ỨNG DỤNG kỹ THUẬT PCR và RT PCR TRONG CHẨN đoán WSSV (white spot syndrome virus) và GAV (gill associated virus) TRÊN tôm sú (penaeus monodon) ở ĐỒNG BẰNG SÔNG cửu LONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN TRẦN VIỆT TIÊN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN WSSV (White Spot Syndrome virus) VÀ GAV (Gill-associated virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Ths NGUYỄN MINH HẬU Ks TRẦN THỊ MỸ DUYÊN 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, Bộ Môn Sinh Học Bệnh Thủy Sản tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Cô Đặng Thị Hồng Oanh tận tình hướng dẫn, bảo suốt thời gian thực đề tài Thầy Nguyễn Minh Hậu, chị Trần Thị Mỹ Duyên nhiệt tình giúp đỡ tơi Các thầy, truyền đạt kiến thức cho suốt năm đại học Gia đình bạn bè ln bên tơi suốt thời gian qua Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài thực nhằm xác định khả ứng dụng phương pháp RTPCR PCR nghiên cứu tác nhân GAV WSSV tôm sú giống số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong 169 mẫu tơm sú giống phân tích kit IQ2000 YHV/GAV WSSV có 10,7% mẫu cho kết dương tính với GAV 4,2% mẫu cho kết dương tính với WSSV Sáu mẫu dương tính với GAV chọn để thực qui trình Cowley et al., 2000 Sản phẩm PCR cho kết 317 bp Sau tiếp tục xác định khả ứng dụng kết hợp qui trình RT-PCR Cowley et al (2000) qui trình RT-PCR phát gen β-actin (Oanh, 2007) phát đồng thời ARNtt tơm vị trí 216 bp GAV vị trí 317 bp Việc phát cho thấy khả ứng dụng β-actin làm đối chứng ARN tôm kỹ thuật RT-PCR Dựa kết đạt được, qui trình tương tự WSSV thực dựa theo qui trình phát WSSV OIE (2006) Theo qui trình này, sản phẩm PCR cho kết 941 bp phát đồng thời gen β-actin tôm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trung Trang LỜI CẢM TẠ - i TÓM TẮT -ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH - vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU -1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU -3 2.1 Tổng quan tình hình ni tơm 2.1.1 Trên giới -3 2.1.2 Ở Việt Nam 2.2 Tổng quan tình hình dịch bệnh tôm -5 2.2.1 Trên giới -5 2.2.2 Ở Việt Nam 2.3 Sơ lược GAV 2.3.1 Tác nhân gây bệnh 2.3.2 Phân bố - 10 tâm Học 2.3.3 liệuLoài ĐHvàCần Thơ Tài -liệu học tập nghiên giai đoạn cảm@ nhiễm 10 2.3.4 Phương thức lây nhiễm - 10 2.3.5 Phương pháp chẩn đóan 10 2.3.6 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (RT-PCR) phát GAV - 13 2.4 Sơ lược WSSV - 15 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 15 2.4.2 Phân bố - 16 2.4.3 Loài giai đoạn cảm nhiễm 16 2.4.4 Phương thức lây nhiễm - 17 2.4.5 Phương pháp chẩn đóan 17 2.4.6 Phương pháp phòng xử lí bệnh 19 2.4.7 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (PCR) phát WSSV 20 2.5 Phương pháp PCR - 22 2.6 Phương pháp RT-PCR 24 2.7 Ứng dụng kĩ thuật PCR thủy sản 25 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 26 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu - 26 cứu iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trung 3.2 Vật liệu nghiên cứu 26 3.2.1 Dụng cụ - 26 3.2.2 Hóa chất 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu - 28 3.3.1 Phương pháp thu mẫu - 28 3.3.2 Phát GAV với Kit IQ2000YHV/GAV - 28 3.3.3 Qui trình RT- PCR phát GAV (Cowley et al., 2000) 30 3.3.4 Qui trình RT-PCR phát gen β - actin tôm (Oanh, 2007) - 34 3.3.5 Phát WSSV với Kit IQ2000WSSV - 36 3.3.6 Ly trích mẫu - 38 3.3.7 Phương pháp đo hàm lượng ADN, ARN máy so màu quang phổ 39 3.3.8 Khuếch đại ADN (OIE, 2006) - 39 3.3.9 Xử lí số liệu 41 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 42 4.1 Khảo sát tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên GAV, WSSV tôm sú giống số tỉnh ĐBSCL 42 4.2 Thực qui trình RT-PCR phát GAV tơm theo phương Cowley et