Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và ph đến khả năng vô hoạt enzym phenolase trong nấm rơm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ pH ĐẾN KHẢ NĂNG VÔ HOẠT ENZYME PHENOLASE TRONG NẤM RƠM Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.s Nguyễn Thị Thu Thủy Nguyễn Thanh Hùng MSSV: LT08177 Lớp: CNTP K34LT CẦN THƠ, 2010 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN ˜™˜ Qua tháng nghiên cứu đề tài luận văn phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ đạt kết mong muốn Những thành tựu có ngày hơm nhờ giúp đỡ gia đình, thầy bạn bè Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Thủy, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, động viên truyền đạt kiến thức cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tồn thể bạn lớp Công nghệ thực phẩm K34 liên thông lớp công nghệ thực phẩm K32, người chia sẻ, khích lệ em nhiều suốt thời gian học tập trường Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng i Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ TĨM LƯỢC Mục tiêu đề tài khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH đến hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm, từ xác định điều kiện vơ hoạt enzyme Thí nghiệm tiến hành sở thay đổi điều kiện nhiệt độ pH môi trường phản ứng, xác định tốc độ phản ứng dựa thay đổi độ hấp thụ sản phẩm phản ứng hóa nâu enzyme phenolase gây 10 phút bước sóng 475nm Từ đó, xác định ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm Trên sở đề tài tiến hành nghiên cứu vấn đề sau: - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC 100oC với pH môi trường khoảng - 12 Kết thí nghiệm cho thấy: điều kiện nhiệt độ khảo sát, enzyme phenolase bị vô hoạt dung dịch đệm pH = - nhiệt độ phòng; nhiệt độ 40oC, 50oC 60oC enzyme phenolase bị vô hoạt pH = - 5; 70oC enzyme bị vô hoạt pH = - Ngồi enzyme phenolase bị vơ hoạt pH = - khoảng nhiệt độ 80oC – 100oC Enzyme phenolase có hoạt tính cao pH = nhiệt độ 60oC - Khảo sát độ bền pH enzyme phenolase trích từ nấm rơm Thí nghiệm tiến hành cách giữ enzyme phenolase giờ, 18 pH khác từ pH = – 12 Kết thí nghiệm cho thấy: hoạt tính enzyme phenolase giảm sau giờ, sau hoạt tính enzyme giảm mạnh sau 18 enzyme bị hoạt tính hồn tồn Enzyme phenolase bền pH = 8; không bền pH = 10 - 11; bị vơ hoạt hồn tồn pH = 2, pH = pH = Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng ii Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thông – 2010 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM LƯỢC ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH HÌNH vii DANH SÁCH BẢNG vii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nguyên liệu 2.1.1 Nguồn gốc phân bố nấm rơm .2 2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.1.2.1 Hình thái 2.1.2.2 Chu kì phát triển 2.1.2.3 Điều kiện sống nấm rơm 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng nấm rơm 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nấm rơm .10 2.1.4.1 Sự nước .11 2.1.4.2 Sự hóa nâu 11 2.1.4.3 Sự thối nhũn .11 2.1.4.4 Sự biến chất .11 2.1.5 Tình hình sản xuất nấm rơm nước 11 2.2 Giới thiệu enzyme 12 2.2.1 Khái niệm đại cương enzyme .12 2.2.2 Cấu trúc phân tử enzyme 12 2.2.2.1 Bản chất hóa học enzyme 12 2.2.2.2 Thành phần cấu tạo enzyme 13 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng iii Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.2.3 Trung tâm hoạt động enzyme .13 2.2.3 Tính đặc hiệu enzyme .14 2.2.4 Cơ chế tác động enzyme .14 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác enzyme 15 2.2.5.1 Ảnh hưởng nồng độ chất 15 2.2.5.