Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 3 doc

54 nhuộm bổ sung nhuộm bổ sung Kết đƣợc đọc dƣới KHV quang học cách đọc nhƣ sau: Mẫu dƣơng tính: vùi nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, tế bào không bị nhiễm virus cấu trúc mơ bình thƣờng, nhân không bị trƣơng to bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam) Mẫu âm tính khơng có màu xanh đen, bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) có màu cam sau q trình Hình 4.5: Đối chứng âm Hình 4.6: Đối chứng dƣơng gan tụy tôm lớn, X40 mang tôm lớn, X10 Hình 4.7: ISH phát WSSV Hình 4.8: ISH phát WSSV mẫu gan tụy tôm lớn, X10 mẫu mang tôm lớn, X40 lai 55 Nhƣ sau hai lần thực thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy mẫu 1, 2, có kết mơ học PCR dƣơng tính cho kết ISH dƣơng tính đối chứng với mẫu đối chứng dƣơng đối chứng âm, xác suất trùng hợp ba phƣơng pháp 100% (3/3) Mẫu số sau lai cho kết tƣơng đối mờ q trình thao tác chúng tơi rửa mẫu chƣa đƣợc lắm, lát cắt mẫu lame sau lai bị dơ Điều q trình bắt cặp khơng đặc hiệu probe trình tự khơng phải DNA đích mẫu mơ, tạo tín hiệu thời gian cắt mẫu với Proteinase K lâu, thao tác nhuộm màu bổ sung chƣa tốt Trong trình thực hiện, ta thấy mẫu đối chứng âm sau hai lần thí nghiệm khơng xuất thể kết tủa màu xanh đậm nhân, không bị ngoại nhiễm khơng có tƣợng dƣơng tính giả; đối chứng dƣơng cấu trúc mơ rõ ràng, tín hiệu lai thu đƣợc nhiều rõ quan sát dƣới KHV quang học chứng tỏ trình lai đƣợc tiến hành tốt khơng bị ngoại nhiễm Trên sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, nhận thấy khả chẩn đốn bệnh đốm trắng tơm sú phƣơng pháp hiệu quả, với độ xác cao kết thu đƣợc ổn định Do đó, tiến hành ứng dụng phƣơng pháp để chẩn đốn phát mầm bệnh đốm trắng tơm sú nuôi giai đoạn postlarvae thƣơng phẩm góp phần vào việc kiểm sốt hạn chế kịp thời tác hại WSSV mang lại Chẩn đoán theo phƣơng pháp khắc phục đƣợc tính đặc hiệu mô học tránh đƣợc tƣợng dƣơng tính giả PCR IV.2.2 Kết ứng dụng kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng phịng thí nghiệm IV.2.2.1 Kết thí nghiệm theo quy trình kit có thay đổi số hóa chất thơng dụng khơng có kit Theo cách bố trí chúng tơi thực lại thí nghiệm ba mẫu tôm 1, trên, đối chứng dƣơng đối chứng âm Ở đây, dùng cồn tuyệt đối (Việt Nam), xylene paraformaldehyde (Trung Quốc) quy trình lai Sau thực thí nghiệm, chúng tơi thu đƣợc kết sau: 56 Bảng 4.9: Kết thí nghiệm thực theo quy trình có thay đổi hố chất Mẫu Mơ WSSV học + ISH PCR + Lần Mẫu dƣơng (+) rõ Mẫu dƣơng (+) rõ khi quan sát dƣới KHV Mẫu dƣơng (++), lát cắt ++ ++ Lần mẫu lame không bị trôi rõ quan sát dƣới KHV quan sát dƣới KHV Mẫu dƣơng (++), cấu trúc mô rõ quan sát dƣới KHV Mẫu dƣơng (+++), lát cắt Mẫu dƣơng (+++), cấu +++ +++ không bị trôi nhuộm trúc mô rõ quan sát màu rõ Đối chứng Mẫu dƣơng (+++), cấu Mẫu dƣơng (+++), cấu +++ +++ dƣơng âm trúc mô rõ nhuộm trúc mô rõ lát cắt màu tốt Đối chứng dƣới KHV khơng bị trơi Khơng phát tín hiệu Khơng phát tín hiệu - - lai, mẫu khơng bị nhiễm lai, mẫu không bị nhiễm bẩn bắt màu thuốc bẩn bắt màu thuốc 57 nhuộm bổ sung nhuộm bổ sung Sau thực thí nghiệm này, nhận thấy tiến hành lai theo trƣờng hợp cho kết lai tốt ba mẫu hai đối chứng quan sát dƣới KHV quang học Kết thí nghiệm dựa vào phƣơng pháp ISH cho kết trùng hợp hoàn toàn với mô học PCR, xác suất trùng hợp đạt đến 100% (3/3) Nhìn chung kết mà chúng tơi thu đƣợc khơng có khác biệt nhiều thí nghiệm theo quy trình hóa chất kit với thí nghiệm theo quy trình kit nhƣng có thay đổi số hóa chất thơng dụng rẻ tiền Đây bƣớc thành công mới, tạo tiền đề cho việc phát triển phƣơng pháp ISH phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Viện Do đó, chúng tơi sử dụng hố chất thay thí nghiệm sau để giảm bớt chi phí chẩn đốn phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Viện IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh Mẫu sau thu phịng thí nghiệm đƣợc tiến hành xử lý nhanh dùng chung cho kiểm tra mô học ISH Mẫu đƣợc xử lý, đúc cắt đính lame, hai lame dùng để nhuộm kiểm tra mơ học hai lame cịn lại dùng cho ISH Sau thực chẩn đoán mô học truyền thống PCR cho kết dƣơng tính, mẫu đƣợc dùng để lai theo quy trình kit Chúng tơi tiến hành mẫu tôm postlarvae mẫu tôm thƣơng phẩm thu đƣợc kết nhƣ sau: Kết tơm postlarvae Bảng 4.10: Kết thí nghiệm xử lý mẫu nhanh tôm postlarvae Mẫu Mô học ISH PCR Lần Lần Nhận xét + + + + Cấu trúc mô mẫu mờ + + + + Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi + + + + Mẫu rõ, nhuộm màu tốt + + + + Mẫu lai bị mờ + + + + Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ 58 Đối chứng +++ +++ +++ +++ dƣơng Đối chứng Mẫu rõ, cấu trúc mô rõ quan sát dƣới KHV Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp mẫu - - - - âm nhuộm màu thuốc nhuộm bổ sung Kết tôm thƣơng phẩm Bảng 4.11: Kết thí nghiệm xử lý mẫu nhanh tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học ISH PCR Lần Nhận xét Lần Cấu trúc mô mẫu rõ, nhuộm + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi + + + + Mẫu rõ, nhuộm màu tốt + + + + Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ + + + + +++ +++ +++ +++ - - - - Đối chứng dƣơng Đối màu tốt Cấu trúc mô mờ, lát cắt không bị trôi Mẫu rõ, cấu trúc mô rõ quan sát dƣới KHV Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp mẫu 59 chứng nhuộm màu thuốc nhuộm bổ âm sung Qua hai bảng kết chúng tơi nhận thấy kết chẩn đốn thu đƣợc từ ba phƣơng pháp trùng hợp hoàn toàn với Ở hai mẫu tôm postlarvae (mẫu 4) mẫu tôm thƣơng phẩm (mẫu 5) xử lý nhanh cho kết lai chƣa tốt số khâu quy trình xử lý mẫu chƣa đƣợc thực tốt Mẫu số postlarvae mẫu số tôm thƣơng phẩm cho kết lai tốt, nhƣng cấu tạo mơ khơng rõ ta thực xử lý mẫu chƣa tốt làm hƣ cấu tạo mơ Điều trình lai, cắt mẫu Proteinase K lâu thao tác cắt mẫu chƣa đƣợc thực tốt nên cấu trúc mẫu mô khơng cịn rõ nhƣ ban đầu Hình 4.9: Mẫu mơ học ISH làm theo quy trình xử lý nhanh Nhƣ qua hai lần thực thí nghiệm nhƣ trên, thu đƣợc kết lai dƣơng tính Khi đối chiếu với kết lai trƣờng hợp mẫu xử lý theo quy trình bình thƣờng, nhận thấy kết lai hai quy trình xử lý mẫu khơng khác Các mẫu làm theo quy trình xử lý nhanh, quan sát dƣới kính hiển vi cho kết tƣơng đối rõ đẹp Nếu làm theo quy trình xử lý mẫu nhanh trình xử lý mẫu khoảng – thay trƣớc chúng tơi làm theo quy trình xử lý mẫu bình thƣờng khoảng 12,5 giờ, thời gian đƣợc rút ngắn nhiều nhƣng kết lai không khác Do đó, áp dụng quy trình xử lý nhanh chẩn đoán phƣơng pháp ISH, giúp rút ngắn đƣợc thời gian nhiều 60 Quy trình xử lý mẫu nhanh có ƣu điểm rút ngắn đƣợc thời gian xử lý mẫu nhiều, nhiên có số nhƣợc điểm so với phƣơng pháp xử lý mẫu bình thƣờng Mẫu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp dễ bị hƣ cấu trúc mô, nguyên nhân cố nƣớc mẫu mơ chƣa đƣợc khử hồn tồn làm cho mô tế bào bị co lại làm thành phần cấu tạo mô bị thay đổi Một lý khác làm hƣ cấu trúc mô cồn mơ khơng đƣợc tẩy hồn tồn, mẫu mơ khơng suốt nên khó quan sát cấu tạo mơ dƣới kính hiển vi Cả giai đoạn khử nƣớc tẩy cồn khỏi mô không đƣợc thực tốt giai đoạn ngấm paraffin bị thất bại Do đó, áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh, ta phải thật cẩn thận thao tác, làm tốt giai đoạn định nhƣ giai đoạn chuyển từ cồn tuyệt đối qua xylene từ xylene qua paraffin Nếu tuân thủ bƣớc này, mẫu mô thu đƣợc sau xử lý giống với mẫu mơ xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu probe trước lai Nếu lai theo quy trình kit probe phải đƣợc biến tính 95 0C 10 phút, làm lạnh nhanh giữ 40C cho lên mô lai Khi lai, ta cho mẫu dị lên mẫu mơ thực biến tính lần 950C phút Trong thí nghiệm này, chúng tơi thực biến tính mẫu lai probe đồng thời lame 950C phút Quy trình đƣợc thực bàn lai có điều chỉnh nhiệt độ Mẫu thực thí nghiệm đƣợc xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng đƣợc phƣơng pháp mơ học PCR xác nhận dƣơng tính với WSSV Thí nghiệm thực nhƣ bố trí thu đƣợc kết sau hai lần thực nhƣ sau: Kết tơm postlarvae Bảng 4.12: Kết thí nghiệm biến tính mẫu probe trƣớc lai postlarvae ISH Mẫu Mô học PCR + + Lần Lần + + Nhận xét Mẫu rõ, lát cắt lame 61 không bị trôi + + + + Mẫu bị dơ + + - - Không phát + + + + + + + + +++ +++ +++ +++ - - - - Đối chứng dƣơng Đối chứng âm Mẫu rõ, lát cắt lame không bị trôi Mẫu rõ Mẫu rõ, cấu trúc mơ giữ đƣợc hình dạng đầu Mẫu khơng bị nhiễm tạp Kết tôm thƣơng phẩm Bảng 4.13: Kết thí nghiệm biến tính mẫu probe trƣớc lai tôm thƣơng phẩm ISH Mẫu Mô học PCR + Lần Lần + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Nhận xét Mẫu rõ, lát cắt lame không bị trôi Mẫu mờ Mẫu rõ nhƣng màu bổ sung nhuộm không rõ Mẫu rõ, lát cắt lame không bị trôi Mẫu rõ, lát cắt lame 62 không bị trôi Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Mẫu lai tốt, cấu trúc mơ giữ đƣợc hình dạng đầu Mẫu không bị nhiễm tạp, Đối chứng âm - - - - cấu trúc mô rõ nhuộm màu bổ sung Sau hai lần lặp lại thí nghiệm nhƣ trên, ta thấy kết thực chẩn đoán ISH theo cách biến tính mẫu probe lame trƣớc lai nhƣ đa số cho kết trùng hợp với phƣơng pháp mô học PCR Chỉ có trƣờng hợp mẫu số tôm postlarvae cho kết lai ISH âm kết mơ học PCR dƣơng tính Điều mẫu dị bị bất hoạt nên không bắt cặp đƣợc với trình tự đích có mẫu, nhƣng khả xảy đối chứng dƣơng chúng tơi nhận đƣợc tín hiệu lai tốt Sự khơng phù hợp trình làm PCR bị ngoại nhiễm làm mơ học bị nhầm lẫn với tác nhân gây bệnh khác nhƣng có biểu tƣơng tự nhƣ bệnh đốm trắng Dựa vào kết trên, ta thấy tỷ lệ tƣơng thích phƣơng pháp ISH thực theo quy trình biến tính mẫu probe đồng thời lame với mô học PCR 90% (9/10), tỷ lệ cao xác Khi so sánh với trƣờng hợp lai bình thƣờng theo quy trình kit, hình dạng cấu trúc mô không khác hai trƣờng hợp chúng tơi quan sát dƣới kính hiển vi quang học Do đó, áp dụng quy trình biến tính mẫu probe đồng thời mẫu mơ thực lai Cách làm vừa đơn giản, dễ thực lại vừa tránh đƣợc khả gây sốc probe lai, probe đƣợc biến tính lần thay hai lần nhƣ quy trình kit IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu probe trước lai Sau thực lai theo trƣờng hợp riêng rẽ, thu đƣợc kết tốt, nhƣng áp dụng đồng thời hai quy trình vào chẩn đốn cho kết sao? Do chúng tơi kết hợp hai quy trình để chẩn đốn bệnh đốm trắng, thực mẫu tôm thƣơng phẩm mẫu tơm postlarvae 63 có kết mơ học PCR dƣơng tính với WSSV Kết sau hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Kết tơm postlarvae Bảng 4.14: Kết thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu probe trƣớc lai tôm postlarvae ISH Mẫu Mô học PCR + Nhận xét Lần Lần + + + + + + + + + + + + + + + Mẫu bị dơ + + + + Mẫu rõ Tín hiệu lai rõ, khơng có màu Cấu trúc mô rõ, màu bổ sung nhuộm tốt Mẫu rõ, lát cắt lame không bị trôi Kết lai tốt, cấu Đối chứng +++ dƣơng +++ +++ +++ trúc mô rõ đẹp, khơng có màu Đối chứng âm - - - - Mẫu không bị nhiễm tạp, nhuộm màu bổ sung Kết tôm thƣơng phẩm Bảng 4.15: Kết thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu probe trƣớc lai tơm thƣơng phẩm ISH Mẫu Mô học PCR + + Lần Lần + + Nhận xét Mẫu rõ, lát cắt lame 71 Để thực bố trí này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm 15 mẫu tơm postlarvae 15 mẫu tơm thƣơng phẩm có biểu nhiễm bệnh nhƣ ăn ít, rớt đáy… Các mẫu đƣợc thu trại sản xuất giống ao ni tơm thƣơng phẩm tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu thực chẩn đoán đồng thời phƣơng pháp mô học, PCR, ISH Kết thu đƣợc nhƣ sau: IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae Bảng 4.18: Kết thí nghiệm so sánh ISH với mơ học PCR postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH + ++ + ++ - + + - - + + + - + - + + + + - + - + + + + + 10 + + + 11 - + + 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - 72 IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm Bảng 4.19: Kết thí nghiệm so sánh ISH với mơ học PCR tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH +++ - +++ + ++ ++ + ++ ++ + ++ + + + + + + + - - - - - - - - - 10 - - - 11 + + - 12 + + + 13 - + + 14 - + + 15 + + + Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - Qua kết thực chẩn đoán so sánh phƣơng pháp với thu đƣợc số kết định nhƣ sau: 73 Ở tơm thƣơng phẩm đa số kết thu đƣợc từ ba phƣơng pháp tƣơng đồng với (mức độ tƣơng đồng mô học với PCR 80% (12/15), mô học với ISH 80% (12/15), PCR với ISH 87% (13/15) ba phƣơng pháp 73% (11/15)); nhƣng tôm postlarvae kết ba phƣơng pháp có chênh lệch nhiều (mức độ tƣơng đồng mô học với PCR 60% (9/15), mô học với ISH 80% (12/15), PCR với ISH 80% (12/15) ba phƣơng pháp 60% (9/15)) Mặc dù có khác biệt nhƣng nhìn chung, đa số kết chẩn đoán ba phƣơng pháp trùng hợp với nhau, điều giúp thấy đƣợc độ ổn định phƣơng pháp áp dụng chẩn đốn mầm bệnh tơm Với kết phƣơng pháp PCR ISH dƣơng nhƣng mô học âm mẫu số 8, 11 tôm postlarvae mẫu 13, 14 tôm thƣơng phẩm Hiện tƣợng có khả tỷ lệ cƣờng độ nhiễm WSSV tôm thấp, bệnh biểu số tế bào Trong q trình nhuộm mơ, lát cắt mơ có kích thƣớc nhỏ nên khơng qua hết tế bào bị nhiễm bệnh nên có khả khơng tìm thấy bệnh Ngồi với phƣơng pháp mơ học, ta xác định đƣợc bệnh bệnh biểu tế bào, giai đoạn bệnh phát dấu hiệu bệnh lý chƣa đƣợc biểu bào quan mơ học khơng thể định dạng đƣợc bệnh Trong đó, với phƣơng pháp PCR ISH cần tơm có dấu hiệu bệnh dù giai đoạn đầu qua trình nhiễm bệnh PCR ISH xác định đƣợc bệnh Qua ta nói đƣợc phƣơng pháp PCR ISH có độ nhạy cao mô học truyền thống Trƣờng hợp PCR ISH âm nhƣng mô học dƣơng nhƣ mẫu số tơm portlarvae Hiện tƣợng có tác nhân gây bệnh khác có biểu bệnh lý tế bào tƣơng tự nhƣ dấu hiệu bệnh lý bệnh đốm trắng Do đó, phƣơng pháp mơ học ta dễ nhầm lẫn việc phát mầm bệnh WSSV tôm sú P monodon Điều khẳng định lần phƣơng pháp mơ học có độ xác PCR ISH Trƣờng hợp PCR cho kết dƣơng tính nhƣng ISH mơ học cho kết âm tính mẫu số postlarvae Điều hai khả Thứ ngoại nhiễm q trình làm PCR primer bắt cặp khơng đặc hiệu với DNA tác nhân gây bệnh Thứ hai mẫu dò (probe) bị bất hoạt nên không phát 74 đƣợc tác nhân gây bệnh phƣơng pháp mô học tôm bị nhiễm bệnh giai đoạn đầu, bệnh chƣa biểu bào quan nên mô học không phát đƣợc bệnh Cả hai khả xảy nhƣng xác suất khả thứ xảy cao thực PCR dễ bị ngoại nhiễm thực lai chúng tơi có làm đối chứng dƣơng kèm theo thu đƣợc tín hiệu lai đối chứng dƣơng Chúng tiến hành kiểm tra lại mẫu phƣơng pháp ISH lần nữa, kết thu đƣợc trùng hợp với kết ban đầu, chứng tỏ phƣơng pháp PCR bị dƣơng tính giả Trƣờng hợp PCR cho kết âm tính nhƣng mơ học ISH cho kết dƣơng tính nhƣ mẫu số 2, tơm postlarvae mẫu tôm thƣơng phẩm Điều q trình tách chiết DNA, DNA tách chiết bị dơ nồng độ thấp không đủ để thực phản ứng khuếch đại Hiện tƣợng probe kit bắt cặp khơng đặc hiệu, tạo tín hiệu dƣơng tính giả Nhƣng chúng tơi lặp lại thí nghiệm lần thứ hai ISH cho kết trùng hợp với kết ban đầu nhƣng PCR lại cho kết dƣơng tính Điều cho thấy phƣơng pháp ISH có độ đặc hiệu cao PCR mô học 75 A D B E C F Hình 4.12: Một số hình ảnh thu đƣợc chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng đồng thời ba phƣơng pháp Hình A: ISH dƣơng tính mang tơm postlarvae, X40; hình B: ISH âm tính mang tơm postlarvae, X40; hình C: ISH dƣơng tính mắt tơm poslarvae, X40; hình D: mơ học dƣơng tính mang tơm lớn, X40; hình E: ISH