Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 64 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
64
Dung lượng
1,66 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****
ĐẶNG TRỊNH MINH ANH
NGHIÊN CỨUĐẶCTRƢNGPROTEINCỦAVIRUSGÂYHỘI
CHỨNG ĐỎĐUÔIỞTÔMSÚ(Penaeusmonodon)VÀTÔM
THẺ CHÂNTRẮNG(Penaeusvannamei)
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****
NGHIÊN CỨUĐẶCTRƢNGPROTEINCỦAVIRUSGÂYHỘI
CHỨNG ĐỎĐUÔIỞTÔMSÚ(Penaeusmonodon)VÀTÔM
THẺ CHÂNTRẮNG(Penaeusvannamei)
LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. VĂN THỊ HẠNH ĐẶNG TRỊNH MINH ANH
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI KHÓA: 2002 – 2006
CN. LÊ PHÚC CHIẾN
Thành phố Hồ Chí Minh
-Tháng 9/2006-
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY
RESEARCHING SPECIFIC PROTEIN OF RED TAIL VIRUS
IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeusmonodon) AND PACIFIC
WHITE SHRIMP (Penaeusvannamei)
GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY
Professor Student
Ph.D. VAN THI HANH DANG TRINH MINH ANH
Ph.D. NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006
BSc. LE PHUC CHIEN
HCMC, 09/2006
iv
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp
giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
TS. Văn Thị Hạnh đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
TS. Nguyễn Ngọc Hải đã truyền đạt kiến thức và tận tình giúp đỡ tôi trong quá
trình thực tập tốt nghiệp.
CN. Đỗ Thị Tuyến thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học - Viện Sinh
Học Nhiệt Đới.
Anh Lê Phúc Chiến, chị Phạm Thị Hạnh thuộc phòng Công Nghệ Tế Bào Động
Vật - Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã nhiệt tình giúp đỡ, và hướng dẫn trong quá trình
thực tập.
Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Sinh Học
Nhiệt Đới là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên.
Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 28 và các bạn cùng
phòng đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ
trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian thực tập.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2006.
Đặng Trịnh Minh Anh
v
TÓM TẮT
ĐẶNG TRỊNH MINH ANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006.
“NGHIÊN CỨUĐẶCTRƢNGPROTEINCỦAVIRUSGÂYHỘICHỨNGĐỎ
ĐUÔI ỞTÔMSÚ(Penaeusmonodon)VÀTÔMTHẺCHÂNTRẮNG(Penaeus
vannamei)”
Hội đồng hướng dẫn:
TS. Văn Thị Hạnh
TS. Nguyễn Ngọc Hải
CN. Lê Phúc Chiến
Khoá luận được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh
Học Nhiệt Đới là 1 phần của đề tài “Nghiên cứuhội trứng Taura ởtômthẻchân
trắng và mối liên quan với tác nhân gâyhộichứngđỏđuôiởtômsúvàtôm càng
xanh”. Nguồn virus ban đầu đã được phòng thí nghiệm phân lập và nhân lên trong tế
bào côn trùng Sf9.
Nội dung của khoá luận là: Xác định đặc trưng proteincủa Red - Tail Virus
(RTV) bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot. Sau đó kiểm tra khả năng gây
nhiễm thực nghiệm trên tômsúvàtômthẻchântrắngcủa RTV được nhân lên trong tế
bào côn trùng Sf9. Bước tiếp theo là tiến hành thăm dò khả năng phân tách các thành
phần proteincủavirus bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho những nghiên
cứu tiếp theo.
Những kết quả thu được:
1. Sử dụng RTV thu từ tômsúvàtômthẻchântrắng được nhân lên trong tế bào
côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tômsúvàtômthẻ thành công.