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme 15 2.2.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ .15 2.2.5.4 Ảnh hưởng pH .16 2.2.5.5 Ảnh hưởng chất kìm hãm đến hoạt tính enzyme 17 2.2.5.6 Ảnh hưởng chất hoạt hóa .17 2.3 Enzyme phenolase (PPO) 17 2.3.1 Giới thiệu enzyme phenolase 17 2.3.2 Cấu tạo tính chất phenolase 18 2.3.3 Các chất phenolase .19 2.3.3.1 Đối với chất monophenol 20 2.3.3.2 Đối với chất diphenol 20 2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính phenolase 22 2.3.4.1 Ảnh hưởng chất .22 2.3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ .22 2.3.4.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 23 2.3.4.4 Ảnh hưởng chất kìm hãm đến hoạt tính enzyme 23 2.3.5 Phương pháp ngăn chặn hóa nâu enzyme phenolase 23 2.3.5.1 Sử dụng nhiệt .23 2.3.5.2 Dùng SO2 sulphite 23 2.3.5.3 Loại oxy 24 2.3.5.4 Sử dụng muối 24 2.3.5.5 Sự methyl hóa chất phenolase 24 2.3.5.6 Sử dụng acid 25 2.3.5.7 Các chất tạo phức .26 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng iv Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ 2.4 Một số nghiên cứu liên quan đến đề tài 26 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 3.1 Phương tiện thí nghiệm .28 3.1.1 Thời gian, địa điểm 28 3.1.2 Nguyên liệu 28 3.1.3 Hóa chất 28 3.1.4 Dụng cụ 28 3.2 Phương pháp thí nghiệm 28 3.2.1 Chuẩn bị mẫu 28 3.2.2 Phương pháp phân tích 28 3.2.3 Phương pháp thí nghiệm 29 3.2.4 Trích ly enzyme phenolase từ nấm rơm 29 3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm 30 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme poliphenol oxidase từ nấm rơm 30 3.3.1.1 Mục đích 30 3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm 30 3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm 32 3.3.1.4 Ghi nhận kết 32 3.3.2 Thí nghiệm 2: 32 3.3.2.1 Mục đích 32 3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm 32 3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm 33 3.3.2.4 Ghi nhận kết 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm 34 4.2 Độ bền pH enzyme phenolase .37 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng v Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thông – 2010 Trường Đại học Cần Thơ 5.1 Kết luận .40 5.2 Đề nghị .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC ix PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ĐỆM THEORELLA VÀ STEINHAGEN (pH = đến pH = 12) ix PHỤ LỤC CÁCH XÁC ĐỊNH VẬN TỐC PHẢN ỨNG HÓA NÂU DO ENZYME PHENOLASE .x PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÍ THỐNG KÊ BẰNG PHẦN MỀM xii STATGRAPHIC Plus 4.0 xii 3.1 Bảng kết thống kê vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase nhiệt độ pH khác xii 3.2 Bảng kết thống kê vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase xúc tác môi trường pH sau khoảng thời gian khác Error! Bookmark not defined Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng vi Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Nấm rơm Hình 2: Cấu tạo nấm rơm Hình 3: Chu trình sống nấm rơm Hình 4: Mơ hình Fisher (a) mơ hình Koshland (b) 13 Hình 5: Ảnh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính xúc tác enzyme 15 Hình 6: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 16 Hình 7: pH tối thích số enzyme 17 Hình 8: Cơ chế phản ứng tạo o-quinone 20 Hình 9: Phản ứng oxy hóa o-diphenol .21 Hình 10: Phản ứng tạo o-quinone từ catechin 21 Hình 11: Phản ứng hydroxyl