dƣơng tính chân bơi tơm lớn, X40; hình F: ISH dƣơng tính gan tụy tơm lớn, X10 Qua thí nghiệm chúng tơi thấy đƣợc virus đốm trắng nhiễm vào tổ chức nhƣ mang, gan tụy, dày, ruột, phụ bộ…của thể tôm bị bệnh, nhƣng mang quan bị virus công nhiều Đa số mẫu lai thu đƣợc rõ, có tín hiệu nền, quan tôm thấy rõ nên phƣơng pháp hữu hiệu dùng để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng tôm sú IV.5 Nhận xét chung Sau thực chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon TSV P vannamei, chúng tơi có số nhận xét sau: Do probe mà kit cung cấp có dạng DNA mạch đơi nên thực chẩn đốn mầm bệnh WSSV dễ dàng probe WSSV có cấu trúc DNA mạch đơi Do đó, chúng tơi bỏ qua giai đoạn biến tính probe riêng mà thực biến tính mẫu probe đồng thời lame Ở mầm bệnh TSV hai thao tác phải thực tách riêng 76 Tín hiệu lai mà chúng tơi nhận đƣợc tiêu WSSV rõ ràng nhiều tín hiệu lai từ tiêu TSV Sở dĩ nhƣ virus đốm trắng có vật chất di truyền DNA nên DNA virus tập trung nhân làm cho nhân trƣơng to; tín hiệu lai tạp trung nhân đậm nhiều Còn TSV, virus RNA nên RNA virus tập trung tế bào chất, tín hiệu lai nhận đƣợc khơng tập trung, rải rác tế bào chất nên tín hiệu lai mờ, khơng rõ nhƣ WSSV ISH thực DNA đơn giản nhiều thực RNA Quy trình ISH chuẩn dùng nghiên cứu gồm năm bƣớc chính: chuẩn bị probe, chuẩn bị mẫu mơ, xử lý mẫu trƣớc lai, lai rửa mẫu bƣớc sau phát tín hiệu sau lai Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng kit công ty Diagxotics Mỹ cung cấp, nên không trải qua bƣớc chuẩn bị probe mà sử dụng probe DNA mạch đôi đƣợc đánh dấu Digoxigenin cơng ty cung cấp Vì probe DNA mạch đơi nên biến tính probe hai mạch đơi ln có xu hƣớng tái bắt cặp lại với nhau, độ nhạy phƣơng pháp lai không cao Ngồi ra, thí nghiệm chúng tơi dùng dung dịch cố định mẫu Davidson tôm sú, dung dịch cố định tạo kết tủa protein để bảo tồn DNA tế bào trì hình dạng ban đầu mẫu mơ Tuy nhiên, thành phần dung dịch có chứa acid nên khả bảo tồn lƣợng DNA hình dạng mẫu ban đầu chƣa tốt (Hasson ctv, 1997) nên số mẫu lai bị mờ không giữ đƣợc hình dạng ban đầu Trƣớc lai, chúng tơi thực xử lý mẫu nhằm mục đích tăng khả bắt cặp probe với trình tự đích mẫu giảm tín hiệu khơng mong muốn Ở đây, sử dụng Proteinase K nồng độ μg/ml để xử lý làm mềm mẫu, thời gian cắt mẫu với Proteinase K thích hợp 15 phút tôm postlarvae 17 phút tôm thƣơng phẩm Nếu thời gian cắt vƣợt mức hình dạng ban đầu mẫu khơng trì đƣợc chí mẫu mơ, nhƣng thời gian cắt q thấp probe xâm nhập vào mẫu lai với trình tự đích khơng tốt nên tín hiệu lai bị mờ (Baumgart E., Schad A ctv,1997) Quá trình lai thực 420C ủ qua đêm thuận lợi cho probe tìm bắt cặp với trình tự DNA đích mẫu (Altar C.A ctv, 1989) Mẫu sau lai đƣợc rửa dung dịch SSC với nồng độ giảm dần phát tín lai chất NBT/BCIP IV.6 Những thuận lợi khó khăn 77 Trong q trình thực thí nghiệm trên, chúng tơi gặp số thuận lợi khó khăn sau: IV.6.1 Thuận lợi Mẫu bị tạp nhiễm thao tác mẫu Phƣơng pháp đặc hiệu, không bị nhầm lẫn với mầm bệnh khác Có thể thực chẩn đốn đồng thời nhiều mẫu IV.6.2 Khó khăn Mẫu dễ bị trơi thao tác bơm hóa chất lên mẫu với áp lực mạnh Mẫu dễ bị khơ q trình làm, thao tác chậm Nhuộm màu chƣa làm bậc đƣợc mẫu hóa chất nhuộm bị hoạt tính Proteinase K bị hoạt tính tan giá lặp lại nhiều lần Probe đoạn DNA mạch đôi nên độ nhạy loại probe khác Đối với mẫu có mức độ nhiễm bệnh thấp, tín hiệu lai phát yếu nên gặp khó khăn phát dƣới kính hiển vi quang học IV.7 Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp In situ hybridization IV.7.1 Ƣu điểm Độ đặc hiệu phƣơng pháp cao Phƣơng pháp khơng bị tạp nhiễm nhƣ PCR Chúng ta chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu IV.7.2 Nhƣợc điểm Mẫu dễ bị hƣ trình làm Đối với mẫu nhiễm virus với nồng độ thấp, tín hiệu lai phát yếu