Luận văn thạc sĩ VNUA nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) trên lợn landrace và áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH (PED) TRÊN LỢN LANDRACE VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT HĨA MƠ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS TS Nguyễn Thị Lan tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học thú y môn Bệnh lý thú y giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Yến ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN X THESIS ABSTRACT XII PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý NGHĨA KHOA HỌC 1.5.2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 2.1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED TRONG NƯỚC 2.1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH PED NGOÀI NƯỚC 2.2 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS GÂY BỆNH PED 2.2.1 PHÂN LOẠI VÀ HÌNH THÁI CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED 2.2.2 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH 2.2.3 TÍNH CHẤT NI CẤY 12 2.2.4 SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA VIRUS GÂY BỆNH PED 12 2.2.5 TRUYỀN NHIỄM HỌC 12 2.2.6 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 14 2.2.7 CHẨN ĐOÁN 15 2.2.8 PHÒNG BỆNH 18 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3 SƠ LƯỢC VỀ HĨA MƠ MIỄN DỊCH 20 2.3.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 20 2.3.2 NGUYÊN LÝ 20 2.3.3 KHÁNG NGUYÊN (ANTIGEN) 21 2.3.4 KHÁNG THỂ (ANTIBODY) 21 2.3.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHÁNG THỂ 22 2.3.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM 22 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 25 3.3 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.5.1 PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG 26 3.5.2 PHƯƠNG PHÁP RT-PCR 26 3.5.3 PHƯƠNG PHÁP MỔ KHÁM, QUAN SÁT BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ 28 3.5.4 PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VI THỂ VÀ QUAN SÁT BỆNH TÍCH TRÊN TIÊU BẢN 29 3.5.5 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH 32 3.5.6 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO 33 3.5.7 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VIRUS 34 3.5.8 XỬ LÝ SỐ LIỆU 34 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 35 4.1.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 37 4.1.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ ĐẠI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 41 4.1.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 43 4.2 KẾT QUẢ NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH 50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.1 KẾT QUẢ NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH 50 4.2.2 SO SÁNH KẾT QUẢ NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH VỚI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC 52 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5.1 KẾT LUẬN 56 5.2 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 TIẾNG VIỆT 58 TIẾNG ANH 58 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt CPE DAB Nghĩa tiếng Việt - Cytopathogenic effect - 3,3'-Diaminobenzidine DMEM DMSO - Dµlbecco's Modified Eagle's medium - Dimethyl sµlfoxide E EDTA - Envelop Protein - Ethylendiamin Tetraacetic Acid ELISA FBS - Enzym Linked Immunorobent Assay - Fetal bovine serum IHC - Immunohistochemistry N - Nuclecapxit protein M ORF3 - Membrain protein - Open reading frame PBS PED PEDV - Phosphat buffer salin - Porcine Epidemic