hóa o-quinone tạo thành trihydroxybenzen 21 Hình 12: Phản ứng thành lập hydroxyquinones 22 Hình 13: Ức chế phản ứng hóa nâu enzyme sulphite 24 Hình 14: Một số chất phenolase bị methyl hóa tác dụng với S-adenosylmethine .25 Hình 15: Kiểu phản ứng acid ascorbic .26 Hình 16: Qui trình trích ly enzyme phenolase từ nấm rơm .29 Hình 17: Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase 36 Hình 18: Độ bền enzyme phenolase pH thời gian khác 38 Hình 19: Độ hấp thụ sản phẩm phản ứng hóa nâu theo thời gian 600C .xi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Điều kiện môi trường cần thiết cho tăng trưởng phát triển nấm rơm Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng 100g nấm tươi Bảng 3: Thành phần acid amin nấm rơm Bảng 4: Tỉ lệ phần trăm chất nấm rơm khô Bảng 5: Hàm lượng chất khoáng nấm rơm qua giai đoạn phát triển (%) .9 Bảng 6: Vận tốc phản ứng hóa nâu (x 10-3 (rA475/phút)) enzyme phenolase nhiệt độ pH khác Error! Bookmark not defined Bảng 7: Bảng thống kê ảnh hưởng nhiệt độ pH lên vận tốc phản ứng .35 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng vii Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 8: Độ bền pH enzyme xử lý khoảng thời gian khác .38 Bảng 9: Độ hấp thụ sản phẩm phản ứng hóa nâu theo thời gian 60oC x Bảng 9: Vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase 60oC .xi Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng viii Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Nấm rơm loại thực phẩm phổ biến, nhiều người ưa thích nước ta số nước khu vực Nấm rơm chứa đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết, hàm lượng protein nguyên liệu nấm rơm cao, nấm rơm nguồn thực phẩm giàu chất khoáng acid amin không thay thế, vitamin A, B, D, E,… khơng có độc tố Nấm rơm xem loại “rau sạch” “thịt sạch”, chế biến dạng thành phẩm hay bán thành phẩm: nấm rơm đóng hộp, nấm rơm sấy… Bên cạnh nấm rơm có thành phần chất xơ tương đối cao, hàm lượng lipid thấp nên có khả phịng số bệnh làm giảm huyết áp, chống bệnh béo phì, chống gây xơ cứng động mạch, khơng làm tăng cholesterol máu số thịt động vật Tuy nhiên bên cạnh mặt có lợi nấm rơm có chứa thành phần gây ảnh hưởng xấu trình chế biến tồn trữ Đó thành phần enzyme phenolase bên mô nấm rơm, tác nhân quan trọng việc làm đổi màu sản phẩm, sản phẩm bị chuyển thành màu nâu sậm, kết làm giảm giá trị cảm quan sản phẩm Hoạt tính enzyme phenolase chịu ảnh hưởng yếu tố như: nồng độ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, hàm lượng oxy, chất kìm hãm Chính thế, đề tài tiến hành để hiểu rõ tác động nhiệt độ pH đến enzyme phenolase nấm rơm Sự hiểu biết ứng dụng vào sản xuất thực tế nhằm ngăn chặn hóa nâu sản phẩm chế biến từ nấm rơm 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme, từ xác định điều kiện để vô hoạt enzyme phenolase nấm rơm Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thông – 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm Thí nghiệm tiến hành nhằm tìm ảnh hưởng tương quan nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase để xác định điều kiện tối thích cho hoạt động enzyme điều kiện ức chế enzyme Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả hoạt động enzyme phenolase, enzyme không bền dễ dàng bị biến tính tác dụng nhiệt độ, nhiệt độ cao tác dụng ức chế làm hoạt tính enzyme mạnh Hoạt tính phenolase bị ảnh hưởng pH môi trường phản ứng, thay đổi pH ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme phenolase mà cịn thay đổi đặc tính chất chất