nên khó khăn quan sát dƣới kính hiển vi quang học 78 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ V.1 Kết luận V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei - Sau thử nghiệm khả chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei phƣơng pháp In Situ hybridization theo quy trình kit, chúng tơi nhận thấy phƣơng pháp áp dụng để chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei hiệu xác cao 79 - Trong q trình thực thí nghiệm chúng tơi tìm đƣợc quy trình In Situ hybridization tối ƣu áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm Viện nhƣ sau: Dùng dung dịch cố định mẫu R-F (RNA – friendly) để cố định mẫu tốt sử dụng dung dịch Davidson Mẫu probe dung dịch lai đƣợc biến tính riêng Nhiệt độ biến tính probe 950C 10 phút nhiệt độ biến tính mẫu 700C phút tốt Thời gian cắt mẫu với Proteinase K thích hợp 15 phút tôm postlarvae 17 phút tơm thƣơng phẩm Thể tích dung dịch lai sử dụng tốt 75 µl tơm postlarvae tơm thƣơng phẩm - Ứng dụng quy trình lai vừa tìm đƣợc để phát mầm bệnh TSV P vannamei giai đoạn khác (postlarvae, tôm thƣơng phẩm) cho thấy độ nhạy, độ ổn định, độ đặc hiệu xác cao phƣơng pháp - Thực chẩn đoán so sánh phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp mơ học PCR chẩn đốn mầm bệnh TSV P vannamei, nhận thấy phƣơng pháp ISH có độ nhạy, độ ổn định xác cao phƣơng pháp mơ học PCR V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon - Thử nghiệm lại quy trình In Situ hybridization việc chẩn đốn mầm bệnh WSSV tôm sú P monodon cách hiệu quả, từ cho thấy tính ổn định, độ nhạy độ xác phƣơng pháp dùng chẩn đốn mầm bệnh đốm trắng tơm sú - Trong q trình thực thí nghiệm chúng tơi tìm đƣợc quy trình In Situ hybridization tối ƣu để chẩn đốn WSSV áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm Viện nhƣ sau:  Thay hóa chất thơng dụng nhƣ cồn, xylene paraformaldehyde khơng có kit hóa chất Trung Quốc Việt Nam sản xuất với giá thành tƣơng đối rẻ hơn, nên giảm đƣợc chi phí thực chẩn đoán phù hợp 80 điều kiện phịng thí nghiệm Mơ học TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB Viện  Tìm đƣợc quy trình ISH áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm nhƣ áp dụng kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với việc biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai, giúp rút ngắn đƣợc thời gian chẩn đoán thao tác đơn giản quy trình kit - Ứng dụng quy trình vừa tìm đƣợc để phát mầm bệnh đốm trắng tôm sú giai đoạn khác (postlarvae, tôm thƣơng phẩm) cho thấy độ nhạy, độ ổn định, độ đặc hiệu xác cao phƣơng pháp - Thực chẩn đốn so sánh phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp mơ học PCR chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon, chúng tơi nhận thấy phƣơng pháp ISH có độ nhạy, độ ổn định xác cao phƣơng pháp mô học PCR Phƣơng pháp ISH khắc phục đƣợc nhƣợc điểm xác mơ học khắc phục đƣợc nhƣợc điểm dƣơng tính giả PCR - Chi phí phân tích mẫu tơm ISH khoảng 100.000 đồng/mẫu, đắc mô học 50.000 đồng/mẫu nhƣng rẻ PCR 140.000 đồng/mẫu Kết hợp với kết nhƣ trên, nhận thấy phƣơng pháp ISH có khả ứng dụng chẩn đốn mầm bệnh WSSV tôm sú P mondon V.2 Đề nghị Trong phạm vi giới hạn đề tài, thu đƣợc số kết định mở số nghiên cứu sâu Vì vậy, chúng tơi có số đề nghị sau: Tiếp tục kiểm tra mầm bệnh WSSV TSV số lƣợng lớn tôm postlarvae tôm thƣơng phẩm phƣơng pháp ISH, mô học PCR để chứng minh cách xác thuyết phục hiệu quả, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định mức độ xác phƣơng pháp ISH so với hai phƣơng pháp cịn lại Thay dần hóa chất kit hóa chất tự tổng hợp áp dụng chẩn đoán, linh hoạt chẩn đoán, giảm bớt chi phí giảm phụ thuộc vào kit chẩn đoán nhà cung cấp 81 Phát triển phƣơng pháp chẩn đoán ISH hệ thống phát tín hiệu lai TSA (Tyramide signal amplification), phát đƣợc mẫu nhiễm mầm bệnh với mức độ thấp Kết hợp ISH với phƣơng pháp PCR để phát huy hết mạnh phƣơng pháp lai chẩn đoán mầm bệnh Phát triển xu hƣớng lai đồng thời nhiều probe với mẫu mô để đồng thời phát nhiều tác nhân gây bệnh mẫu mô CHƢƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục, 301 trang 82 Ts Nguyễn Văn Hảo, 2004 Một số bệnh thường gặp tôm sú (Penaeus monodon) phương pháp chẩn đốn biện pháp phịng trị Nhà xuất Nơng Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lƣ, 2003 Kỹ thuật nuôi tôm he chân trắng Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, 108 trang Ts Bùi Quang Tề, 2003 Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị - Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Ts Khuất Hữu Thanh, 2003 Di truyền phân tử kỹ thuật gen Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội Lê Thị Thanh Thúy Lý Thủy Tiên, 2003 Quy trình kỹ thuật khả áp dụng phương pháp chẩn đốn bệnh đốm trắng (White Spot Disease) tơm sú (Penaeus monodon) Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thủy Sản, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Mai Anh Tuấn, 2004 Tìm hiểu quy trình sản xuất giống tôm thẻ chân trắng công ty duyên hải Bạc Liêu Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thủy Sản, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Trƣờng Đại Học Y Hà Nội Bộ Môn Mô Học Và Phôi Thai Học, 2002 Mô Học Nhà xuất Y học Hà Nội, 739 trang Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, 2002 Các bệnh thường gặp tôm nuôi thương phẩm phương pháp chẩn đốn Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh 10 Just M Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donalt V Lighter, Chu-Fang Lo, Philip C Loh and Peter J Walker Nimaviridae A new virus family infecting aquatic invertebrates 11 Lightner D.V., 1996 A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases od Cultured Penaeid Shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA, 304pp 83 12 Pornlerd Chanratchakool, James.F.Turnbull, Simon.J.Funge–Smith, Ian.H.MacRae and Chalor Limsuwan, 1998 Health Management in Shrimp Ponds Bangkok, ThaiLand 13 Lightner, D.V., T.A Bell and R.M Redman, 1989 A review of the known host geographical range and current diagnostic prosedures for the virus disease of cultured penaeid shrimp Advances in tropical Aquaculture, Tahiti 14 Yoichi Tani, 1999 PCR In Situ Amplification and Catalyzed Signal Amplification: Approaches of Higher Sensitive, Non-Radioactive In Situ Hybridization 15 Thomas Ried, M.D., 1997 Cytogenis Methods Genome Technology Branch National Human Genome Research Institute 16 Tkachuk D.C., Pinkel D., Kuo W.L., Weier H.U., Gray J.W., 1991 Clinical applications of fluorescence in situ hybridization Genet Anal Techn Appl 8: 67 – 74 17 Weiming Zheng, Junichi Izaki, Shuichi Furusawa and Yukinori Yoshimura, 52001 A sensitive non – radioactive in situ hybridization method for detection of chicken IgG - chain mRNA: a technique suitable for detecting of variety of mRNA in tissue sections Biologycal Procedures Online 3: – Japan 18 Baumgart E., Schad A., Grabenbauer M., 2001 In situ hybridization: general principles and application digoxigenin – labeled cRNA for detection of mRNAs In Immunocytochemistry and in situ hybridization in Biomedical Sciences (Eds Beesley J.E.) Boston, Birkhauser, p 108 – 137 19 Schad A., Fahimi H.D., Volkl A., Baumgart E., 1996 Nonradioactive in situ hybridization for detection of mRNAs encoding for peroxisomal proteins: Heterogeneous hepatic lobular distribution after with a single dose of bezafibrate J Histochem Cytochem 44: 825 – 834 20 Jacques Chevalier, Jing Yi, Odile Michel and Xue-Ming Tang, 1997 Biotin and Digoxigenin as Labels for Light and