Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và ph đến khả năng thủy phân protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng

28 4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các nhiệt độ khác nhau.... 30 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và t

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ từ nhiều phía Trước hết, em xin ghi công ơn của cha mẹ em và người thân đã luôn luôn bên cạnh em, giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học đại học

Em sẽ mãi ghi nhớ công lao của thầy cô trong trường Đại học Nha Trang, đặc biệt các thầy cô trong khoa chế biến đã giúp em những kiến thức chuyen ngành cơ bản nhưng rất cần thiết sau khi ra trường

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy T.S Nguyễn Minh Trí, Th.S Ngô Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn, thôi thúc và tận tình chỉ bảo, cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện

đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô quản lí phòng thí nghiệm cũng như viện công nghệ sinh học đã nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi cho cho

em trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng em xin cảm ơn các bạn bè của em, những người không những động viên mà còn cùng sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài cho đến khi chỉnh sửa bài cuối cùng

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

Chương I ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương II TỔNG QUAN 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35] 3

2.1.1 Cấu tạo chung của tôm: 3

2.1.2 Thành phần hóa học của tôm 4

2.1.2.1 Protein 4

2.1.2.2 Nước 5

2.1.2.3 Vitamin và các chất khoáng 5

2.1.2.4 Các sắc tố 5

2.1.2.5 Các chất ngấm ra 6

2.2 TÌNH HÌNH KHAI THÁC, NUÔI TRỒNG, CHẾ BIẾN TÔM 6

2.3 TỔNG QAN VỀ ENZYME PROTEASE 7

2.3.1 Giới thiệu chung [3] 7

2.3.2 Phân loại protease 9

2.3.3 Nguồn thu nhận protease [32] 11

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3] 11

2.4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC: 14

2.5 ỨNG DỤNG PROTEASE 16

Chương ΙII ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát: 19

3.2.1.1 Xử lí đầu tôm: 21

3.2.1.2 Thủy phân dịch chiết từ đầu tôm: 22 3.2.2 Bố trí thí nghiệm: 24 Chương IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 28 4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các nhiệt độ khác nhau 28 4.1.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C 28 4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C 29 4.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C 30 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các pH khác nhau 32 4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=3 33 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=6 34 4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=8 35 4.3 Đánh giá mức ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân của hệ protease có trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng bằng kiểm định thống kê ANOVA 37 KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%) 3

Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23] 4

Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %) 5

Bảng 3.1: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 400C 26

Bảng 3.2: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 500C 26

Bảng 3.3: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 600C 27

Bảng 3.4: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 700C 27

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lí đầu tôm 21 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình thủy phân dịch chiết đầu tôm .23 Hình 3.4: Bố trí thí nghiệm xác định khả năng thủy phân của hệ protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng .25 Hình 4.1: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 40°C 28 Hình 4.2 : Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C 30 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C 31 Hình 4.4: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 70°C 31 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=3 33 Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=6 34 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ đến hoạt độ của hệ enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở pH=8 35

Chương I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, chế biến thủy sản được coi là hướng phát triển mũi nhọn của nền kinh tế biển Trong đó, tôm là một mặt hàng có giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị kinh tế cao Kim ngạch xuất khẩu từ các mặt hàng tôm ngày càng tăng Do đó, đây là mặt hàng đã, đang và sẽ mang lại lợi ích vô cùng lớn cho nền kinh tế quốc dân Sản lượng tôm xuất khẩu của năm 2010 đạt 241.000 tấn, tăng 13,4% so với năm 2009 và mang về hơn 2 tỷ USD [35] Chúng

ta tăng sản lượng sản phẩm chế biến từ tôm cũng đồng nghĩa với việc một lượng lớn phế liệu tôm được thải ra môi trường bên ngoài Nếu không có hướng giải quyết thích hợp thì đây sẽ là một thảm họa nghiêm trọng đối với môi trường, đồng thời chính các doanh nghiệp cũng phải bỏ ra chi phí không nhỏ cho việc xử

lí thải bỏ, thậm chí còn dẫn đến việc đóng cửa do không đủ năng lực giải quyết vấn đề ô nhiểm, gây ra nhiều hệ lụy về mặt kinh tế, xã hội tiếp sau đó