khơng thể gắn vào trung tâm hoạt động enzyme nên khơng có xúc tác diễn Ngồi ra, pH tối thích cịn phụ thuộc vào độ tinh khiết enzyme phenolase, loại chất, loại đệm sử dụng độ thục nấm rơm Dựa sở đó, thí nghiệm tiến hành nhằm xác định hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm nhiệt độ pH khác dựa vào vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme xúc tác Kết thể qua Bảng Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 34 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 6: Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên vận tốc phản ứng enzyme phenolase xúc tác pH 30 + + + 40 + + + 50 + + + Nhiệt độ (0C) 60 70 + + + + + + 3,69 + + + + + + + 3,69bc 5,71 5,84 59,82 26,84 + + + + 11,09bc 5,78 5,62 6,08 24,32 12,95 + + + 10,95bc 89,91 9,01 12,03 33,12 30,62 257,57 19,07 12,01 18,82a 65,45 79,41 7,28 29,91 22,73 19,54 104,31 71,85 13,94b 10 80,52 8,49 8,95 27,49 14,56 13,63 4,83 45,70 11,32bc 131,22 - 16,42 - 14,63 - 41,28 - 19,70 - 2,52 - 37,90 - 8,68c - 8,34cd 9,46cd 26,06a 17b 15,23bc 9,22cd 6,89d 11 12,89 12 Trung bình 7,38d 80 + + + 90 + + + 100 + + + Trung bình + + + (-: không xác định được), (+: kết tủa) Các chữ khác bảng biểu thị khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức 5% Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 35 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ VẬN TỐC PHẢN ỨNG Vận tốc phản ứng (x 10-3 (rA475/phút)) Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào pH nhiệt độ môi trường thể đồ thị Hình 17: 35 30 nhiet phong 40 25 50 20 60 70 15 80 10 90 100 5 10 11 pH Hình 17: Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase Ở nhiệt độ pH khác enzyme phenolase nấm rơm có vận tốc phản ứng khác Ở pH = 2, pH = 3, pH = 4, khơng có phản ứng xảy enzyme phenolase bị biến tính mơi trường acid mạnh làm thay đổi khả ion hóa enzyme chất làm khả hoạt động enzyme nên cho enzyme vào khoảng pH hỗn hợp phản ứng bị kết tủa ngay, pH = enzyme phenolase thể hoạt tính xúc tác nhiệt độ phòng Ở nhiệt độ từ nhiệt độ phịng đến 60oC khoảng pH = - 11 phản ứng xảy Khi gia tăng nhiệt độ, vận tốc phản ứng tăng nhiệt độ > 60oC, bắt đầu có tượng biến tính nhiệt enzyme nên làm cho vận tốc phản ứng giảm Khi tăng nhiệt độ dung dịch phản ứng lên 70oC pH = - hỗn hợp phản ứng bị kết tủa, tăng lên 80oC - 100oC pH = - hỗn hợp phản ứng bị kết tủa protein bị biến tính tác dụng nhiệt độ cao Riêng pH = 12 khơng thể xác định hoạt tính enzyme phenolase chất catechin bị chuyển hóa mơi trường kiềm mạnh tạo thành dung dịch màu nâu đen, đo độ hấp thụ sản phẩm phản ứng bước sóng 475nm Kết thí nghiệm từ bảng cho thấy, có khác biệt ý nghĩa thống kê vận tốc phản ứng giá trị pH nhiệt độ khác lên hoạt tính enzyme phenolase, hoạt tính enzyme tăng dần đến pH = giảm dần pH môi trường phản ứng kiềm Tùy thuộc vào loại nguyên liệu mà hoạt tính enzyme đạt cực đại nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng, enzyme phenolase nấm Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 36 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ rơm nhiệt độ phịng, 40oC, 50oC hoạt tính enzyme tăng tương đối thấp, tốc độ phản ứng tăng dần từ pH = đến pH = sau giảm xuống pH = pH =10 pH = 11 giá trị độ hấp thu lại tăng lên cao catechin bị biến đổi mơi trường kiềm làm cho dung dịch có màu nâu sậm Theo số nghiên cứu cho thấy phần lớn enzyme phenolase có nguồn gốc từ thực vật có pH tối thích nằm khoảng gần với pH trung tính, nhiên vài trường hợp, pH tối thích enzyme lại cao thấp pH trung bình, tùy thuộc vào chất môi trường nguyên liệu, chẳng hạn: enzyme phenolase mơ Malatya có pH tối thích pH = 8,5 40oC (Oktay Arslan cộng sự, 1998), enzyme phenolase chuối xiêm có pH tối thích pH = nhiệt độ phòng (Phan Thị Mộng Tuyền, 2009) Từ kết thí nghiệm cho thấy, enzyme phanolase nấm rơm hoạt động mạnh nhiệt độ tương đối cao, xúc tác chất catechin, enzyme phenolase trích từ nấm rơm hoạt động mạnh nhiệt độ 60oC pH = Do enzyme có chất protein nên bị biến tính nhiệt độ cao Hoạt tính enzyme phenolase nấm rơm giảm dần từ 70oC đến 100oC Ở khoảng nhiệt độ ứng với pH = – 11, giá trị vận tốc phản ứng tương đối cao ngồi phản ứng hóa nâu enzyme xúc tác cịn xảy phản ứng hóa nâu khơng enzyme (phản ứng maillard) Theo lý thuyết enzyme phenolase bị vô hoạt 100oC, kết thí nghiệm thể vận tốc phản ứng 100oC lại cao q trình trích dịch enzyme thơ cịn tồn thành phần đường khử acid amin nên xảy phản ứng maillard (phản ứng maillard xảy mạnh môi trường kiềm), sản phẩm phản ứng hấp thụ ánh sáng bước sóng khảo sát 4.2 Độ bền pH enzyme phenolase Mỗi enzyme có độ bền pH khác tồn mơi trường có pH khác thời gian dài Độ bền pH enzyme phenolase trích từ nấm rơm thể qua Bảng đồ thị Hình 18 sau: Chun ngành cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 37 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 7: Độ bền pH enzyme xử lý khoảng thời gian khác Vận tốc phản ứng (x 10-3 (rA475/phút)) pH giờ 4,49b 4,08b 4,83b 4,27b 5,95a 6,84a 4,87b 4,26b 4,01b 5,72a 6,74a 4,18b 3,40b 2,40c 10 11 Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức 5% Vận tốc phản ứng 6 GIỜ GIỜ 10 11 pH Hình 18: Độ bền enzyme phenolase pH thời gian khác pH mơi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme có ảnh hưởng mạnh đến phản ứng enzyme (Nguyễn Đức Lượng) Độ bền hoạt tính enzyme phenolase giảm theo thời gian giữ enzyme pH khác pH làm ảnh hưởng đến khả ion hóa phân tử enzyme, làm thay đổi cấu hình khơng gian, giảm khả xúc tác, tốc độ phản ứng hóa nâu tương đối thấp Nhìn chung, độ bền enzyme phenolase cao mơi trường có pH = pH = 8, độ bền enzyme giảm dần môi trường acid kiềm Ở dung dịch đệm có pH = – enzyme sau cho vào bị kết tủa ngay, mơi trường Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 38 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ kiềm mạnh pH = 12 enzyme bị biến tính nên điều chỉnh pH trung tính enzyme khơng thể xúc tác phản ứng oxi hóa catechin Ở pH = 10 pH = 11 hoạt tính enzyme giảm nhiều mơi trường kiềm nên khơng thích hợp cho hoạt động enzyme phenolase Hoạt tính enzyme phenolase sau giảm không đáng kể, giữ enzyme môi trường phản ứng hoạt tính enzyme giảm khơng nhiều pH = - giảm mạnh pH= pH = - 11 Sau giữ enzyme đệm pH, cho thấy sau hoạt tính enzyme giảm so với điều kiện xử lý Sau 18 giữ enzyme dung dịch đệm pH = - 11 xảy lên men lactic q trình trích dịch enzyme thơ cịn tồn thành phần đường khử acid amin, điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic hoạt động sử dụng hết đường khử làm giảm pH hỗn hợp phản ứng làm cho enzyme bị hoạt tính hồn tồn Riêng pH = 12 dung dịch có mùi thối mơi trường kiềm mạnh nên làm biến tính protein tạo điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển gây ôi thối làm vô hoạt enzyme Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 39 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 CHƯƠNG V Trường Đại học Cần Thơ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình tiến hành thí nghiệm “Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme phenolase nấm rơm”, kết thu cho thấy: - Nhiệt độ pH có ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme phenolase trích từ nấm rơm, điều kiện tối thích cho hoạt động enzyme là: nhiệt độ 60oC, pH = chất catechin - Enzyme phenolase nấm rơm bị vô hoạt pH = 2, pH = 3, pH = Ở nhiệt độ 40 C, 50oC 60oC, enzyme bị vô hoạt pH = - Nhiệt độ 70oC, enzyme bị vô hoạt pH = - Nhiệt độ 80oC - 100oC đo được độ hấp thu sản phẩm phản ứng pH = – 11 o - Hoạt tính enzyme phenolase giảm tương đối giữ enzyme mơi trường có pH khác khoảng thời gian giờ, sau hoạt tính enzyme giảm mạnh sau 18 enzyme bị hoạt tính hồn tồn Enzyme phenolase bền pH = pH = 8, không bền pH = 10, pH = 11; bị hoạt tính hồn tồn pH = 2, pH = pH = 5.2 Đề nghị Do thời gian số điều kiện hạn chế nên q trình nghiên cứu cịn số vấn đề chưa thể thực hết Vì đề nghị thời gian tới tiến hành nghiên cứu tiếp vấn đề sau: - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất nồng độ muối lên hoạt tính enzyme phenolase nấm rơm - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH đến khả vô hoạt enzyme phenolase nguyên liệu khác với chất catechin Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 40 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO ˜™˜ Bùi Hữu Thuận (1999), Bài giảng Sinh hóa thực phẩm Trường Đại Học Cần Thơ Đường Hồng Dật (2002), Kỹ thuật ni trồng nấm mỡ, nấm rơm, nấm sị NXB Hà Nội Lê Duy Thắng (1992), Kỹ thuật trồng nấm rơm NXB Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Lê Ngọc Tú (2004), Hóa sinh cơng nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lương Đức Phẩm (1998), Vi sinh vật học vệ sinh an toàn thực phẩm NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Hải Hà (LVTS, 2006) Nghiên cứu trích ly polyphenol trà Trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh (2000), Nấm ăn nấm dược liệu NXB Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2003), Công nghệ trồng nấm (tập 1) NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2003), Công nghệ trồng nấm (tập 2) NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội Trần Văn Mão (2002), Sử dụng trùng vi sinh vật có ích (tập 2) NXB Nơng Nghiệp Hà Nội BỘ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (2005) NXB Nông Nghiệp Hà Nội Jacques Nicolas 2007 Role des produits de la reaction de maillard dans l’inhibition de l’oxydation enzymatique des phenols et des lipides Agro Paris Tech Jianhui Wang, Weibo Jiang, Baogang Wang, Shijian Liu, Zhengli Gong and Yunbo Luo 2006 Partial Properties of Polyphenol Oxidase in Mango (mangifera indica L.CV “Tainong”) pulp College of Food Science and Nutritional Engineering China Agricultural University Maurice R Marshall, Jeongmok Kim, Cheng-I Wei (2000), Enzymatic Browning in Fruits, Vegetables and Seafoods, FAO Oktay Arslan, Nguyên Thành Arzu, İsrafil Tozlu (1998), Journal of Agricultural and Food Chemistry http://pubs.acs.org/cgi-bin/jtext?jafcau/45/i08/abs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles http://www.unido.org/fileadmin/import/ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng 41 Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ DUNG DỊCH ĐỆM THEORELLA VÀ STEINHAGEN (pH = đến pH = 12) - Dung dịch gốc (1): 100ml CH3COOH 1N (57,1ml CH3COOH đặc, dẫn nước đến 1000ml), 100ml H3PO4 1N, 3,54g acid boric, 343ml NaOH 1N Tất chất hòa tan vào dẫn nước đến 1000ml - Dung dịch HCl 0,1N (2): 8,4ml HCl đặc (37%) pha thành 1000ml Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào 100ml