Bài viết Phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A trình bày Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định người lành mang gen bệnh để thực hiện tư vấn di truyền, góp phần ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh, tránh hậu quả nặng nề cho gia đình bệnh nhân và xã hội,.. Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A Bùi Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Viết Tiến2, Nguyễn Thị Hà1, Tạ Thành Văn1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương Hemophilia A bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính X Nghiên cứu thực nhằm xác định người lành mang gen bệnh để thực tư vấn di truyền, góp phần ngăn ngừa giảm tỷ lệ mắc bệnh, tránh hậu nặng nề cho gia đình bệnh nhân xã hội Trong nghiên cứu này, thành viên nữ gia đình bệnh nhân hemophillia A lựa chọn nghiên cứu; Sử dụng kỹ thuật Inversion PCR giải trình tự gen để xác định tình trang mang gen bệnh Kết phát 4/7 trường hợp người lành mang gen bệnh dạng dị hợp tử Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hemophilia (hay bệnh ưa chảy máu) bệnh nhân, chẩn đoán trước sinh bệnh di truyền thiếu hụt bất thai phụ có nguy cao giúp tư vấn hôn nhân thường chức yếu tố đông máu tư vấn di truyền, biện pháp để huyết tương: yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, ngăn ngừa giảm tỷ lệ sinh mắc bệnh, yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, yếu tố XI hạn chế tỷ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng gây bệnh hemophilia C Bệnh hemophilia A Ở Việt Nam, năm 2004 Lê Nhật Minh phổ biến nhất, chiếm khoảng 85%, bệnh hemophilia B chiếm 15 ÷ 20% trường hợp mắc bệnh hemophilia [1; 2] cộng nghiên cứu phát người lành mang gen bệnh gia đình có mắc bệnh hemophilia A, sử dụng kỹ thuât cắt en- Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên zym giới hạn (PCR - RFLP), tác giả phát quan đến giới tính, gen bệnh nằm nhiễm 44,44% người mẹ mang gen bệnh, sắc thể X Người mẹ mang gen bệnh có khả lại 50% khơng phát [4] truyền bệnh cho 50% trai họ, chủ yếu bệnh nhân nam Tần suất mắc bệnh hemophilia A 1/4.000 ÷ 1/5.000 trẻ trai Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A nước khác có tần suất chung khoảng 30 ÷ 100/1.000.000 dân [3] Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A như: đột biến đảo đoạn intron 1, đảo đoạn intron 2, đột biến điểm Để phát dạng đột biến gen cần phải sử dụng kỹ thuật khác cho dạng đột biến cụ thể Cho đến nay, Việt Nam Nghiên cứu phát người lành mang chưa có nghiên cứu phân tích trực gen bệnh (mẹ, chị em gái) gia đình tiếp tồn diện dạng đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A, đặc biệt phát Địa liên hệ: Tạ Thành Văn, trung tâm Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 17/4/2013 Ngày chấp thuận: 20/6/2013 TCNCYH 83 (3) - 2013 người lành mang gen bệnh Vì vậy, đề tài nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: Phát người lành mang gen F8 đột biến gây bệnh hemophilia A TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP có đột biến nucleotid kỹ thuật giải trình tự gen) Đối tượng Nghiên cứu thực Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y - Nhóm chứng: người nam bình thường khỏe mạnh Hà Nội - Nhóm nghiên cứu: thành viên nữ gia đình bệnh nhân hemophillia A Đột biến phát bệnh nhân đột biến điểm cho việc phát trạng thái xác định có đột biến gen F8 (bao gồm 01 bệnh mang gen bệnh người mẹ thành nhân thể nặng có đột biến đảo đoạn intron 22 phương pháp I-PCR, 03 bệnh nhân thể viên nữ gia đình trung bình nhẹ có đột biến điểm kỹ thuật giải trình tự gen, 01 bệnh nhân thể nặng Phương pháp 2.1 Mơ hình nghiên cứu 2.2 Tách chiết DNA Ủ 41 µl hỗn hợp nhiệt độ 160C qua đêm + DNA tách chiết theo phương pháp → Tinh sản phẩm thu cột GFXTM theo quy trình hãng Amersham → phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi bệnh nhân người nhà bệnh nhân (mẹ, dì, chị gái) + Kiểm tra độ tinh DNA tách chiết: phương pháp đo quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0 2.2.3 Xác định đột biến gen F8 Pha loãng sản phẩm thu (DNA đóng vòng) 20 µl H2O + Khuếch đại phản ứng multiplexPCR: Tổng thể tích 20 µl bao gồm: H2O 12,0 µl, buffer 10X µl, dNTPs 1,0 µl , DNA 3,0 µl, Extaq 0,5 µl, mồi: IU 0,5 µl, ID 0,5 µl , ED - Kỹ thuật I - PCR (Inversion - PCR) xác định đột biến đảo đoạn Rosetti cộng 0,5 µl Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex - PCR: năm 2005 [5] Quy trình gồm bước: + Cắt enzym BclI 940C/2 phút; [940C/12 giây, 600C/30 giây, 720C/7 phút] x 35 chu kỳ; 720C/5 phút Thành phần phản ứng: 1,5 µg DNA, H2O 25,5 µl, Buffer 10X 3µl, enzym BclI 1,5 µl - Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột (Promega) Ủ 370C/4 → Tinh biến điểm Sử dụng 38 cặp mồi thiết kế bao phủ phenol chloroform + Nối T4 ligate toàn chiều dài gen F8, 26 exon gen F8 khuếch đại kỹ thuật PCR tiến Thành phần phản ứng: 20 µl DNA, Buffer 10X 20µl, enzym T4 ligate 1,0 µl (Promega) hành giải trình tự theo chiều Do có kích thước lớn nhất, exon 14 thiết kế cặp TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC mồi exon 26 thiết kế cặp mồi để từ vị trí đột biến đến hết chiều dài phân tử khuếch đại toàn chiều dài exon protein F8 - Tiến hành giải trình tự gen F8 người III KẾT QUẢ Kết giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 01 - Bệnh nhân mã số chẩn đoán lâm sàng hemophilia A thể vừa Bằng kỹ thuật giải trình tự phát exon 14 bị đột biến C vị trí 2605 (del2605C), gây lệch khung dịch mã, làm thay đổi trình tự acid amin kể mẹ chị gái bệnh nhân vị trí xác định đột biến bệnh nhân exon 14 Kết cho thấy người mẹ xuất đỉnh chồng lên sau điểm đột biến, điều người mẹ trạng thái dị hợp tử (người lành mang gen bệnh); chị gái bệnh nhân cho thấy trình tự exon 14 hồn tồn giống với người bình thường, chị gái bệnh nhân người không mang gen bệnh (hình 1) Hình Hình ảnh giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số Kết giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 03 - Bệnh nhân mã số chẩn đoán lâm sàng hemophilia A thể nặng Bệnh nhân định đột biến điểm kỹ thuật giải trình tự gen, kết cho thấy bệnh nhân có đột biến nucleotid TCT exon 13 gây acid amin phenylalanine (vị trí codon 672) tiến hành xác định đột biến đảo đoạn theo quy - Người mẹ xác định tình trạng mang trình mơ tả phần phương pháp, kết gen bệnh vị trí đột biến điểm exon 13 kỹ thuật giải trình tự gen Kết cho cho thấy bệnh nhân khơng có đột biến đảo đoạn intron 22 - Bệnh nhân tiếp tục tiến hành xác TCNCYH 83 (3) - 2013 thấy khơng có hình ảnh nucleotid TCT exon 13 Như vậy, người mẹ khơng mang gen bệnh (hình 2) TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Hình ảnh giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 3 Kết giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 04 - Người mẹ người dì xác định - Bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng Hemophilia A thể nhẹ Bệnh nhân tiến tình trạng mang gen bệnh vị trí đột biến điểm exon 14 kỹ thuật giải trình hành giải trình tự tồn gen F8 để xác định tự gen Kết cho thấy người mẹ trạng thái dị hợp tử người lành mang gen bệnh, đột biến điểm Kết cho thấy bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid A exon 14 vị trí gây lệch khung dịch mã (Thr904Asn fs*2) dì bệnh nhân người lành mang gen bệnh (hình 3) Bệnh