2. Xác định được các proteincủa RTV thu từ tômsúvàtômthẻ được nuôi cấy
trong tế bào côn trùng Sf9 bằng kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate –
Polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di miễn dịch (Western Blot)
vi
MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iv
Tóm tắt . v
Mục lục .vi
Danh mục các chữ viết tắt ix
Danh mục các hình .x
Danh mục các bảng .xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3
2.1.1 Hiện trạngchung 3
2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới 4
2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 4
2.2.1 Hiện trạngchung 4
2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam 5
2.3 Giới thiệu hộichứng Taura – TS (Taura syndrome) 6
2.3.1 Lịch sửvà phân bố hộichứng Taura 6
2.3.2 Phân loại và tên gọi 7
2.3.2.1 Tên gọi 7
2.3.2.2 Vị trí phân loại 7
2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV 7
2.3.4 Biểu hiện bệnh hộichứng Taura ởtôm 8
2.3.5 Vật chủ 9
2.3.6 Sự đa dạng di truyền vàsự xuất hiện các chủng TSV mới 10
2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV 10
2.3.6.2 Sự xuất hiện các chủng TSV mới 10
vii
2.3.7 Khả năng lây truyền củavirus Taura 12
2.3.8 Một số đặc tính củavirus Taura với các yếu tố lý hóa 12
2.4 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura 13
2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng 13
2.4.2 Phương pháp mô học 14
2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học 14
2.4.4 Phương pháp miễn dịch 14
2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) 14
2.4.6 Phương pháp RT-PCR 15
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16
3.1 Thời gian và địa điểm nghiêncứu 16
3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu 16
3.2.1 Hóa chất 16
3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel 16
3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE 16
3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel 16
3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting 16
3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot 17
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ 17
3.2.3 Vật liệu 18
3.2.3.1 Kháng thể 18
3.2.3.1 Mẫu 18
3.3 Phương pháp 18
3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE 18
3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE 18
3.3.1.1 Nguyên tắc 18
3.3.1.2 Phương pháp tiến hành 20
3.3.2 Phương pháp Western Blot 21
viii
3.3.2.1 Nguyên tắc 21
3.3.2.2 Phương pháp tiến hành 23
3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tômsú(Penaeusmonodon)vàtômthẻ(Penaeus
vannamei) bằng RTV được nhân lên trong tế bào Sf9 26
3.3.4 Phương pháp Dot Blot 27
3.3.4.1 Nguyên tắc 27
3.3.4.2 Phương pháp tiến hành 27
3.3.5 Phương pháp sắc ký 28
3.3.5.1 Nguyên tắc 28
3.3.5.2. Phương pháp tiến hành 29
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
4.1 Kết quả SDS – PAGE 30
4.2 Kết quả Western Blot 32
4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm 34
4.4 Kết quả Dot Blot chỉ thị virus 37
4.5 Kết quả sắc ký lọc gel 40
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42
5.1 Kết luận 42
5.2 Đề nghị 42
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC 1 47
PHỤ LỤC 2 48
PHỤ LỤC 3 50
PHỤ LỤC 4 52
ix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
1. APS Ammmonium persulphate
2. bp: Base pair
3. DNA: Deoxyribonucleic acid
4. DAB: 3,3’- Diaminobenzidinetetrahydrochloride
5. LOS: Lymphoid Organ Syndrome
6. IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus
7. MBV: Monodon Baculovirus
8. Kb: Kilo base
9. KDa: Kilo Dalton
10. PAb: Polyclonal Antibody
11. PBS: Phosphate Buffered Saline
12. PCR: Polymerase Chain Reaction
13. PL: Post larvae
14. RNA: Ribonucleic acid
15. RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
16. RTV: Red - Tail Virus
17. ORF: Open Reading Frame
18. OIE: Office International Des Epizooties (Tổ chức dịch tễ thế giới)
19. SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
20. Sf9: Sepodoptera frugiperda
21. SPF: Specific Pathogen Free (Sạch bệnh)
22. TCT: Tômthẻchântrắng
23. TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethylethylenediamine
24. TTBS: Tween tris buffer saline
25. TSV: Taura Syndrome Virus
26. YHV Yellow Head Virus
27. WSSV: White Spot Syndrome Virus
x
DANH MỤC CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới 6
Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV 8
Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV 9
Hình 2.4: cây phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự aa của VP2 10
Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV 11
Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot 21
Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose 22
Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch 28
Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE 30
Hình 4.2: Kết quả Western Blot 32
Hình 4.3: Tômthẻ không gây nhiễm vàtômthẻgây nhiễm 34
Hình 4.4: Tômthẻ chết dogây nhiễm thực nghiệm với RTV 35
Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tômsú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) 36
Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tômsú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV . 36
Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôitômsú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào
nhiễm RTV 36
Hình 4.8: Tômsú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV 37
Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot 37
Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tômthẻ trước khi gây nhiễm 38
Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tômsú giống trước khi gây nhiễm 38
Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tômthẻ sau khi gây nhiễm 38
Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tômsú giống sau khi gây nhiễm 39
Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 40
Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tômsú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).40
Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tômthẻchântrắng bị bệnh RTV (RTV-PvM) .