al., 43 tâm Học liệupháp ĐHcủaCần Thơ @2000 Tài liệu học tập nghiên 4.3 Thực qui trình RT-PCR phát gen β-actin tôm (Oanh, 2007) - 45 4.4 Xác định khả ứng dụng qui trình mRT-PCR phát GAV gen β-actin tơm - 47 4.5 Thực qui trình PCR phát WSSV tôm theo OIE (2006) 48 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - 55 5.1 Kết luận - 55 5.2 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 56 PHỤ LỤC - 62 cứu iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Diện tích, sản lượng giá trị xuất hàng năm nuôi trồng thủy sản Bảng 2.2: Sản lượng thủy sản phân theo khu vực địa phương (ĐV: Tấn) Bảng 2.3: Ước tính giá trị sản lượng thất dịch bệnh tơm Châu Á Châu Mĩ Bảng 3.1: Trình tự đoạn mồi sử dụng qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000 ) Bảng 3.2: Trình tự đoạn mồi sử dụng qui trình RT-PCT phát gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.3: Trình tự đoạn mồi sử dụng qui trình PCR (OIE, 2006) Bảng 3.4: Thành phần hóa chất tham gia vào q trình trộn hỗn hợp A tạo cDNA Bảng 3.5: Thành phần hóa chất tham gia vào trình trộn hỗn hợp B tạo cDNA Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Bảng 3.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Bảng 3.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại bước qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Bảng 3.8: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại qui trình RT-PCR phát gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.9: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình OIE (2006) Bảng 3.10: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình OIE (2006) Bảng 4.1: Hàm lượng ARN mẫu phân tích Bảng 4.2: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình mRT-PCR phát GAV gen β – actin tôm Bảng 4.3: Hàm lượng ADN mẫu phân tích v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước theo qui trình OIE (2006) Bảng 4.5: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước theo qui trình OIE (2006) Bảng 4.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khuôn mồi tăng gấp đôi Bảng 4.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khuôn mồi tăng gấp đôi Bảng 4.8: Hàm lượng ADN mẫu phân tích ly trích DTAB/CTAB Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Sản lượng nuôi tôm nuôi đánh bắt giới Hình 2.2: Sản lượng tơm ni số nước giới Hình 2.3: Sản lượng tơm ni giới năm 2001 Hình 2.4: Tơm bị nhiễm GAV Mang tơm chuyển sang màu vàng Hình 2.5: Tơm bị nhiễm GAV Tịan thân tơm chuyển sang màu đỏ Hình 2.6: Tơm bị nhiễm GAV Tế bào biểu mơ có tượng nhân kết đặc Hình 2.7: Cơ quan lymphoid nhiễm GAV, mũi tên diện vi rút Hình 2.8: Cơ quan lymphoid tơm nhiễm GAV, mũi tên diện vi rút lai In situ Hình 2.9: Quan sát GAV kính hiển vi điện tử Hình 2.10: Vi-rút nhuộm âm huyết tương tôm sú nhiễm bệnh WSSV, số thể vi-rút có Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 2.11: Vỏ tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.12: Lát cắt mơ dày tơm P.chinensis ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.13: Lát cắt mang tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh baculovirus đốm trắng Hình 3.1: Minh họa kết chạy PCR phát YHV/GAV theo kit IQ2000 Hình 3.2: Minh họa kết chạy PCR phát GAV theo qui trình RTPCR (Cowley et al., 2000) Hình 3.3: Minh họa kết chạy PCR theo qui trình RT-PCR phát gen β – actin (Oanh, 2007) Hình 3.4: Minh họa kết chạy PCR phát WSSV theo kit IQ2000 Hình 4.1: Tỉ lệ cảm nhiễm GAV tơm sú giống Hình 4.2: Tỉ lệ cảm nhiễm WSSV tơm sú giống Hình 4.3: Kết chạy PCR bước (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.4: Kết chạy PCR bước (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) với mẫu 123 pha lỗng với hàm lượng khác Hình 4.5: Kết chạy PCR bước theo qui trình RT-PCR phát gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 124 Hình 4.6: Kết chạy PCR bước theo qui trình RT-PCR phát gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác Hình 4.7: Kết chạy PCR theo qui trình mRT-PCR phát GAV β – actin tơm Hình 4.8: Kết chạy PCR bước theo qui trình OIE (2006) Hình 4.9: Kết chạy PCR bước theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khn mồi tăng gấp đơi Hình 4.10: Kết kiểm tra ADN gel với agarose 1% Trung Hình 4.11: Kết chạy PCR bước mẫu 142 (với hàm lượng ADN khn) qui Thơ trình OIE tâm Học liệu ĐHtheo Cần @(2006) Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.12: Kết chạy PCR bước theo qui trình OIE (2006) mẫu ly trích DTAB/CTAB viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Trung Hiện ngành nuôi trồng thủy sản ngày có vai trò quan trọng, đem lại hiệu kinh tế cao Đặc biệt đồng sông Cửu Long (ĐBSCL), ngành nuôi trồng thủy sản trở thành mạnh vùng năm gần Tổng diện tích có tiềm phát triển khả ni trồng thủy sản vùng 1.200.000 gần 55% diện tích ni nước (Bộ thủy sản, 2006) Ngành thủy sản với phát triển nhanh tạo hàng loạt việc làm, nuôi trồng thủy sản chủ yếu qui mơ hộ gia đình nên trở thành nguồn thu hút lực lượng lao động đông đảo tham gia vào tất công đoạn sản xuất, làm giảm sức ép nạn thiếu việc làm nước Tuy nhiên nhiều nơi phát triển ạt, tự phát, thiếu quy hoạch người ni chưa có hiểu biết kỹ thuật nuôi tôm chưa nhận thức mức nguy ô nhiễm môi trường dịch bệnh q trình ni tơm nên suất thấp, tổn thất điều khơng tránh khỏi, gây khó khăn đời sống kinh tế cho người ni tơm Hiện có nhiều loại bệnh xuất q trình ni tơm nguy hiểm bệnh vi-rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV), vi-rút gây tâmvi-rút Họcgâyliệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus - TSV), vi-rút gây bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus - YHV) Đặc biệt vi-rút gây bệnh liên kết mang (Gillassociated Virus - GAV) bệnh xuất vào năm 1996 Queensland, Úc (Spann et al., 1997) Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên cơng tác phịng ngừa chẩn đốn bệnh sớm cần thiết Các phương pháp chẩn đoán truyền thống mô bệnh học hay dựa kinh nghiệm người nuôi không cho phép phát sớm xác tác nhân gây bệnh Nhiều phương pháp lai In situ, Western blot, PCR, RT-PCR phát triển nhằm khắc phục nhược điểm vừa kể việc phát GAV, WSSV tôm sú giúp người nuôi phát kịp thời, hạn chế đến mức thấp thiệt hại dịch bệnh gây ra, nâng cao suất (Phan Quốc Việt ctv, 2003) Do đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR RT-PCR chẩn đoán WSSV (White Spot Syndrome Virus) GAV (Gill associated virus) tôm sú (Penaeus monodon) đồng sông Cửu Long” thực LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.7 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước theo qui trình OIE với hàm lượng ADN khn hàm lượng mồi tăng gấp đơi Hố chất/Dung dịch Dung dịch đệm 10X MgCl2 (50 mM) dNTP (10mM) Taq ADN polymerase 5UI/µl Nước Mồi 146 F1 (100 pmol) Mồi 146 F2 (100 pmol) Sản phẩm PCR bước Tổng Thể tích µl 1,5 µl µl 0,2 µl 30,3 µl µl µl 10 µl 50 µl M 1000 bp 500 bp nghiên cứu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập 100 bp Hình 4.9 Kết chạy PCR bước theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khuôn mồi tăng gấp đôi Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng dương Giếng 2: đối chứng âm Giếng 3: mẫu Giếng 4: mẫu 68 Giếng 5: mẫu 203 Để xác định lại chất lượng ADN dùng để thực qui trình PCR (OIE, 2006) phát WSSV tôm sú, 38 mẫu ADN điện di gel agarose 1% Kết điện trình bày hình 4.10 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình 4.10: K?t qu? ki?m tra ADN gel v?i agarose 1% Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.10 Kết