayak S, Mani KR et al (2011) A set of five microsatellite markers
linked to F8 gene can detect haemophilia
A carriers across India Haemophilia, 17(5),
928-935
12 Massaro JD, Wiezel CE, Muniz YC et
al (2011) Analysis of five polymorphic DNA
markers for indirect genetic diagnosis of
hae-mophilia A in the Brazilian population
Haemophilia, 17(5), 936 - 943
13 Hussein IR, El-Be shlawy A, Salem A,
et al (2008).The use of DNA markers for
car-rier detection and prenatal diagnosis
of haemophilia A in Egy ptian
fami-lies.Haemophilia, 14(5), 1082 - 1087
14 de Carvalho FM, de Vargas Wolfgramm E et al (2007) Analysis of Factor
VIII polymorphic mark ers as a means for carrier detection in Brazilian families with
haemophilia A Haemophilia, 13(4), 409 - 412
Summary DETECTION OF HEMOPHILIA A CARRIER USING MICROSATELLITE DNA
Hemophilia A is an inherited X - linked coagulation disorder caused by factor VIII (FVIII) deficiency Genetic mutations in the gene encoding FVIII (F8) have been extensively studied Over a thousand different mutations have been reported in the F8 gene Carrier detection and genetic counseling are effective solutions to prevent and reduc e the incidence of disease Carrier are preferably performed by direct mutation detection; however, in certain situations, indirect family studies may also be useful in c ases of undetectable mutation due to F8 gene large structure We aimed to utilize a combination of direct and indirect techniques for the diagnosis of carrier of Hemophilia A Linkage analysis is a common indirect method for the detection of female carriers in families with Hemophilia A In this study, we compared results obtained from link age
Trang 9conclusions, the combination of direct and indirect molecular genetics approaches is a successful
method and mic rosatellite - DNA is a c ost-effective approach to provide carrier diagnostics of
hemophilia A in Vietnam
Keywords: Hemophilia, carriers, microsatellite - DNA