Đứng trước tình hình bức thiết của các doanh nghiệp chế biến tôm, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu tôm đã được ứng dụng trong thực tế sản xuất: sản xuất chitin, chitosan, glucosamin, sản xuất xác chất khoáng, tận thu protein…

Hàm lượng proteine chứa trong phế liệu tôm rất lớn gần 50% [23], tuy nhiên người ta chỉ mới thực hiện việc tận thu proteine đơn thuần (xay, nghiền phế liệu rồi phơi khô hay ép láy dịch rồi đi sấy khô làm thức ăn cho gia súc) hay thực hiện tận thu kết hợp với quy trình sản xuất khác… chính những điều này làm cho chất lượng proteine thu được không cao, chúng thường bị mất các đặc tính sinh học Nhằm hướng đến việc tận thu nguồn các chất có giá trị sinh học từ đầu tôm:

- Protein, các peptone, peptid có hoạt tính sinh học có lợi

- Tận thu dịch đạm acid amin

- Ứng dụng sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa sinh, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm thu hồi

- Nghiên cứu hiệu quả tương tác với các enzyme bổ sung từ bên ngoài vào trong các quá trình tận thu

Trên cơ sở hướng nghiên cứu nêu trên, trong giới hạn của đề tài, em tiến

hành nghiên cứu ‘Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thủy

phân protein của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng’

Chương II TỔNG QUAN

2.1 TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35]

Tôm thẻ chân trắng (Tên tiếng Anh: White Leg shrimp) được phân loại như sau:

Loài: Penaeus vannamei

2.1.1 Cấu tạo chung của tôm:

Tôm gồm hai phần, phần trước là đầu và ngực, phần sau là thân Đầu tôm

có cấu tạo nguyên thủy, mắt có cuống, chân có đốt, có hai đôi râu xúc giác, phần ngực được bao bọc bằng giáp đầu ngực, ba đôi chân đầu tiên được biến hóa thành chân hàm dung để đón thức ăn, năm đôi chân ngực còn lại dung để làm chân bò

Phần thân gồm có bảy đốt, có bảy đôi chân phân thành hai nhánh Đốt cuối cùng hợp với chân bơi tạo thành đuôi để tạo nên bánh lái trong quá trình di chuyển

Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%)

Thành phần khối lượng (%) Thịt tôm Đầu Vỏ Tôm thẻ

60.00 31.00 9.00

2.1.2 Thành phần hóa học của tôm

Thành phần hóa học của tôm bao gồm protein, lipid, tro, nước, vitamin, enzyme, muối vô cơ, glucid Nhũng thành phần tương đối nhiều là nước, protein

và một số muối vô cơ

Thành phần hóa học khác nhau tùy theo giống loài, trong những hoàn cảnh sinh sống khác nhau thì thành phần cũng khác nhau, ngoài ra chúng còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lí, đực cái, mùa vụ, thời tiết… Sự khác nhau về thành phần hóa học của tôm và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng đến mùi vị, đến giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, đến việc bảo quản tươi nguyên liệu trong quá trình chế biến

Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23]

Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm (%) Protein Khoáng Lipid Đầu tôm thẻ

2.1.2.1 Protein

Protein là thành phần chủ yếu trong thịt tôm, nó chiếm khoảng 70-80% tỉ

lệ thịt theo chất khô Proten trong tôm còn liên quan đến các chất hữu cơ, vô cơ khác tạo thành các chất có đặc tính sinh học đặc trưng khác nhau

Tùy theo loại tôm, mùa vụ, trạng thái sinh lí mà hàm lượng protein thay đổi trong khoảng 18-23%

Protein trong tôm có thể chia thành hai nhóm sau:

- Chất cơ hòa tan (tương cơ): Bao gồm các chất sau: Actin, myozyn,

troponyozyn, actonyozyn, chúng chiếm 70-80% hàm lượng protein và chúng có thể tan trong các dung dịch muối trung tính và nồng độ ion khá cao