kiểm tra ADN gel 1% agarose Lược Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 1484 Giếng 2: mẫu 43 Giếng 3: mẫu 200 Giếng 4: mẫu 40 Giếng 5: mẫu 148 Giếng 6: mẫu 203 Giếng 7: mẫu 221 Giếng 8: mẫu 219 Giếng 9: mẫu 195 Giếng 10: mẫu 226 Giếng 11: mẫu 145 Giếng 12: mẫu 1855 Giếng 13: mẫu 193 Giếng 14: mẫu 225 Giếng 15: mẫu 44 Giếng 16: mẫu 218 Giếng 17: mẫu 223 Giếng 18: mẫu 33 Giếng 19: mẫu 220 Lược Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 56b +++ Giếng 2: mẫu 57b +++ Giếng 3: mẫu 89b +++ Giếng 4: mẫu 92b +++ Giếng 5: mẫu 93b +++ Giếng 6: mẫu 141 ++ Giếng 7: mẫu 142 ++ Giếng 8: mẫu 152 ++ Giếng 9: mẫu 159 ++ Giếng 10: mẫu 15A +++ Giếng 11: mẫu 15B +++ Giếng 12: mẫu 15B ++ Giếng 13: mẫu 12B +++ Giếng 14: mẫu 12A +++ Giếng 15: mẫu 15A ++ Giếng 16: mẫu 12A ++ Giếng 17: mẫu 12B ++ Giếng 18: mẫu 37 + Giếng 19: mẫu 149 + 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết phát WSSV kít IQ2000 WSSV với mẫu 56b, 142 15A có mẫu 142 cho kết dương tính Mẫu chọn để chạy với qui trình OIE thử với hàm lượng ADN khn µl; 1,5 µl; µl 0,5 µl M 1000 bp 500 bp 100 bp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.11 Kết chạy PCR bước mẫu 142 (với hàm lượng ADN khuôn ) theo qui trình OIE (2006) Giếng M: thang đo Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: mẫu 142 với hàm lượng ADN khn µl Giếng 3: mẫu 142 với hàm lượng ADN khn 1,5 µl Giếng 4: mẫu 142 với hàm lượng ADN khn µl Giếng 5: mẫu 142 với hàm lượng ADN khuôn 0,5 µl Kết âm tính nên giải pháp ly trích ADN từ mẫu tơm thịt bị bệnh đốm trắng sử dụng dung dịch ly trích DTAB/CTAB Hàm lượng ADN ly trích trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8 Hàm lượng ADN cuả mẫu phân tích ly trích DTAB/CTAB STT Mẫu phân tích 6’ 7’ 8’ Mức độ nhiễm + ++ + Giá trị đo 260 nm 0.521 0.2672 0.7006 Hàm lượng ADN (µg /µl) 667,625 334 875,75 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mẫu tơm thịt 6’, 7’, 8’ chạy qui trình OIE trình bày bảng 4.4 bảng 4.5 M 1000 bp 500 bp 100 bp Hình 4.12 Kết qủa chạy PCR bước theo qui trình OIE (2006) mẫu ly Trung tâm Học liệu ĐH Cầntrích Thơ @DTAB/CTAB Tài liệu học tập nghiên cứu Giếng M: thang đo Giếng 1: mẫu 6’ Giếng 2: mẫu 7’ Giếng 3: mẫu 8’ Giếng 4: đối chứng dương Giếng 5: đối chứng âm Kết mẫu 6’ 7’ vạch giống đối chứng dương nhiên chưa thể phát vạch vị trí 941 bp Kết cho thấy cần thực bước chuẩn hóa hàm lượng ADN, hàm lượng MgCl2 điều kiện PCR để tối ưu hóa qui trình 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Tỉ lệ nhiễm GAV tôm sú giống xét nghiệm khoa Thủy sản 10,7% tỉ lệ nhiễm WSSV 4,2% xem có ảnh hưởng đến chất lượng tơm sú giống Thực qui trình RT-PCR phát GAV theo Cowley et al (2000), sản phẩm PCR cho kết 317 bp Khả ứng dụng qui trình mRT-PCR phát GAV β-actin cao, phát đồng thời GAV (vị trí 317 bp) β-actin tơm (ở vị trí 216 bp) Thực qui trình PCR phát WSSV theo OIE (2006) cho kết giống đối chứng dương nhiên chưa thể phát vạch vị trí 941 bp 5.2 Đề xuất Số mẫu phân tích cần nhiều để xác định xác tỉ lệ nhiễm GAV WSSV tôm sú giống Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Đã thực thành cơng qui trình qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV β-actin Tuy nhiên cần tối ưu hóa lại để tăng khả ứng dụng qui trình Cần tiến hành tối ưu hố qui trình OIE phát WSSV tơm để thực qui trình mPCR phát đồng thời WSSV 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bui Thi Minh Dieu, H Marks, J.J Siebenga, R.W Goldbach, D Zuidema, T.P Duong and J.M Vlak 2004 Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam Journal of General Viriology 85: 3607-3618 Bùi Quang Tề, 2003 Bệnh tôm nuôi biện pháp phịng trị NXB nơng nghiệp 187 trang Bodad-reantaso, M.G., S.E McGladdery, I East and R.B Subasinghe 2001 Asia diagnostic guide to aquatic animl disease FAO and NACA Chanratchakool, P., D.F Fegan and M.J Phillips 1999 Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture In: R.P.Subasinge, J.R Phillips and M.B Reantaso (Editors) The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999 Page 85-90 Trung tâm Cowley, J.A., C.M Dimmock, C Wongteerasypayac, V Boonsaeng, S.Panyim & P.J Walker.1999 Yellow head virus from Thailand and gill-associated virus from Australia are closely related but distinct Họcprawn liệuviruses ĐH Cần ThơOrg @36Tài liệu học tập nghiên cứu Dis Aquat : 153-157 Cowley, J.A., C.M Dimmock, K.M Spann, P.J Walker 2000 Detection of Australian gill-associated virus (GAV) and lymphoid organ virus (LOV) of Penaeus monodon by RT-nested PCR amplification Dis Aquat Org 39: 159-167 Cowley, J.A., M.R Hall, L.C Cadogan, K.M Spann and P.J Walker 2002 Vertical transmission of gill-associated virus (GAV) in the black tiger prawn Peanaeus monodon Dis Aquat Org 50: 95-104 Corrales, H.L., C.L Watson, J Wigglesworth 1999 Sumary of Latin American national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture In: R.P.Subasinge, J.R Phillips and M.B Reantaso (Editors) The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999 Page 20-23 Dang Thi Hoang Oanh, 2007 RNA interference in Penaeid prawns PhD thesis, School of Molecular and Microbial Sciences, The University of Queensland, Australia 10 Flegel, T.W., 2004 Shrimp biology and anatomy for pathology 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 11 Graindorge, V.A.D and D Griffith 1999 Sumary of Latin American national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture In: R.P.Subasinge, J.R Phillips and M.B Reantaso (Editors) The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999 Page 17-19 12 Hà Anh 2004 Bệnh tôm nuôi đôi lời bàn Tạp chí thuỷ sản Số 3: 33 – 35 13 Helga, J 2004 An Overview on the World Shrimp Market In: World Shrimp Markets 26-27 October 2004 Marid, Spain 14 Helga, J 2007 Aquacuture Trade and Price FEAP meeting, Rom, May 2007 15 Herfort, A 2004 Viral disease-Gill-associated virus disease Aquatic Animal Disease to Australian: Idetification Field Guide, Australian Government Department of Agricultur, Fisheries and Forestry, Canberra Page: 1-4 16 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003 Sinh học phân tử NXB giáo dục 301 trang Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 17 http://foodmarketexchange.com/datacenter/product/seafood/shrimp/det ail/dc_pi_sf_shrimp0202.htm (Accessed on 26 July 2007) 18 http://en.wikipedia.org/wiki/Shrimp_farm (Accessed on 27 July 2007) 19 http://www.vietlinh.com.vn/ html/tintuc (Ngày truy cập 03/02/2007 ) 20 Hsu, H.C., C.F Lo, S.C Lin, K.F Liu, S.E Peng, Y.S Chang, L.L Chen, W.J Liu and G.H Kou 1999 Studies on effective PCR screening strategies for white spot syndrome virus (WSSV) detection in Penaues monodon brooders Dis Aquat Org 39: 13-19 21 Bộ Thủy sản 2005 Kết thực kế hoạch năm ngành thủy sản Ngày 6/12/2005 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=49&news_ID=6124705 (Ngày truy cập 27/06/2007) 22 Khuất Hữu Thanh, 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB khoa học kỹ thuật 23 Khanobdee K., C Soowannayan, T.W Felgel, S Ubol & B Withyachumnarnkul 2002 Evidence for apoptodis correlated with 57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mortality in the giant black tier shrimp Penaeus monodon infectic with yellow head virus Dis Aquat Org 48 : 79-90 24 Lê Văn Khoa, Nguyễn Văn Hảo Lê Thị Lan Hương 1999 Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture In: R.P.Subasinge, J.R Phillips and M.B Reantaso (Editors) The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999.Page 91-94 25 Lightner, D.V 2003 The Penaeid Shrimp Viral Pandemic due to IHHNV, WSSV, and YHV: History in the American and Current Status Department of Veterinary science and microbiolory University of Arizona, tucson, AZ 85721 USA 26 Lo, C.F., H.C Hsu, M.F Tsai, C.H Ho, S.E Peng, G.H Kou and D.V Lighner 1999 Specific genomic DNA fragment analaysis of different geographical clinical sample of shrimp white spot syndrome virus Dis Aquat Org 35: 175-185 27 Manual of diagnostic test for aquatic anima, 2003 Yellow head disease www.oie.int/eng/normes/finnual Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 28 Manual of diagnostic test for aquatic animal, 2006 Yellow head disease www.oie.int/eng/normes/finnual 29 Manual of diagnostic test for aquatic animal, 2006 White spot disease www.oie.int/eng/normes/finnual 30 Mai Phương – Hà Yên, 2003 Báo động đỏ bệnh tôm nuôi http://www.vietnamnet.com.vn/kinhte/toancanh/2003/12/39177/ (Ngày truy cập 27/06/2007) 31 Magbanua, F.O., K.T Natividad, V.P Migo, C.G Alfafara, F.O de la Peria, R.O Miranda, J.D Albaladejo, E.C.B Nadala Jr, P.C Loh and L.M Tapay 2000 White spot syndrome virus (WSSV) in cultured Penaeus monodon in the Philippines Dis Aquat Org 42: 77-82 32 Nguyễn Minh Hậu 2006 Bước đầu nghiên cứu vi-rút gây bệnh đầu vàng tôm sú (Penaeus mondon) Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn cao học 33 Otta, S.K., G Shubha, B Joseph, A Chakraborty, I Karunasagar and I Karunasagar 1999 polymerase chain reation (PCR) detection of white 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com spot syndrome virus (WSSV) in cultured and wild crustaceans in India Dis Aquat Org 38: 67-70 34 Phạm Thành Hổ 2003 Di truyền học NXB Giáo dục 613 trang 35 Phạm Đình Đơn 2006 Bảo vệ môi trường nuôi trồng thủy sản Vấn đề giải pháp http://www.nea.gov.vn/tapchi/Toanvan/08-2k520.htm (Ngày truy cập 27/06/2007) 36 Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạn Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Phát vi-rút gây bệnh đầu vàng phương pháp RT-PCR Tạp chí di truyền ứng dụng Số : 1-4 37 Phan Thi Ngoc Thuy, P.J Walker, R.A.J Hodgson and B.R.J Lester 2003 Detection of yellow head virus (YHV) and gill-associated virus (GAV) on tiger shrimp (Peneaus monodon) in Vietnam Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp 4: 103-105 38 Rajendran, K.V., K.K Vijayan, T.C Santiago and K.M Krol 1999 Experimental host range and histopathology of white spot syndrome virus (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobters from India Journal of Fish Disease 22: 183-191 39 Spann R.A Thơ Donaldson, J.A.liệu Cowley, P.J Walker 2000 cứu Trung tâm Học liệu K.M., ĐH Cần @ Tài học tập nghiên Differences in the susceptibility of some penaeid prawn species to gillassociated virus (GAV) infetion Dis Aquat Org 42 : 221-225 40 Spann K.M., J.A Cowley, P.J Walker and R.J.G (1997) A Yellow head like virus from Penaeus mondon culture in Australia Dis Aquat Org 31: 169-179 41 Subashinghe R.P., M.G Bondad-Reantaso, S.E McGladdery 2001 Aquaculture development, health and wealth In: Subashinghe R.P., P Bueno, M.J Phillip, C Hough, S.E McGladdery and J.R Arthur Technical proceeding of the Conference on Aquaculture in the Third millennnium, Bangkok, Thailand, 20-25 February 2000 NACA, Bangkok and FAO, Rome 42 Thakul, P.C., F Corsin, J.F Turnbull, K.M Shankar, N.V Hao, P.A Padiyar, M Madhusudhan, K L Morgan and C.V Mohan 2002 Estimation of prevalence of white spot syndrome virus (WSSV) by polymerase chain reation in Penaues monodon postlarvae at time of stocking in shrimp farms of karnataka, India: a population-based study Dis Aquat Org 49: 235-243 59 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 Tạp chí Thủy sản Số 1, 2006 44 Theo báo Bình Định 2007 Bình Định: Tồn tỉnh có 109 tôm nuôi bị dịch bệnh http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&News_ID=85 53246.(Ngày truy cập 27/06/2007) 45 Theo báo Long An Ngày 05/04/2007 Các giải pháp ngăn ngừa dịch bệnh tôm sú vụ tôm năm 2007 vùng hạ http://www.longan.gov.vn/uilan/printView.jsp?idtin=4249.(Ngày truy cập 27/06/2007) 46 Theo Lao Động, ngày 13/03/2003 Tôm chết hàng loạt, ngành thủy sản bó tay http://www.vnexpress.net/Vietnam/KinhdOanh/2003/03/3B9C5D27/ (Ngày truy cập 27/06/2007) 47 Theo báo Hà Tĩnh, ngày 18/05/2007 Toàn tỉnh gần 60 tôm sú bị dịch bệnh http://hatinh.gov.vn/home/index.asp?module=news&act=show&nid=71 (Ngày truy cập 27/06/2007) Trung tâm 48 Thêm vụ tôm sa lầy Họchttp://www.laodong.com.vn/Home/phongsu/2007/6/39351.laodong liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên (Ngày truy cập 27/06/2007) cứu 49 Theo khuyến ngư Kiên Giang 2003 Một số bệnh thường gặp nuôi tôm sú http://thuysan.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=453&articleId=224 50 Toshiaki, I 2003 Disease problems in prawn farming 51 Trần Thị Xô Nguyễn Thị Lan 2005 Cơ sở di truyền công nghệ gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật 52 Trần Thị Tuyết Hoa 2004 Bài giảng sinh học phân tử 53 Trần Thị Tuyết Hoa 2004 Bài giảng bệnh virus 54 Bộ Thủy sản 2006 Vai trò vị trí ngành Thuỷ sản kinh tế quốc dân Ngày18/1/2006 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=18163919&news_ID=18 170767 (Ngày truy cập 03/02/2007) 55 Van Hulten, M.C.W., M Reijns, A.M.G Vermeesch, F Zandbergen, and J.M Vlak 2002 Identification of VP 19 and VP 15 of white spot 60 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com syndrome virus (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structural protein Journal of General Viriology 83: 257-265 56 Vlak, J.M., J.R Bonami, T.W Flegel, G.H Kou, D.V Lightner, C.F Lo, P.C Loh, and P.J Walker 2002 NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates ICTV, Paris, 2002 57 Võ Thị Thương Lan 2006 Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng NXB giáo dục 58 Walker, P.J 1999 Sumary of Asian national rewiews on management strategies for major disease in shrimp aquaculture In: R.P.Subasinge, J.R Phillips and M.B Reantaso (Editors) The matic reweiw management stragies for major disease in shrimp aquaculture Report of a workshop held in Cebu, Phippines from 28-30 November 1999 Page 39-44 59 Wongteerasupaya, C., W Tongchuea., V Boonsaeng., S Pamyim., A Tassanakajon., B Withyachumnarnkul., T.W Flegel 1997 Detection of yellow head virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification Dis Aquat Org 3: 181-186 60 Wongteerasupaya, C., P Pungchai, B Withyachumnarnkul, V Trung tâm HọcBoonsaeng, liệu ĐHS.Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Panyim, T.W Flegel and P.J Walker 2003 High variation in reptitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolate in Thailand Dis Aquat Org 54: 253-257 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Nguồn gốc kết phân tích GAV WSSV tơm sú giống phòng xét nghiệm - Khoa Thủy sản Mã PTN Ngày thu Nơi Thu Ngày tuổi GAV WSSV 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 5/2/2007 26/2/2007 26/2/2007 26/2/2007 26/2/2007 26/2/2007 26/2/2007 2/3/2007 2/3/2007 2/3/2007 2/3/2007 6/3/2007 6/3/2007 6/3/2007 9/3/2007 21/3/2007 21/3/2007 21/3/2007 21/3/2007 21/3/2007 23/3/2007 23/3/2007 23/3/2007 Sóc Trăng Trà Vinh Trà Vinh Trà Vinh Cà Mau Cà Mau Cà Mau Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Cà Mau Cà Mau Cà Mau Kiên Giang Vũng Tàu Vũng Tàu Cần Thơ Cần Thơ Cần Thơ Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 + + - - 