nhân Người bình thường Dì bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Hình Hình ảnh giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 4 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết chung Bảng Kết phát người lành mang gen F8 đột biến thành viên nữ gia đình bệnh nhân hemophilia A Bệnh nhân hemophilia A Bệnh nhân mã số Thể trung bình Đột biến del2605C exon 14 Bệnh nhân mã số Thể nặng Đột biến đảo đoạn intron 22 Bệnh nhân mã số Thể nặng Đột biến nucleotid TCT Bệnh nhân mã số Thể nhẹ Đột biến thêm nucleotid A exon 14 Bệnh nhân mã số Thể trung bình Đột biến thêm nucleotid A exon Mẹ bệnh nhân Dị hợp tử Dị hợp tử Không mang gen bệnh Dị hợp tử Dị hợp tử Chị bệnh nhân Khơng mang gen bệnh Đối tượng nghiên cứu Dì bệnh nhân Tổng số Không mang gen bệnh Số thành viên gia đình phân tích gen F8 = người Số người lành mang gen bệnh = người (4/5 người mẹ) Số người không mang gen bệnh = người (1/5 người mẹ + chị gái + người dì IV BÀN LUẬN Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh với nhiễm sắc thể giới tính X khơng có alen hemophilia A Theo Oldenburg cộng sự, dạng đột biến điểm (thay nucleotid, tương ứng nhiễm sắc thể Y Người mẹ mang gen F8 trạng thái dị hợp tử gây đột biến sai nghĩa vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao (47,5%), tiếp đến dạng đột biến truyền gen bệnh cho trai đó, trai mắc bệnh truyền gen đảo đoạn intron intron 22 (36,7%), lại đột biến xóa đoạn gen (10 ÷ 15%) Tùy bệnh cho gái, gái dạng dị hợp tử, người gái sinh có thuộc vào dạng đột biến vị trí đột biến Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên kết thể truyền gen bệnh cho trai gen F8 mà lâm sàng xuất thể bệnh nặng nhẹ khác Mặc dù khơng có gái Người bố mang gen đột biến truyền bệnh cho gái dạng dị hợp tử Đột vai trò việc mã hóa hay tham gia q trình hoạt hóa yếu tố VIII, vùng intron biến di truyền chiếm 2/3 trường hợp đột biến gen F8, 1/3 trường hợp gen F8 tác nhân gây dạng đột biến đảo đoạn bệnh nhân hemophilia lại đột biến phát sinh A thể nặng [6] trình tạo giao tử từ người bố từ người mẹ (denovo mutation) Kết đột biến gen F8 bệnh nhân sở khoa học cho phân tích phát TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đột biến gen thành viên - Phân tích gen gia đình bệnh nhân mã gia đình bệnh nhân phát người lành mang gen bệnh Trước đây, thai phụ số 04 cho thấy người mẹ mang gen F8 trạng thái dị hợp tử người mẹ tư mang gen bệnh thường tư vấn nên sinh gái, thai nhi nam khuyến vấn cần làm chẩn đốn trước sinh bệnh hemophilia A cho lần mang thai tiếp theo; cáo nên đình thai nghén để tránh sinh bị bệnh hemophilia A Ngày nay, tiến người dì khơng mang gen F8 bị đột biến, mang thai tuần thứ 18 tư vấn sinh học phân tử cho phép phát khơng cần làm chẩn đốn trước sinh bệnh xác người trạng thái dị hợp tử để thực tư vấn hôn nhân di truyền hemophilia A cho lần mang thai sau - Phân tích gen gia đình bệnh nhân gia đình bệnh nhân có nguyện vọng Các thai phụ có nguy cao sinh bị bệnh hemo- mã số 05 với kết quả: người mẹ mang gen bệnh, người mẹ cần làm chẩn đoán philia A (người lành mang gen bệnh) khuyến khích thực chẩn đốn trước sinh trước sinh bệnh hemophilia A cho lần mang thai thứ hai có hội sinh trai khỏe mạnh Quy Nghiên cứu thực trình cần có điều kiện sau: (i) xác định dạng vị trí đột biến gen F8 thành viên 05 gia đình bệnh nhân (7 người) cho thấy việc xác định người lành mang bệnh nhân, (ii) dựa vào phả hệ phân tích gen nhằm phát người lành mang gen thu kết khả quan, có ý nghĩa khoa học, thực tiễn nhân văn đồng thời gen bệnh cộng đồng người huyết thống với bệnh nhân Tuy nhiên, gen sở quan trọng cho nghiên cứu nhằm tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh F8 dài nên việc xác định vị trí đột bệnh lý di truyền nói chung bệnh biến cần nhiều thời gian [7; 8] - Phân tích gen gia đình bệnh nhân mã hemophilia A nói riêng số 01 cho thấy: người mẹ trạng thái dị hợp tử, người chị gái không mang gen bệnh Người mẹ mang thai, tư vấn cần thực chẩn đốn trước sinh bệnh hemophilia A Người chị gái khơng cần thiết phải thực chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A sinh thêm V KẾT LUẬN Phát 4/7 thành viên nữ gia đình bệnh nhân hemophilia A trạng thái dị hợp tử (người lành mang gen bệnh), sở khoa học cho cơng tác tư vấn di truyền chẩn đốn trước sinh Lời cảm ơn - Phân tích gen gia đình bệnh nhân mã số 02 cho thấy người mẹ mang gen đột biến Nghiên cứu hỗ trợ kinh phí đề tài đảo đoạn intron 22, tư vấn cần có chẩn đốn trước sinh bệnh hemophilia A cho cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen gây lần mang thai sau bệnh hemophilia A” - Phân tích gen gia đình bệnh nhân mã số 03 cho thấy người mẹ không mang gen F8 TÀI LIỆU THAM KHẢO đột biến, người mẹ khơng cần thực chẩn đốn trước sinh bệnh hemophilia A Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM (1984) Molecular cloning of a cDNA encoding human cho lần mang thai sau antihaemophilic factor, Nature, 312, 342 - 347 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Graw J, Brackmann HH, Oldenburg J et al (2005) Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies, Nat Rev Genet (6), 488 - 501 Goodeve AC, Peake I (2003) The molecular basis of hemophilia A: genotypephenotype relationships and inhibitor develop- Liliana C Rossetti (2005) Genotyping the Hemophilia Inversion Hotspot by use of Inverse PCR, Hemostasis and Thrombosis, 51 (7), 1154 - 1158 Oldenburg, J., Ananyeva, N M, Saenko, E L (2004) Molecular basis of haemophilia A, Haemophilia, 10 (4), 133 –139 ment, Semin Thromb Hemost., 29(1), 23 - 30 Lê Nhật Minh, Lê Thị Kim Tuyến, Đỗ Trung Phấn (2004) Sử dụng phương pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định cá thể mang gen bệnh máu khó đơng hemophilia A, Tạp chí Y học thực hành, 8, 61 - 62 A M Street, R Ljung, S A Lavery (2008) Management of carriers and babie with Hemophilia, Haemphilia, 14(3), 181 - 187 Anne Goodeve (2008), Moleculer Genetic testing of Hemophilia A, Seminar in thrombosis an Hemostasis, 34(6), 491 - 501 Summary DETECTION OF HEMOPHILIA A PATIENTS WITH RECESSIVE GENE Hemophilia A is an inherited recessive X-linked disease that causes abnormal blood coagulation In order to reduce the incidence of this disease to identify the recessive Hemophilia - A gene carriers are important for prenatal diagnosis and genetic counseling In this study, we selected female members of hemophillia A families; Reverse PCR and sequencing methods were used to detect the recessive Hemophilia - A gene carrier The result showed that out of female members were found to have mutation in in heterozygous form Keywords: Hemophilia A, recessive Hemophilia-A gene carrier TCNCYH 83 (3) - 2013 ... Không mang gen bệnh Dị hợp tử Dị hợp tử Chị bệnh nhân Khơng mang gen bệnh Đối tượng nghiên cứu Dì bệnh nhân Tổng số Không mang gen bệnh Số thành viên gia đình phân tích gen F8 = người Số người lành. .. xác định người lành mang bệnh nhân, (ii) d a vào phả hệ phân tích gen nhằm phát người lành mang gen thu kết khả quan, có ý ngh a khoa học, thực tiễn nhân văn đồng thời gen bệnh cộng đồng người huyết... định cá thể mang gen bệnh máu khó đơng hemophilia A, Tạp chí Y học thực hành, 8, 61 - 62 A M Street, R Ljung, S A Lavery (2008) Management of carriers and babie with Hemophilia, Haemphilia, 14(3),