dung dịch gốc (1) cho thêm Xml dung dịch (2) dẫn nước đến 500ml pH 10 11 12 X (ml) 366,5 282,5 252,5 225,9 197,1 163,3 140,1 118,8 89,6 72,6 Nguyễn Văn Mùi (2001) Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng ix Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC CÁCH XÁC ĐỊNH VẬN TỐC PHẢN ỨNG HÓA NÂU DO ENZYME PHENOLASE Kết thu đo độ hấp thụ sản phẩm phản ứng hóa nâu theo thời gian biểu diễn đồ thị (Hình 19) Sau xác định hệ số gốc đường biểu diễn, hệ số góc vận tốc phản ứng hóa nâu Bảng 8: Độ hấp thụ sản phẩm phản ứng hóa nâu theo thời gian 60oC Thời gian (phút) 10 pH 10 11 12 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0 0 0 26,84 54,68 80,97 108,36 132,2 159,5 187,1 216,72 243,56 268,88 23,32 49,64 74,96 99,28 121,6 142,92 171,24 193,56 216,88 245,2 33,12 60,24 100,36 120,48 167,6 199,72 235,84 261,96 298,93 328,2 28,91 59,82 85,73 115,64 146,55 180,46 211,37 239,28 270,19 290,1 27,56 55,98 98,42 106,96 134,45 163,94 180,66 219,92 248,41 272,9 14,63 27,26 45,89 56,52 75,15 88,78 102,41 119,04 130,67 146,3 - (-: không xác định được),(+: kết tủa) Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng x Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Kết biểu diễn qua đồ thị Hình 19: Độ hấp thụ (x10-3(ABS)) 350 y = 27.49x y = 26.84x R = 0.995 R = 0.9998 y = 29.91x R2 = 0.999 300 250 200 pH=6 pH=7 y = 24.315x R2 = 0.9996 y = 32.126x R2 = 0.9983 150 pH=8 pH=9 pH=10 100 pH=11 y = 14.63x R2 = 0.9991 50 0 10 12 Thời gian (phút) Hình 19: Độ hấp thụ sản phẩm phản ứng hóa nâu theo thời gian 600C Hệ số góc đường biểu diễn vận tốc phản ứng hóa nâu Vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase xúc tác 60oC thể Bảng Bảng 9: Vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase 60oC pH 10 11 12 Vận tốc phản ứng (x 10-3 (rA475/phút)) + + + + 26,84 24,32 33,12 29,91 27,49 14,63 (-: không xác định được),(+: kết tủa) Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng xi Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÍ THỐNG KÊ BẰNG PHẦN MỀM STATGRAPHIC Plus 4.0 3.1 Bảng kết thống kê vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase nhiệt độ pH khác Analysis of Variance for Van toc phan ung - Type III Sums of Squares -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -MAIN EFFECTS A:Nhiet 3446.1 492.3 11.50 0.0000 B:pH 1112.77 185.462 4.33 0.0009 RESIDUAL 2996.05 70 42.8007 -TOTAL (CORRECTED) 7592.54 83 -All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Van toc phan ung by nhiet -Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count LS Mean Homogeneous Groups -100 5.12271 X Nhiet phon 14 7.38136 X 90 7.44946 XX 40 12 7.72544 XX 50 12 8.84319 XX 80 13.2981 XX 70 10 16.0112 X 60 12 25.4408 X -Contrast Difference +/- Limits -100 - 40 -2.60273 5.95561 100 - 50 -3.72048 5.95561 100 - 60 *-20.3181 5.95561 100 - 70 *-10.8885 6.18925 100 - 80 *-8.17538 6.52404 100 - 90 -2.32675 6.52404 100 - Nhiet phon -2.25865 5.78294 40 - 50 -1.11775 5.32686 40 - 60 *-17.7153 5.32686 40 - 70 *-8.28572 5.58686 40 - 80 -5.57264 5.95561 40 - 90 0.27598 5.95561 40 - Nhiet phon 0.344083 5.13309 50 - 60 *-16.5976 5.32686 50 - 70 *-7.16797 5.58686 50 - 80 -4.45489 5.95561 50 - 90 1.39373 5.95561 50 - Nhiet phon 1.46183 5.13309 60 - 70 *9.42961 5.58686 60 - 80 *12.1427 5.95561 60 - 90 *17.9913 5.95561 60 - Nhiet phon *18.0594 5.13309 70 - 80 2.71308 6.18925 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng xii Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ 70 - 90 *8.5617 6.18925 70 - Nhiet phon *8.62981 5.40242 80 - 90 5.84863 6.52404 80 - Nhiet phon *5.91673 5.78294 90 - Nhiet phon 0.0681033 5.78294 -* denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Van toc phan ung by pH -Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean Homogeneous Groups -5 7.71867 XX 11 16 8.67906 X 10 9.28304 XX 10.1567 XX 10 16 11.2124 XX 16 13.8631 X 16 18.9502 X -Contrast Difference +/- Limits -5 - -2.43804 10.3154 - -1.56437 10.107 - *-11.2315 9.78606 - -6.14446 9.78606 - 10 -3.49371 9.78606 - 11 -0.960397 9.78606 - 0.87367 6.18925 - *-8.79348 5.64999 - -3.70642 5.64999 - 10 -1.05567 5.64999 - 11 1.47764 5.64999 - *-9.66715 5.25985 - -4.58009 5.25985 - 10 -1.92934 5.25985 - 11 0.603975 5.25985 - *5.08706 4.61319 - 10 *7.73781 4.61319 - 11 *10.2711 4.61319 - 10 2.65075 4.61319 - 11 *5.18406 4.61319 10 - 11 2.53331 4.61319 -* denotes a statistically significant difference Table of Least Squares Means for Van toc phan ung with 95.0 Percent Confidence Intervals -Stnd Lower Upper Level Count Mean Error Limit Limit -GRAND MEAN 84 11.409 Nhiet 100 5.12271 2.50039 0.135825 10.1096 40 12 7.72544 2.01897 3.69871 11.7522 50 12 8.84319 2.01897 4.81646 12.8699 60 12 25.4408 2.01897 21.414 29.4675 70 10 16.0112 2.22889 11.5658 20.4566 80 13.2981 2.50039 8.3112 18.285 90 7.44946 2.50039 2.46258 12.4363 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng xiii Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Nhiet phon pH 10 11 Trường Đại học Cần Thơ 14 7.38136 1.74848 3.89411 10.8686 10 16 16 16 16 7.71867 10.1567 9.28304 18.9502 13.8631 11.2124 8.67906 4.96897 2.44241 2.16364 1.63556 1.63556 1.63556 1.63556 -2.19165 5.28547 4.96779 15.6882 10.6011 7.95035 5.41704 17.629 15.0279 13.5983 22.2122 17.1251 14.4744 11.9411 3.2 Bảng kết thống kê vận tốc phản ứng hóa nâu enzyme phenolase xúc tác môi trường pH sau khoảng thời gian khác ANOVA Table for Van toc phan ung by pH Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 11.8349 1.97249 9.89 0.0040 Within groups 1.39577 0.19996 Total (Corr.) 13.2307 13 Multiple Range Tests for Van toc phan ung by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups 11 4.0125 X 4.4995 X 10 4.506 X 4.639 X 4.833 X 5.953 X 6.842 X - ANOVA Table for Van toc phan ung by pH Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 19.0406 3.17343 21.45 0.0004 Within groups 1.03553 0.147933 Total (Corr.) 20.0761 13 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng xiv Luận văn tốt nghiệp khóa 34-Liên thơng – 2010 Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests for Van toc phan ung by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups 11 2.4035 X 10 3.4035 X 4.0865 X 4.1805 X 4.2785 X 5.425 X 6.248 X - Chuyên ngành công nghệ thực phẩm - Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng xv ... kiện nhiệt độ khảo sát, enzyme phenolase bị vô hoạt dung dịch đệm pH = - nhiệt độ ph? ?ng; nhiệt độ 40oC, 50oC 60oC enzyme phenolase bị vô hoạt pH = - 5; 70oC enzyme bị vô hoạt pH = - Ngồi enzyme phenolase. .. nghiên cứu tiếp vấn đề sau: - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất nồng độ muối lên hoạt tính enzyme phenolase nấm rơm - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ pH đến khả vô hoạt enzyme phenolase nguyên liệu khác... enzyme là: nhiệt độ 60oC, pH = chất catechin - Enzyme phenolase nấm rơm bị vô hoạt pH = 2, pH = 3, pH = Ở nhiệt độ 40 C, 50oC 60oC, enzyme bị vô hoạt pH = - Nhiệt độ 70oC, enzyme bị vô hoạt pH