41
[...]... này vàvirushộichứng Taura ởtômthẻchântrắng để có biện pháp phòng ngừa kịp thời Mục tiêu nghiêncứu Xác định đặc trưng proteincủavirusgâyhộichứngđỏđuôiởtômsúvàtôm TCT Yêu cầu thực hiện của đề tài Đề tài thực hiện gồm 3 nội dung như sau: Nội dung 1: Xác định các proteincủavirusgâyhộichứngđỏđuôi Nội dung 2: Kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm củavirusgâyhộichứngđỏ đuôi. .. (Yellow Head Virus) Các kết quả nghiêncứu về đặc trưng sinh hóa, sinh học phân tử, cấu trúc hiển vi điện tử ở phòng thí nghiệm khẳng định tác nhân gây bệnh chính là virus Vì vậy, đề tài: Nghiên cứuđặc trưng proteincủavirusgâyhộichứngđỏđuôiởtômsú(Penaeusmonodon)vàtômthẻchântrắng(Penaeusvannamei) là cần thiết và cấp bách nhằm xác định mối liên hệ giữa tác nhân gây bệnh đỏđuôiđặc biệt... SIGMA) 3.2.3.1 Mẫu Virusgâyhộichứngđỏđuôi thu từ tômsú (RTV–Pm) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 Virusgâyhộichứngđỏđuôi thu từ tômthẻchântrắng (RTV-Pv) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9 Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng Kí hiệu Nơi thu Nguồn RTV-PmLA Long An Tômsú RTV-PmLA (SLT) Long An Tômsú RTV-PmCG Cần Giờ Tômsú RTV-Pv M Chợ HCM Tôm TCT DTB Sf9... từng du nhập tômthẻchântrắng (TCT) thì những thông tin đầy đủ về bệnh hộichứng Taura và khả năng lây lan TSV từ tôm này sang các loài tôm bản địa khác, đặc biệt đối với tôm sú, cũng là vấn đề rất được quan tâm Năm 2000 Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới thu được mẫu tômsúở Long An nghi nhiễm TSV, với biểu hiện lâm sàng là đỏđuôi quạt vàđỏ 2 đốt thân cuối Tôm còn sống... loài tôm khác ở Việt Nam, đặc biệt đối với tômsú chưa được thống kê và nghiên cứu đầy đủ Nhóm các nhà nghiên cứu Viện Công Nghệ Sinh học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã khẳng định sự có mặt của TSV ởtôm TCT nuôi tại Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu và từ sản phẩm tôm đông lạnh tại Hà Nội bằng kỹ thuật PCR Các tác giả cũng khẳng định khả năng lây nhiễm thực nghiệm TSV từ tôm TCT sang tômsú (Nguyễn... vannamei) từ Đài Loan và Hawaii vào nuôi thử nghiệm ở một số vùng Tômthẻchântrắng có những ưu thế so với tômsú như chủ động về nguồn giống, thời gian nuôi ngắn hơn nhưng năng suất tương đương tôm sú, chịu được độ mặn cao và có thể nuôi được trong cả nước mặn, ngọt và lợ… Tuy nhiên việc nhập nuôi loài tôm này gắn liền với việc đưa virushộichứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) vào Việt Nam Để tránh... thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển Biểu hiện sự lan tỏa vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏ nhạt, quạt đuôivàchân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khi lột xác Biểu mô ở phần phụ mỏng (cạnh củachân bò hay quạt đuôi) thấy có dấu hiệu hoại tử biểu mô tập trung Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của. .. tấn và là nguồn cung cấp nguyên liệu quan trọng cho chế biến xuất khẩu thủy sản Nghề nuôi tôm đã thực sự trở thành một trong những nghề sản xuất hàng hóa lớn của Việt Nam Tuy nhiên cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, dịch bệnh dovirusgây ra cũng liên tục lan rộng vàgây thiệt hại nặng nề về kinh tế Trong khi đó, những nghiên cứu về virustôm còn rất hạn chế Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân virus. .. Sf9 trên tômsúvàtômthẻchântrắng Nội dung 3: Thăm dò khả năng phân tách các thành phần proteincủavirus bằng phương pháp sắc ký lọc gel 2 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2.1.1 Hiện trạngchung Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế giới Vào những... sau khi thả Tôm bị hộichứng Taura thường là loại tôm giống nhỏ, khoảng 0,05 – 5 g Tôm lớn hơn cũng có thể bị ảnh hưởng, đặc biệt nếu chúng không được tiếp xúc với virus cho tới khi trở thành tôm non hay trưởng thành Quá trình diễn biến của bệnh hộichứng Taura xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn của một chu kỳ lột xác Bệnh tiến triển theo hai giai đoạn (pha): pha tiền cấp tính (peracute) và pha hồi phục . 08/2006.
“NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ
ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus
vannamei)
Hội đồng.
NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI
CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM
THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)