Ngoài ra còn có myoabumin, globumin và các enzyme, chúng chiếm từ 20-25% hàm lượng protein, chúng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp

Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %)

Thành phần khoáng (mg %)

Ca Phosphor Fe Ne K Mg Cu 29-50 53-67,6 1,2-5.1 11-127 127-565 0,0412 332

2.1.2.4 Các sắc tố

Tôm chứa nhiều sắc tố khác nhau nhưng chủ yếu là astaxanthin, là dẫn xuất của canden Trong thành phần vỏ tôm, astaxanthin tham gia vào thành phần của lipoprotein gọi là cianin Ngoài ra trong tôm người ta còn phân li được sắc tố tím và đen là tiền astaxanthin và tetraxanthin

2.1.2.5 Các chất ngấm ra

Các chất ngấm ra chủ yếu là các chất chứa nitơ, là các chất tan được trong nước, phân tử lượng thấp, chứa nitơ với bản chất phi protein Hàm lượng chất ngấm ra chiếm khoảng 2-3% thịt tôm tươi

Lượng chất ngấm ra đứng về mặt dinh dưỡng không lớn lắm nhưng đứng

về mặt sinh lí, tạo mùi, nó đóng vai trò rất quan trọng bởi vì nó quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm

Chất ngấm ra dễ bị vi sinh vật tác dụng gây thối rửa làm giảm khả năng bảo quản nguyên liệu Tốc độ phân hủy các nguyên liệu nhanh hay chậm cũng do tính chất và số lượng chất ngấm ra trong nguyên liệu quy định Nhóm phiprotein chứa khá nhiều các acid amin tự do như albumin, luciene, acid alphatic, arinine, tyrosine

2.2 TÌNH HÌNH KHAI THÁC, NUÔI TRỒNG, CHẾ BIẾN TÔM

Bờ biển Việt Nam dài 3.444 km với vùng đặc quyền kinh tế 1.000.000

km2 rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng và đánh bắt thủy sản Theo thống kê, tổng diện tích nuôi tôm trên cả nước đã tăng từ 327.194 ha năm 2005 đến 381.728 ha năm 2008 [19] Và trong tương lai diện tích này có xu hướng tăng do nhu cầu của ngành ngày càng cao Đặc biệt là khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long, trong đó lớn nhất là các tỉnh Cà Mau (với 93.920 ha), Bạc Liêu (với 63.984 ha), Sóc Trăng (với 54.250 ha) [19] Theo như báo cáo, phương pháp nuôi tôm phổ biến hiện nay là theo phương pháp quảng canh, và nhiều địa phương đang tiến hành công tác tập huấn nuôi tôm theo phương pháp quảng canh cải tiến nhằm nâng cao năng suất

Hiện nay, đối tượng nuôi trồng và khai thác chủ yếu là tôm thẻ chân trắng

và tôm sú nhằm phục vụ chủ yếu cho xuất khẩu, các thị trường xuất khẩu phổ biến như: thị trường Nhật Bản (58.333 tấn chiếm 31%), thị trường Mĩ (46.629 tấn chiếm 24%), thị trường EU (32.727 tấn chiếm 17%) [19]

Trong lĩnh vực chế biến các sản phảm tôm bỏ đầu, bỏ vỏ thì tỉ lệ thịt tôm chỉ chiếm khoảng 55-65%, phần nguyên liệu còn lại chiếm đến 35-45% (định mức sản xuất trong nhà máy chế biến tôm đông lạnh) Như vậy, giả sử trong nhà máy chế biến, một ngày chế biến khoảng 10 tấn tôm thì lượng phế liệu thật đáng

kể Đây là nguồn thưc ăn của nhiều vi sinh vật gây thối, hơn thế đặc thù của ngành thủy sản lại gắn với việc sử dụng một lượng nước rất lớn Vì vậy mà ngành chế biến thủy sản nói chung, ngành chế biến tôm nói riêng trở thành ngành công nghiệp gây ô nhiễm nặng nề nếu phế liệu không được lí xử tốt