Electron Microscopy in situ Hybridization Probes: Where we stand? The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 45: 481 – 491 21 Bloch B., 1993 Biotinylated probes for in situ hybridization histochemistry: use for mRNA detection J Histochem Cytochem 41: 1751 – 1754 22 Heitzman H., Richards F.M., 1974 Use of avidin – biotin complex for specific staining of biologycal membrances in electron microscopy Proc Natl Acad Sci USA 71: 3537 – 3541 84 23 Feng Yang, Jun He, Xionghui Lin, Qin Li, Deng Pan, Xiaobo Zhang and Xun Xum, 2001 Complete Genome Sequencce of the Shrimp White Spot Bacilliform Virus People’s Republic of China 24 Brigati D.J., Myerson D., Leary J.J., Spalholz B., Travis S.Z., Fong C.K.Y., Hsiung G.D., Ward D.C., 1983 Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin – embedded tissue section using biotin labeled hybridization probes Virology 126: 32 – 50 25 Levis F.A., Griffiths S., Dunnicliffe R., Wells M., Dudding N., Bird C.C., 1987 Sensitive in situ hybridization technique using biotin – streptavidin – polyalkaline phosphatase complex J Clin Pathol 40: 163 – 166 26 Kirsten M Spann, Russell J McCulloch, Jeff A Cowley, Iain J East, Peter J Walker, 2003 Detection of gill – associated virus (GAV) by in situ hybridization during acute and chronic infections of Penaeus monodon and Penaeus esculentus Diseases of Aquatic Organisms 56: – 10 Queenlands Bioscience Precint, 306 Carmody Road, St Lucia, Queenland 4067, Australia 27 Hasson K.W., Lightner D.V., Poulos B.T., Mohney L.L., Redman R.M., White B.M., 1999 Taura Syndrome Virus (TSV) lesion development and disease cycle in Pacific White Shrimp Penaeus vannamei Dis Aquat Org 36: 81 – 93 28 Poh – Sing Chang, Hisao – Chao Chen, Yu – Chi Wang, 1998 Detection of whitee spot syndrome associated baculovirus in experimentally infected wild shrimp, crab, lobsters by in situ hybridization Aquaculture 164: 233 – 242 Department of Aquaculture, National Kaohsiung Insitute of Marine Technology, Kaohsiung, Taiwan 29 Kenneth W Hasson, Donald V Lightner, Jocelyne Mari, Jean – Robert Bonami, Bonnie T Poulos, Leone L Mohney, Rita M Redman, James A Brock, 1998 The geographic distribution of Taura Syndrome Virus (TSV) in Americas: determination by histopathology and in situ hybridization using TSV – specific cDNA probes Aquculture 171: 13 – 26 Anuenue Fisheries Research Center, Department of Land and Natural Resources, Honolulu, HI 96819 USA 30 Hasson K.W., Hasson J., Aubert H., Redman R.M., Lightner D.V., 1997 A new RNA – friendly fixative for the preservation of penaeid shrimp samples for virological detection using cDNA genomic probes J Virol Meth 66: 227 – 236 31 Bonami J.R., Hasson K.W., Mari J., Poulos B.T., Lightner D.V., 1997 Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent.Virol 78: 313 – 319 32 www.wjgnet.com 85 33 www.genome.gov 34 www.oie.com 35 www.jhc.org 36 http://superfly.ucsd.edu 37 www.hosufl.edu 38 www.oie.com 39 www.maximbio.com 40 www.asip.org 41 www.vectorlabs.com 42 www.biologycalprocedures.com ... V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ V.1 Kết luận V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei - Sau thử nghiệm khả chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei phƣơng pháp In Situ hybridization. .. thấy khả chẩn đốn bệnh đốm trắng tơm sú phƣơng pháp hiệu quả, với độ xác cao kết thu đƣợc ổn định Do đó, chúng tơi tiến hành ứng dụng phƣơng pháp để chẩn đoán phát mầm bệnh đốm trắng tôm sú nuôi... nên phƣơng pháp hữu hiệu dùng để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng tôm sú IV.5 Nhận xét chung Sau thực chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon TSV P vannamei, có số nhận xét sau: Do probe mà kit cung cấp có