Diarrhea - Porcine Epidemic Diarrhea virus RNA RT-PCR - Ribonucleic acid - Reverse transcription polymerase chain reaction S TBE - Spike protein - Tris-borate-EDTA buffer TGE TPB - Transmissible gastroenteritis - Tryptose Phosphate Broth vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.2 Nhiệt độ thời gian giai đoạn chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR 27 Bảng 4.1 Thơng tin ca bệnh chẩn đốn PED 35 Bảng 4.2 Kết chẩn đoán PED phản ứng RT-PCR 35 Bảng 4.3 Kết phản ứng RT-PCR PCR xác định có mặt số virus gây tiêu chảy lợn 37 Bảng 4.4 Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng lợn Landrace mắc PED 37 Bảng 4.5 Bệnh tích đại thể số quan lợn Landrace mắc PED 41 Bảng 4.6 Kết nghiên cứu bệnh tích vi thể ruột lợn mắc tiêu chảy virus (PED) 46 Bảng 4.7 Bệnh tích vi thể số quan lợn mắc tiêu chảy virus (PED) 48 Bảng 4.8 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch mẫu ruột lợn Landrace mắc PED 51 Bảng 4.10 So sánh kết số phương pháp chẩn đoán virus PED 54 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Những khơng bào bào tương tế bào hấp thu ruột non lợn, chứa hạt virus PED có đường kính từ 90-190 nm (x20.000) Hình 2.2 Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập Hàn Quốc nhuộm với urany acetat 2% Chiều dài nằm ngang tương đương 100nm Hình 2.3 Mơ hình cấu trúc gen virus PED 10 Hình 2.4 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR 17 Hình 2.5 Hình ảnh Test chẩn đốn nhanh bệnh PED 18 Hình 2.6 Kháng thể đa dòng kháng thể đơn dòng 21 Hình 2.7 Một số phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch (IHC) 24 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 36 Hình 4.2 Lợn sút cân, gầy còm 40 Hình 4.3 Lợn mệt mỏi 40 Hình 4.4 Lợn nằm dồn đống 40 Hình 4.5 Phân dính hậu mơn, chân 40 Hình 4.6 Phân lỏng màu vàng 40 Hình 4.7 Lợn bị tiêu chảy 40 Hình 4.8 Dạ dày, ruột căng, thành mỏng 42 Hình 4.9 Hạch màng treo ruột sưng to 42 Hình 4.10 Thành ruột mỏng, xuất huyết 42 Hình 4.11 Ống dưỡng chất sung huyết 42 Hình 4.12 Dạ dày xuất huyết 43 Hình 4.13 Lách sẫm màu 43 Hình 4.14 Phổi chứa nhiều bọt 43 Hình 4.15 Hạch bẹn nông sưng 43 Hình 4.16 Phổi viêm 43 Hình 4.17 Thận xuất huyết điểm 43 Hình 4.18 Biểu mô dày đứt nát (HE 10X) 49 Hình 4.19 Hoại tử tế bào biểu mô ruột (HE 20X) 49 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.20 Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X) 49 Hình 4.21 Ruột thấm nước phù hạ niêm mạc ruột (HE 10X) 49 Hình 4.22 Lơng nhung ruột đứt nát (HE 10X) 49 Hình 4.23 Thâm nhiễm tế bào viêm ruột (HE 10X) 49 Hình 4.24 Phổi nhiều tế bào viêm, tổ chức kẽ phổi tăng sinh (HE 10X) 50 Hình 4.25 Sung huyết hạ niêm mạc ruột (HE 20X) 50 Hình 4.26 Hồng cầu tràn lan hạch (HE 10X) 50 Hình 4.27 Lơng nhung ruột tù đầu (HE 10X) 50 Hình 4.28 Virus tế bào biểu mơ ruột 51 Hình 4.29 Virus tập trung phần lơng nhung bị đứt nát 51 Hình 4.30 Virus tế bào biểu mô ruột 51 Hình 4.31 Virus tập trung phần lông nhung bị đứt nát 51 Hình 4.32 Tế bào Vero bình thường 53 Hình 4.33 Tế bào Vero bắt đầu có bệnh tích 53 Hình 4.34 Bệnh tích tế bào phát triển 53 Hình 4.35 Tế bào bị Phá hủy hồn toàn 53 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Phổi: Sung huyết, xuất huyết thâm nhiễm tế bào viêm chiếm phần lớn Phổi sung huyết xuất 10 mẫu chiếm tỷ lệ 45,45%, thâm nhiễm tế bào viêm xuất 11 mẫu chiếm tỷ lệ 50%, sung huyết phổi rõ ràng, mạch quản dãn rộng chứa đầy hồng cầu Bên cạnh cịn thấy phổi bị xuất huyết, hồng cầu tràn ngập lịng phế nang Ngồi ra, cịn thấy xuất hoại tử tế