2.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

2.3.1 Giới thiệu chung [3]

Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3,4 ) xúc tác trong quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử proteine, polypeeptide đến các sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng, từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rải trên nhiều đối tượng như

vi sinh vật (vi khuẩn, nấm móc, virus…) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê, đầu tôm…)

Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme

Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại dưới tác dụng của yếu tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nhiệt độ cao,enzyme thường bị mất hoạt tính xúc tác

 Cấu trúc của enzyme

Enzyme của nấm mốc cũng như các enzyme khác được chia thành hai loại sau :

o Enzyme một cấu tử (enzyme đơn giản) : trong thành phần phân tử chỉ

có protein, những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng thủy phân

o Enzyme hai cấu tử (enzyme phức tạp) : trong thành phần cấu tạo của

nó gồm hai thành phần là protein (apenzyme) và phi protein (coenzyme) những enzyme này thường xúc tác cho các phản ứng oxy hóa-khử, các quá trình vận chuyển Trung tâm hoạt động cua phân tử enzyme chỉ chiếm một tỷ lệ khá nhỏ so với phân tử enzyme và nó bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau Ở enzyme một cấu

tử thì trung tâm hoạt động là một số nhóm chức nhất định của các acid amin như (-SH, -OH,-COOH ) Trung tâm hoạt động của enzyme hai cấu tử là do phần polypeptide kết hợp đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động và các nhóm chức của coenzyme, ngoài ra các trung tâm này còn có sự tham gia của các ion kim loại

Hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào tổng hợp các nhóm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động, nếu vì một lí do nào đó mà trung tâm hoạt động này bị phá vỡ thì hoạt tính xúc tác của enzyme mất đi

 Cơ chế tác dụng của enzyme

Enzyme (E) là chất xúc tác sinh học, khi tác dụng với cơ chất (S) để ra sản phẩm (P) trải qua các giai đoạn theo cơ chế sau :

o Trong giai đoạn thứ hai : xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của

enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản

ứng này Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn

o Trong giai đoạn thứ ba : sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải

phóng dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với cơ chất khác

2.3.2 Phân loại protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) [32]

Peptidase (protease) (E.C.3.4)

Exopeptidase Endopeptidase

(E.C.3.4.11-17) (E.C.3.4.21-99)

Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine Aspartic Metallo Cystine

proteinase proteinase proteinase proteinase

Exopeptidase: peptidase thủy phân các phân tử peptid có phân tử nhỏ

(pepton, polypeptid) thành các acid aminr tự do Những enzyme này đòi hỏi phải

các nhóm –COOH và nhóm -NH2 tự do tận cùng ở gần kề liên kết peptid

Peptidase có tính đặc hiệu tương đối hẹp, chủ yếu phân cách các liên kết ở hai

đầu phân tử proteine Dựa vào vị trí tác động lên mạch polypeptid, exopeptidase

được phân chia thành hai loại:

+ Amino peptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu N tự do của

chuỗi polypeptid để giải phóng ra một acid amin, dipeptid, hay tripepetid

+ Carboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của mỗi

polypeptid và giải phóng ra một acid amin, một dipeptid

Endopeptidase: protease thủy phân phân tử proteine thành polypeptid, pepton Chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng, là những enzyme hoạt động mà không đòi hỏi phải có nhóm carboxyl hay nhóm amin tận cùng ở gần liên kết peptid Chúng tác dụng vào những liên kết peptid ở bên trong phân tử protein Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:

- Chymotrypsine: bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsine, trypsine, elastine

- Nhóm subtilisine: gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Subtilisine Carlsberg, Subtilisine BPN

Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính, và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cystine proteinase: các nhóm proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystine protease bao gồm các protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease động vật và protease kí sinh trùng Chúng thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng rãi

+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase đều thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl ở trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở môi trường pH trung tính

+ Metallo proteinase: là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA Ngoài ra, protease còn được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm sau:

Enzyme protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm móc, xạ khuẩn… gồm

nhiều loại thuộc PergillAsus, Bacillus, Penicillium, Streptomyces, và một số loại

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3]

Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ các chất phản ứng, nộng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme

 Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phản ứng cho enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo quy luật của phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến mức nhất định Đa số

các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trông nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần

Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp Ngoài ra còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ

 Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường Mỗi enzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme

Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt động

ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu được ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau

 pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:

- pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhóm này trong phản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme

- pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân tử

cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp với enzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất

 Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để Mặt khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để, như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu

 Ảnh hưởng của nồng độ muối: muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân Mặt khác, muối ăn còn điều vị mặn

tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme

 Ảnh hưởng của ion kim loại: một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt của sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này

 Ảnh hưởng của chất kìm hãm: chất kìm hãm là chất làm yếu hoặc chấm dứt toàn bộ phản ứng của enzyme Có hai loại chất kìm hãm :

Kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác

Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác

 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt độ của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp

Hoạt hóa không gián tiếp: làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme

Hoạt hóa gián tiếp: chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác

● Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Đối với các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỉ lệ với nồng enzyme Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi của tốc độ thủy phân là không đáng kể Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành

● Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Trong các phản ứng do enzyme và cơ chất, trước hết phải tạo thành phức trung gian giữa enzyme và cơ chất Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử của

cơ chất khác Nếu nồng độ cơ chất đầy đủ thích hợp với lượng enzyme sẽ làm quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng

2.4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC:

Khác với các enzyme ở động vật trên cạn, enzyme ở động vật thủy sản có trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, pH hoạt động tối ưu, nhiệt độ hoạt động tối ưu, sự ổn định khác nhau và đa dạng [27]

Các enzyme tiêu hóa, đặc biệt tiêu hóa proteine của giáp xác và nhất là tôm rất giống với enzyme có trong dạ dày cá Chúng tồn tại chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin và có khả năng hoạt động rất cao Ngoài ra còn có enzyme chymotrypsin, astacin, collagenase …

Cũng như tất cả các loài động vật thủy sản khác, protease nội bào tập trung chủ yếu ở cơ quan tiêu hóa, sau đến cơ quan nội tạng và cơ thịt Đối với tôm, do cơ quan tiêu hóa nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme tập trung nhiều

ở đầu sau đó đến các cơ quan khác [6]

Phan Thị Trân Châu và cộng sự nghiên cứu protease trên tôm biển miền Bắc Việt Nam cho thấy phạm vi hoạt động của chúng khá rộng từ pH 6 đến 9 và

pH hoạt động tối ưu là 7, 5 và 8,5 [5]

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp là 600C và 500C với pH tương ứng là 7,5 và 8,5 Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [11]

Nguyễn Việt Dũng đã thực hiện việc tách chiết protease từ thịt tôm sú và xác định hoạt động của chúng ở các nhiệt độ, pH khác nhau, qua đó bước đầu nhận thấy protease trong loại tôm này hoạt động thích hợp nhất ở pH 6,6 và nhiệt

độ 50˚C [7]

Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), công bố công trình nghiên cứu protease chiết xuất từ đầu tôm bạc nghệ (Metapenaeus bevicornis) Kết quả thu được protease có nhiệt độ thích hợp là 500C và pH thích hợp từ 8,5-9,5 Chế phẩm enzyme thu được dùng thủy phân cá mối thu bột đạm [21]

Nguyễn Văn Truyền (2006) đã nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm càng xanh và thu được enzyme protease có nhiệt độ tối thích là 550C, pH tối thích là 8 [24]

Các nghiên cứu trên còn cho thấy rằng hệ enzyme protease trong tôm không những bao gồm nhiều loại protease khác nhau, mà còn các đặc tính của hệ cũng thay đổi khi tách chiết từ các phần khác nhau trên tôm

Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cũng dành sự quan tâm đến khía cạnh này Doek S.N và các cộng sự cho biết protease của thịt tôm he Ấn Độ (P.inducus) là một protease kiềm, hoạt động cực đại ở pH 8,0 bền với nhiệt, hoạt động phụ thuộc vào ion kim loại [29]

Shann Tzong Jiang và cộng sự đã tách chiết được Cathepsin D từ một số loài tôm nuôi ở Đài loan, đồng thời cũng xác định được nhiệt độ, pH tối thích cho enzyme này hoạt động, cũng như các yếu tố hoạt hóa và ức chế [31,32]