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 26/3/2007 26/3/2007 26/3/2007 29/3/2007 29/3/2007 29/3/2007 29/3/2007 1/4/2007 2/4/2007 2/4/2007 2/4/2007 2/4/2007 2/4/2007 3/4/2007 4/4/2007 4/4/2007 4/4/2007 Bạc Liêu Bạc Liêu Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Vũng Tàu Vũng Tàu Sóc Trăng Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 + + + - - - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng 62 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 5/4/2007 5/4/2007 5/4/2007 5/4/2007 9/4/2007 9/4/2007 9/4/2007 9/4/2007 9/4/2007 9/4/2007 10/4/2007 10/4/2007 10/4/2007 10/4/2007 10/4/2007 10/4/2007 10/4/2007 11/4/2007 11/4/2007 11/4/2007 11/4/2007 11/4/2007 12/4/2007 12/4/2007 12/4/2007 12/4/2007 12/4/2007 12/4/2007 12/4/2007 16/04/2007 16/04/2007 16/04/2007 16/04/2007 16/04/2007 17/04/2007 17/04/2007 18/4/2007 19/4/2007 19/4/2007 19/4/2007 20/4/2007 20/4/2007 20/4/2007 23/4/2007 23/4/2007 23/4/2007 23/4/2007 23/4/2007 Sóc Trăng Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Công ty CP Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Bạc Liêu Cơng ty tịan cầu Cơng ty tịan cầu Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 + + + - + ++ + + - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 63 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 23/4/2007 23/4/2007 23/4/2007 24/4/2007 24/4/2007 24/4/2007 25/04/2007 25/04/2007 25/04/2007 25/04/2007 1/5/2007 1/5/2007 1/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 2/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 3/5/2007 7/5/2007 7/5/2007 7/5/2007 7/5/2007 7/5/2007 7/5/2007 8/5/2007 8/5/2007 9/5/2007 9/5/2007 9/5/2007 9/5/2007 9/5/2007 9/5/2007 9/5/2007 11/5/2007 11/5/2007 Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Trà Vinh Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bạc Liêu Bến Tre Bến Tre Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cần Thơ Cần Thơ Kiên Giang Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 + + + + + +++ +++ - + - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 64 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 11/5/2007 11/5/2007 11/5/2007 11/5/2007 11/5/2007 14/05/2007 14/05/2007 14/05/2007 14/05/2007 14/05/2007 16/05/2007 16/05/2007 16/05/2007 16/05/2007 18/05/2007 18/05/2007 21/05/2007 21/05/2007 21/05/2007 23/05/2007 24/05/2007 24/05/2007 25/05/2007 25/05/2007 28/05/2007 28/05/2007 29/05/2007 29/05/2007 29/05/2007 30/05/2007 30/05/2007 30/05/2007 31/05/2007 Bạc liêu Bạc liêu Cà Mau Cà Mau Cà Mau Kiên Giang Cần Thơ Cần Thơ Cần Thơ Cần Thơ Vũng Tàu Cần Thơ Cần Thơ Cần Thơ Cà Ná Cà Ná Sóc Trăng Cần Thơ Cần Thơ Sóc Trăng Sóc Trăng Trà Vinh Trà Vinh Trà Vinh Cà Mau Cà Mau Trà Vinh Trà Vinh Trà Vinh Cà Mau Cà Mau Cà Mau Trà Vinh Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 Post 12-15 + ++ + + ++ - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu (+) Mức độ nhiễm nhẹ (++) Mức độ nhiễm trung bình (+++) Mức độ nhiễm nặng 65 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... Việt ctv, 2003) Do đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật PCR RT -PCR chẩn đoán WSSV (White Spot Syndrome Virus) GAV (Gill associated virus) tôm sú (Penaeus monodon) đồng sông Cửu Long? ?? thực LUAN VAN CHAT LUONG... Xác định khả ứng dụng qui trình RT -PCR PCR chẩn đoán phát sớm vi-rút GAV, WSSV tôm sú (Penaeus monodon) đồng sông Cửu Long Nội dung đề tài Xác định tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên GAV WSSV tôm giống xét... nhằm xác định khả ứng dụng phương pháp RTPCR PCR nghiên cứu tác nhân GAV WSSV tôm sú giống số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Trong 169 mẫu tơm sú giống phân tích kit IQ2000 YHV /GAV WSSV có 10,7% mẫu