bào, tăng sinh tế bào xơ, phù kẽ phổi chiếm tỷ lệ thấp + Hạch ruột giống ruột, nơi chịu tác động tương đối sớm bị ảnh hưởng lớn, bên cạnh hạch ruột cịn tham gia vào q trình đáp ứng miễn dịch nên thể lợn bệnh có biến đổi bệnh lý hạch ruột Do trình biến đổi bệnh lý phức tạp xảy tượng sung huyết có 22 mẫu chiếm tỷ lệ 100%, xuất huyết có 13 mẫu chiếm tỷ lệ 59,09%, tượng thâm nhiễm tế bào viêm thối hóa tế bào có 11 mẫu nghiên cứu chiếm 50% + Thận: Ngoài biến đổi bệnh lý tế bào thận thối hóa, hoại tử cịn có biến đổi kẽ thận xuất huyết có mẫu chiếm tỷ lệ 40,90% thâm nhiễm tế bào viêm có mẫu chiếm tỷ lệ 40,91% Trên số tiêu nghiên cứu thấy tế bào ống thận bị hoại tử, kẽ thận xuất huyết có nhiều hồng cầu tập trung, tế bào viêm thâm nhiễm chèn ép ống thận Có dạng tế bào thường gặp lympho (lymphoid), tổ chức bào (histyocyte), có hoại tử tế bào xảy Như vậy, đánh giá biến đổi bệnh lý vi thể lợn mắc PED quan: hạch ruột, gan, thận, phổi thấy tổn thương chủ yếu quan xuất huyết, sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, số trường hợp có tượng hoại tử tế bào 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.7 Bệnh tích vi thể số quan lợn mắc tiêu chảy virus (PED) Tổn thương vi thể (n = 22) STT Cơ quan Sung huyết Xuất huyết Hoại tử tế bào Thối hóa tế bào Thâm nhiễm tế bào viêm n (+) % n (+) % n (+) % n (+) % n (+) % Phổi 10 45,45 40,09 18,18 36,36 11 50 Hạch ruột 22 100 13 59,09 13 59,09 11 50 11 50 Thận 13 59,09 40,09 18,18 12 54,55 40,91 Ghi chú: n – số mẫu nghiên cứu n (+) – số mẫu dương tính 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH VI THỂ Hình 4.18 Biểu mơ dày đứt nát (HE 10X) Hình 4.19 Hoại tử tế bào biểu mơ ruột (HE 20X) Hình 4.20 Tĩnh mạch chứa nhiều hồng Hình 4.21 Ruột thấm nước phù hạ cầu (HE 10X) niêm mạc ruột (HE 10X) Hình 4.22 Lơng nhung ruột đứt nát Hình 4.23 Thâm nhiễm tế bào viêm (HE 10X) ruột (HE 10X) 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4.24 Phổi nhiều tế bào viêm, tổ chức kẽ phổi tăng sinh (HE 10X) Hình 4.25 Sung huyết hạ niêm mạc ruột (HE 20X) Hình 4.26 Hồng cầu tràn lan hạch (HE 10X) Hình 4.27 Lơng nhung ruột tù đầu (HE 10X) 4.2 KẾT QUẢ NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH 4.2.1 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch Kết bệnh tích đại thể vi thể cho thấy tổn thương mà virus PED gây cho lợn Landrace tập trung chủ yếu ruột Do vậy, nghiên cứu này, ruột lựa chọn để áp dụng kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch Do có mặt virus tổ chức đem nhuộm hóa miễn dịch cho kết dương tính với xuất màu nâu vàng lát cắt tổ chức (màu DAB) (Hak-Mo et al., 2000) Như vậy, dựa vào xuất màu nâu vàng tiêu đánh giá vị trí virus cư trú mật độ virus phân bố Từ 22 lợn dương tính với virus PED, nghiên cứu chọn ca để áp dụng kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch Mỗi ca lấy mẫu ruột, tiến hành nhuộm hóa mơ miễn dịch Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch trình bày bảng 4.8 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.8 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch mẫu ruột lợn Landrace mắc PED Lợn Lợn Mẫu Mẫu +++ +++ Mẫu ++ Lợn Lợn Lợn Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 2 2 ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ĐC dương ĐC âm ++ - Ghi chú: -:Khơng có đám, hạt bắt màu nâu vàng; +: Đám, hạt bắt màu nâu vàng ++: Đám, hạt bắt màu nâu vàng trung bình; +++: Đám, hạt màu nâu vàng nhiều Kết cho thấy mẫu ruột dương tính với virus PED thể xuất đám màu nâu vàng Quan sát tiêu ruột nhuộm hóa mô miễn dịch thấy: Ở ruột, virus tập trung chủ yếu tế bào biểu mô, tuyến ruột có nhiều virus, vị trí lơng nhung bị đứt nát virus tập trung nhiều Điều giải thích lý lợn bị bệnh PED tế bào biểu mô ruột bị hoại tử tăng sinh nang lympho, lông nhung bị đứt nát virus tập trung nhân lên cơng gây nên tượng bệnh lý MỘT SỐ HÌNH ẢNH NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH Hình 4.28 Virus tế bào biểu mơ ruột Hình 4.29 Virus tập trung phần lơng nhung bị đứt nát Hình 4.30 Virus tế bào biểu mơ ruột Hình 4.31 Virus tập trung phần lông nhung bị đứt nát 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.2 So sánh kết nhuộm hóa mơ miễn dịch với phương pháp chẩn đốn khác Sau nhuộm hóa mơ miễn dịch, nghiên cứu thực đồng thời phương pháp RT-PCR phương pháp phân lập virus môi trường tế bào Vero – NIH nhằm so sánh kết phương pháp hố mơ miễn dịch với hai phương pháp Từ mẫu ruột lợn cho kết dương tính với virus PED phương pháp hố mơ miễn dịch, mẫu ký hiệu tương ứng R1, R2, R3, R4, R5 Mỗi mẫu nghiền nát chày cối vô trùng, phần tách chiết RNA phần xử lý để phân lập virus môi trường tế bào Vero - NIH RNA virus tách kit tách chiết QIAamp Sản phẩm thu sau tách khuếch đại kỹ thuật RT-PCR với tham gia enzym chép ngược (Reverse Transcrip) sử dụng cặp mồi phần gene S có khả phát virus PED (cặp mồi cho phép xác định đoạn gene virus PED có kích thước 561bp) Sản phẩm sau khuếch đại điện di Kết phản ứng RT-PCR xác định virus PED trình bày hình 4.32 M R1 R R3 R4 R5 Hình 4.32 Kết phản ứng RT-PCR Gen khuếch đại: phần gen S (651 bp) Mồi: PS1, PS2 Thang chuẩn M 100bp Giếng 1, 2, 3, 4, 5: mẫu ruột lợn mắc PED Giếng 6: đối chứng âm Giếng 7: đối chứng dương Kết điện di kết sản phẩm cho thấy tất mẫu ruột cho kết dương tính với virus PED Sản phẩm điện di cho vạch band tương ứng 651bp theo thiết kế mồi Việc phân lập virus PED thực môi trường tế bào VeroNIH Kết phân lập virus trình bày bảng 4.9 52 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 4.9 Kết phân lập virus PED môi trường tế bào Mẫu R1 R2 R3 R4 R5 Đời xuất P#2 P#3 - 12h - Thời gian xuất bệnh tích tế bào 24h 36h 48h 20% 50% 70% 10% 40% 75% - 60h 100% 100% - Ghi chú: - khơng có bệnh tích tế bào P (Passage) Đời cấy truyền Kết cho thấy phân lập chủng virus PED từ mẫu ruột lợn với bệnh tích tế bào điển hình virus PED (bệnh tích kiểu Syncytium hay thể hợp bào bệnh lý tế bào co cụm lại, hịa màng, bao quanh nhân tế bào bị phá hủy) MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH TẾ BÀO DO VIRUS PED GÂY RA TRÊN TẾ BÀO VERO-NIH Hình 4.32 Tế bào Vero bình thường Hình 4.33 Tế bào Vero bắt đầu có bệnh tích Hình 4.34 Bệnh tích tế bào phát triển Hình 4.35 Tế bào bị Phá hủy hoàn toàn 53 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau có kết chẩn đốn phương pháp hóa mơ miễn dịch (IHC), RT-PCR phân lập virus, nghiên cứu tiến hành so sánh kết phương pháp Kết so sánh thể bảng 4.10 Bảng 4.10 So sánh kết số phương pháp chẩn đoán virus PED Stt Ký hiệu mẫu Kết theo phương pháp chẩn đoán RT-PCR Phân lập virus IHC R1 R2 + + + - + + R3 R4 + + + - + + R5 + - + ĐC (+) + + + ĐC (-) - - - Ghi chú: + Dương tính - Âm tính ĐC (+): Đối chứng dương mẫu ruột non có chất chứa lợn mắc PED chẩn đoán dương tính phương pháp (RT-PCR, IHC, phân lập virus) ĐC (-): Đối chứng âm mẫu ruột lợn khỏe mạnh âm tính với PEDV Kết so sánh phương pháp (RT-PCR, IHC phân lập virus) với mẫu ruột cho thấy phương pháp RT-PCR IHC có kết giống (5/5 mẫu dương tính) Phương pháp phân lập có 2/5 mẫu dương tính Sự sai khác kết chẩn đốn phương pháp phương pháp có độ nhạy đặc hiệu khác Trong đó, phương pháp RT-PCR phát RNA virus nồng độ tương đối thấp Phương pháp IHC có khả phát kháng nguyên virus phân bố kháng nguyên virus quan, tổ chức lợn bệnh Phương pháp phân lập virus khơng phân lập mầm bệnh virus tồn với hàm lượng nhỏ trình bảo quản làm chết virus, hai phương pháp RT-PCR IHC phát virus Những mẫu virus PED phân lập thành công chủng virus PED phục vụ cho công tác nghiên cứu vacxin phịng bệnh PED Kết chúng tơi phù hợp với nghiên cứu tác giả Kim and Chae (2002) tác giả so sánh phương pháp chẩn đoán PED gồm RT-PCR, IHC lai chỗ (ISH) với 94 mẫu phân lợn theo mẹ Hà Quốc thu kết 87% mẫu phân dương tính với virus PED phương pháp IHC, 92% mẫu dương tính RT-PCR Trên thực tế, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà nhà khoa học lựa chọn phương pháp chẩn đoán phù hợp Đối với việc chẩn đoán nhanh giúp 54 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khống chế dịch bệnh xảy nên sử dụng phương pháp RT-PCR phương pháp cho kết nhanh xác vịng 24 Phương pháp IHC thời gian trả kết lâu (ít ngày) nên sử dụng nghiên cứu chế gây bệnh phân bố virus quan nội tạng lợn mắc PED Phương pháp phân lập virus thường sử dụng nghiên cứu sản xuất vắc xin sản xuất chế phẩm sinh học phòng bệnh 55 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đặc điểm bệnh lý 22 lợn chẩn đoán dương tính với virus PED phản ứng RT-PCR có biểu sau: - Bệnh xảy lợn tất lứa tuổi Triệu chứng đặc trưng tiêu chảy nặng, phân màu vàng chiếm tỷ lệ 100%; ủ rũ, mệt mỏi chiếm tỷ lệ 90,91% Ngoài cịn có triệu chứng: gầy cịm nước, da tính đàn hồi, nằm dồn đống, nơn mửa sốt - Bệnh tích đại thể lợn mắc PED tập trung chủ yếu đường tiêu hóa: Ruột: tất lợn mổ khám có tượng căng, phồng to, bên có chứa nhiều khí (chiếm tỷ lệ 100%) Đặc biệt ruột non (không tràng, hồi tràng), thành ruột mỏng nhìn thấy bên Chất chứa bên ruột chứa dịch lỏng màu vàng, lợn cợn lợn theo mẹ Ống dưỡng chấp căng phồng, màu đỏ, rõ Bộc lộ niêm mạc phía ruột thấy có tượng xuất huyết lan tràn Đây bệnh tích điển hình lợn mắc tiêu chảy virus PED Dạ dày: 77,27% lợn có bệnh tích dày căng phồng, bên có chứa thức ăn khơng tiêu, có có tượng xuất huyết, đặc biệt xuất huyết nặng lỗ hạ vị Bên cạnh bệnh tích khác hạch sưng, thận xuất huyết điểm thầy xuất nhiều ca bệnh Phổi viêm nhẹ ghi nhận có xuất - Bệnh tích vi thể lợn mắc PED chủ yếu ruột dày Các tổn thương vi thể ruột sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, lơng nhung bị ăn mịn, tăng sinh nang lympho hoại tử tế bào Tế bào niêm mạc dày bong tróc, viêm Biến đổi bệnh lý vi thể quan khác: hạch ruột, gan, thận, phổi xuất huyết, sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, hoại tử tế bào Nghiên cứu áp dụng thành cơng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch chẩn đốn bệnh PED lợn Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch ruột virus PED tập trung chủ yếu tế bào biểu mô lông nhung tổn thương tế bào tuyến ruột 56 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5.2 KIẾN NGHỊ Trong trình nghiên cứu, điều kiện có hạn, chúng tơi áp dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch chẩn đốn bệnh PED ruột Để có tranh tổng thể vị trí khu trú virus tất quan cần tiếp tục áp dụng phương pháp IHC tất quan, tổ chức khác lợn mắc bệnh PED 57 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng Lê Ngọc Mỹ (1995) Bệnh đường tiêu hóa lợn NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2009) Giáo trình miễn dịch học thú y NXB Nông nghiệp pp 79 – 84 Nguyễn Như Pho (2003) Bệnh tiêu chảy heo NXB Nơng nghiệp TP.Hồ Chí Minh., TP Hồ Chí Minh Nguyễn Tất Tồn, Nguyễn Đình Qt, Trịnh Thị Thanh Huyền, Đỗ Tiến Duy, Trần Thị Dần, Nguyễn Thị Phước Ninh Nguyễn Thị Thu (2012) Phát virus gây tiêu chảy cấp (PED) heo tỉnh miền Đông Nam Bộ Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Lan Nguyễn Bá Hiên (2015) Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý đặc tính sinh học phân tử virus gây bệnh tiêu chảy thành dịch lợn (Porcine Epidemic diarrhea virus - PEDV) lưu hành miền Bắc Việt Nam Đề tài cấp nông nghiệp Nguyễn Văn Điệp Nguyễn Thị Lan (2012) Tiêu chảy thành dịch lợn (Porcine Epidemic Diarrhea) thông tin cho cơng tác chẩn đốn, phịng trị bệnh Tạp chí khoa học thú y Tiếng Anh: Boenisch T (2002) Staining methods Immunochemical Staining Methods HANDBOOK 3rd ed California, USA: DakoCytomation-Carpinteria, CA, USA Vol pp 26-31 Bridgen A., M Duarte, K Tobler, H Laude and M Ackermann (1993) Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus Journal of general virology Vol 74 (9) pp 1795-1804 Callebaut P., P Debouck and M Pensaert (1982) Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea Veterinary microbiology Vol (4) pp 295-306 10 Carvajal A., I Lanza, R Diego, P Rubio and P Cármenes (1995) Seroprevalence of porcine epidemic diarrhea virus infection among different types of breeding swine farms in Spain Preventive Veterinary Medicine Vol 23 (1-2) pp 33-40 58 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 11 Chae C., O Kim, C Choi, K Min, W Cho, J Kim and J Tai (2000) Prevalence of porcine epidemic diarrhoea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs Veterinary Record Vol 147 (21) pp 606-608 12 Coons A H., H J Creech and R N Jones (1941) Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine Vol 47 (2) pp 200-202 13 Debouck P and M Pensaert (1980) Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus, CV 777 American journal of veterinary research Vol 41 (2) pp 219-223 14 Debouck P., M Pensaert and W Coussement (1981) The pathogenesis of an enteric infection in pigs, experimentally induced by the coronavirus-like agent, CV 777 Veterinary Microbiology Vol (2) pp 157-165 15 Duarte M and H Laude (1994) Sequence of the Spike Srotein of the Porcine Epidemic Diarrhoea Virus Journal of general virology Vol 75 (5) pp 11951200 16 Ducatelle R., W Coussement, P Debouck and J Hoorens (1982) Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis in piglets II Electron microscopic study Veterinary pathology Vol 19 (1) pp 57-66 17 Faulk W P and G M Taylor (1971) Communication to the editors: an immunocolloid method for the electron microscope Immunochemistry Vol (11) pp 1081-1083 18 Hak-Mo L., L Beom-Jun, C.-H Kweon, L Yong-Soon and P Jae-Hak (2000) Detection of porcine epidemic diarrhea virus by immunohistochemistry with recombinant antibody produced in phages Journal of Veterinary Medical Science Vol 62 (3) pp 333-337 19 Hofmann M and R Wyler (1988) Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture Journal of clinical microbiology Vol 26 (11) pp 22352239 20 Jung K., Q Wang, K A Scheuer, Z Lu, Y Zhang and L J Saif (2014) Pathology of US porcine epidemic diarrhea virus strain PC21A in gnotobiotic pigs Emerg Infect Dis Vol 20 (4) 21 Kim O and C Chae (2002) Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs Canadian journal of veterinary research Vol 66 (2) pp 112 59 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 22 Kocherhans R., A Bridgen, M Ackermann and K Tobler (2001) Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence Virus genes Vol 23 (2) pp 137-144 23 Kweon C.-H., L Jae-Gil, H Myung-Guk and K Yung-Bai (1997) Rapid diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus infection by polymerase chain reaction Journal of veterinary medical science Vol 59 (3) pp 231-232 24 Mason D and R Sammons (1978) Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labelling of cellular constituents Journal of clinical pathology Vol 31 (5) pp 454-460 25 Murphy F A., E P J Gibbs, M C Horzinek and M J Studdert (1999) Veterinary virology Academic press 26 Nakane and Pierce (1966) Enzyme-labelled antibodies: preparation and application to the localization of antigens J Histochem Cytochem Vol pp 929-931 27 Park S.-J., H.-J Moon, J.-S Yang, C.-S Lee, D.-S Song, B.-K Kang and B.-K Park (2007) Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea Virus genes Vol 35 (2) pp 321-332 28 Pensaert M (1998) Porcine epidemic diarrhea In: Diseases of swine, (eds.), Iowa State University Press, Chapter, pp 179-185 29 Pensaert M., P Debouck and D Reynolds (1981) An immunoelectron microscopic and immunofluorescent study on the antigenic relationship between the coronavirus-like agent, CV 777, and several coronaviruses Archives of virology Vol 68 (1) pp 45-52 30 Pospischil A., R Hess and P Bachmann (1981) Light microscopy and ultrahistology of intestinal changes in pigs infected with epizootic diarrhoea virus (EVD): comparison with transmissible gastroenteritis (TGE) virus and porcine rotavirus infections Zoonoses and Public Health Vol 28 (7) pp 564577 31 Rodak L., L Valíček, B Šmíd and Z Nevorankova (2005) An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces Veterinary microbiology Vol 105 (1) pp 9-17 32 Schwartz K J and R D Glock (1978) Rotavirus Infections in Swine Iowa State University Veterinarian Vol (3) pp 104-111 33 Shibata I and O Masaaki (2001) Passive protection against porcine epidemic diarrhea (PED) virus in piglets by colostrum from immunized cows Journal of Veterinary Medical Science Vol 63 (6) pp 655-658 60 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Shibata I., T Tsuda, M Mori, M Ono, M Sueyoshi and K Uruno (2000) Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs of different ages Veterinary microbiology Vol 72 (3) pp 173-182 35 Stites D P., D J Stobo and V J Wells (1987) Basic & clinical immunology 36 Sueyoshi M., T Tsuda, K Yamazaki, K Yoshida, M Nakazawa, K Sato, T Minami, K Iwashita, M Watanabe and Y Suzuki (1995) An immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhoea Journal of comparative pathology Vol 113 (1) pp 59-67 37 Toan N T., S Puranaveja and R Thanawongnuwech (2011) Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks The Thai Journal of Veterinary Medicine Vol 41 (1) pp 55 61 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Yến Tên Luận văn: Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) lợn Landrace áp dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch chẩn đốn bệnh Chuyên ngành:... YẾU CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 37 4.1.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ ĐẠI THỂ CỦA LỢN LANDRACE MẮC PED 41 4.1.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VI THỂ CỦA LỢN LANDRACE. .. điểm bệnh lý bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) lợn Landrace áp dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch chẩn đốn bệnh? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Giúp chẩn đốn nhanh xác bệnh virus PED gây lợn 1.3