Nip và cộng sự cho thấy, collagenase đóng vai trò quan trọng đối với kết cấu của cơ thịt khi bảo quản, đặc biệt là tôm ướp lạnh có thời gian bảo quản tương đối ngắn vì sự có mặt của collagenase làm cho mô thịt tôm mềm dần [33]

Olsen, Johansen và Myrnes đã phát hiện trong nước thải từ công đoạn rã đông nguyên liệu tôm Pandalus borealis có chứa một số enzyme tiêu hóa [34]

Trong chế biến thủy sản: khi sản xuất nước mắm và một số loại nước khác thời gian chế biến thường dài, hiệu quả thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộc vào tính địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá…nên hiện nay, qui trình sản xuát mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử dụng chế phẩm enzyme

từ thực vật (bromeline, papaine)và vi sinh vật đẻ rút ngắn thời gian chế biến và cải thiện hương vị của nước mắm

Trong công nghiệp sữa: prootease được dùng trong sản xuất pho mát nhờ

hoạt tính làm đông của chúng Protease từ một số vi sinh vật như: A candidus, P roquerti, B mesentericus…được duungf trong sản xuất pho mát

Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh qui…protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột và tạo độ xốp, nở tốt hơn

Trong công nghiệp da, protease được dùng để làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần proteine của da, chủ yếu là collagene, thành phần chính làm cho

da cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da

Trước đây, để làm mềm da, người ta dùng protease được phân lập từ cơ

quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B subtilis), nấm móc (A oryzae, A flavus), xạ khuẩn (S fradiae,

S griseus, S rimonus…) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và

dần dần chiếm một vị trí quan trọng

Trong công nghiệp dệt: protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi tơ nhân tạo được tạo bằng các dung dịch caseine, gelatine) để sợi tơ được bóng và dễ nhuộm hơn Protease có tác dụng thủy phân lớp proteine serisine đã làm dính kết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó mà giảm được lượng hóa chất sử dụng để tẩy trắng

Trong sản xuất bột dinh dưỡng cho trẻ em: tại nhà máy sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em Nam Định, người ta đã sử dụng chế phẩm prozima có chứa promelain hoạt động cực đại ở pH trung tính, nhiệt độ thích hợp ở 50-600C để cải tiến đặc tính kích thích của protein và xử lí các protein ức chế tiêu hóa có sẵn trong nguyên liệu Kết quả làm cho bột dễ hấp thụ hơn và sử dụng tốt hơn trong điều trị suy dinh dưỡng ở trẻ em

Trong y học: một số protease như trypsin, chymotrypsin dung để sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, bệnh nghẽm tỉnh mạch, tiêu mủ ở các ổ viêm, làm thông đường hô hấp, bệnh thiếu enzyme bẩm sinh…

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác nhau như:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm, sản xuất một số thức ăn kiêng

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh…

- Sản xuất keo động vật, chất tẩy giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn proteine, sản xuất mĩ phẩm…

Trong nông nghiệp: người ta dùng protease và một số enzyme khác để sản xuất các loại thức ăn cho động vật nhằm làm tăng hệ số hấp thụ của thức ăn, giảm lượng thức ăn sử dụng và làm tăng cao tốc độ tăng trọng Đặc biệt ngày nay, ở lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, người ta đã tạo ra nhiều loại thức ăn giăm chi phí và nâng cao sự tăng trọng cho vật nuôi như cá, tôm…bằng cách bổ sung protease, amylase … Do vậy, năng suất nuôi trồng ngày càng cao

Như đã nói ở trên, protease có thể được cung cấp từ các nguồn: vi sinh vật, thực vật và từ động vật Nhưng phần lớn protease thương mại hiện nay đang được sử dụng được sản xuất từ vi sinh vật với số lượng lớn, ổn định, chất lượng tốt cũng nhu đồng đều và tinh sạch Bên cạnh đó qua công nghệ proteine, có tể tác động vào vi sinh vật làm thay đổi cấu trúc như mong muốn để từ đó tạo ra các enzyme mới với các cấu trúc cải biến, có các tính chất mới như mong muốn như hoạt tính được cải thiện hoặc đọ bền nhiệt hoặc khả năng hoạt động trên cơ chất mới hoặc ở pH cao hơn

Tuy nhiên, với lượng phế liệu đầu tôm lớn như hiện nay và có xu hướng tăng theo như mục tiêu đề ra của hiệp hội xuất khẩu Thủy sản thì ngoài các biện pháp tận thu để sản xuất chitin, chitosan, glucosamin thì việc chiết rút, sử dụng enzyme protease từ đầu tôm cũng là một biện pháp góp phần đa dạng nguồn cung cấp enzyme protease, cũng nhu góp phần giảm thải ô nhiễm môi trường và cung cấp một lượng enzyme đáng kể đồng thời giải quyết vấn đề tận dụng tối đa phế liệu từ sản xuất

Chương ΙII ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát:

Để đánh giá khả năng thủy phân của protease có trong đầu tôm trước hết cần tách dịch chứa enzyme ra khỏi phần bã Enzyme Protease có trong dịch chiết

là hệ của nhiều enzyme Do vậy để tránh không bị mất enzyme do quá trình tinh chế, trong đề tài không có bước tách chiết và tinh chế enzyme Sử dụng cơ chất thủy phân là protein có trong dịch enzyme để đánh giá khả năng thủy phân của

hệ các enzyme protease Khả năng thủy phân được đánh giá bằng cách đo lượng acid amin tạo thành do quá trình thủy phân nhờ enzyme Các bước thực hiện được trình bày trong sơ đồ tổng quát ở Hình 3.1

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Nguyên liệu

Xử lí đầu tôm

Dịch chiết đầu tôm

Thủy phân

Đánh giá khả năng thủy phân

3.2.1.1 Xử lí đầu tôm:

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lí đầu tôm Thuyết minh:

• Nguyên liệu: Nguyên liệu đầu tôm sau khi mua về được chia nhỏ theo

khối lượng sử dụng , đựng trong các túi bóng và đem đi bảo quản đông ở -200C,

thời gian sử dụng không được quá bốn tuần

• Xay nghiền: Cân 50g nguyên liệu đầu tôm đã bảo quản đông, đem đi xay

nhỏ Sau đó cho ra bình tam giác 250ml, cho dung dịch đệm phosphate với pH

xác định vào với tỉ lệ 1:2 (50g đầu tôm/100ml đệm) Để hạn chế vi sinh vật làm

ảnh hưởng đến kết quả cũng như ảnh hưởng đến hoạt độ của hệ enzyme trong

Nguyên liệu

Xay nghiền

Lọc ép

Dịch lọc

Li tâm

Dịch li tâm

Bổ sung đệm

Bã

Cặn

dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng, sử dụng tetracycline 1‰, với tỉ lệ bổ sung là 1:

1 so với đệm đã sử dụng (ml/ml) Tetracycline là kháng sinh có phổ tác dụng rất rộng, tác dụng nhiều vi khuẩn gram âm và gram dương, cả ưa khí và kị khí, xoắn

khuẩn và vi khuẩn nội bào Clamydia, Rickettsia, Mycoplasma Tetracycline có

tác dụng kiềm khuẩn là do ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn

Tiếp tục lấy giấy bạc đậy miệng bình tam giác, rồi cho vào ngăn lạnh trong khoảng thời gian 40 phút, sau đó tiến hành lọc

• Lọc: Tiến hành lọc qua rây, lấy phần dịch, bỏ bã Dịch sẽ cho qua lọc với vải ra hai lớp Thời gian lọc phải diễn ra nhanh chóng để hạn chế vi sinh vật lây nhiễm vào dịch chiết

• Li tâm: Dịch lọc thu được sẽ cho vào các ống li tâm và được cân bằng với nhau trước khi thực hiện li tâm với chế độ 7000 vòng, 900 giây, 40C Sau khi

li tâm, thu dịch và bỏ phần cặn

3.2.1.2 Thủy phân dịch chiết từ đầu tôm: