Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và ph đến hoạt tính enzyme cellulase trích từ nấm mốc

xii PHỤ LỤC 4 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ...xiv 4.1 BẢNG KẾT QUẢ THỐNG KÊ HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE Ở NHIỆT ĐỘ VÀ pH KHÁC NHAU ...xiv 4.2 BẢNG THỐNG KÊ ĐỘ BỀN CỦA ENZYME CELLULASE Ở CÁC pH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BÔ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ pH

LÊN HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE TRÍCH TỪ

NẤM MỐC

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Th.s Nguyễn Thị Thu Thủy Mạch Thị Bích Thy

MSSV: 2071843

Lớp: CB0708A2

Cần Thơ, 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BÔ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



Luận văn đính kèm dưới đây với tên đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và

pH đến hoạt tính enzyme cellulase trích từ nấm mốc” do sinh viên Mạch Thị Bích Thy thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Nguyễn Thị Thu Thủy

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011

Chủ tịch hội đồng

LỜI CẢM ƠN



Qua hơn 3 tháng thực hiện đề tài luận văn tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa nông nghiệp va Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ Em đã hoàn thành xong việc nghiên cứu đề tài của mình Kết quả có được như bây giờ chính là nhờ vào sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô và bạn bè

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Thủy, cô đã hướng dẫn em rất tận tình, quan tâm, động viên và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài để em hoàn thành tốt luận văn này

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô, đặc biệt là quý Thầy, Cô bộ môn Công nghệ thực phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em để em thực hiện tốt đề tài luận văn này

Em chân thành cảm ơn toàn thể lớp Công nghệ thực phẩm khóa 33 và liên thông khóa 35, các bạn là người đã chia sẻ, động viên, khích lệ, đóng góp ý kiến và luôn bên cạnh giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, em xin chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và luôn thành công trong công việc

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011

Sinh viên thực hiện

Mạch Thị Bích Thy

TÓM TẮT



Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài này là khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

đến hoạt tính enzyme cellulase được trích từ nấm mốc Từ đó xác định được nhiệt

độ và pH tối thích của enzyme Từ đó ứng dụng kết quả khảo sát vào việc thủy phân

bã mía

Thí nghiệm được thí nghiệm tiến hành dựa trên cơ sở thay đổi điều kiện nhiệt độ và

pH của môi trường phản ứng, xác định hoạt tính dựa trên hàm lượng đường khử giải phóng ra khi thủy phân trên cơ chất carboxymethylcellulose (CMC) Từ đó, xác

định được ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme cellulase thu

nhận từ nấm mốc Bên cạnh đó, độ bền của enzyme cũng được khảo sát Ngoài ra còn xác định hàm lượng đường khử được sinh ra trong quá trình thủy phân bã mía bằng enzyme cellulase Đề tài tiến hành nghiên cứu những vấn đề sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme cellulase thu nhận từ nấm mốc: Thí nghiệm được tiến hành ở các nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 40 0 C,

50 0 C, 55 0 C, 60 0 C, 70 0 C, 80 0 C, 90 0 C với pH môi trường khoảng từ 2,5 – 7,5 Kết quả nghiên cứu cho thấy: ở các điều kiện khảo sát, hoạt tính enzyme mạnh nhất ở nhiệt độ 55 0 C và pH= 3,0-3,5

- Khảo sát độ bền của enzyme cellulase lấy từ nấm mốc: Thí nghiệm được tiến hành bằng cách giữ enzyme cellulase ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian từ 1 ngày

đến 7 ngày ở các pH khác nhau từ 2,5 – 7,5 Kết quả thí nghiệm cho thấy enzyme

cellulase bền nhất ở môi trường có pH từ 2,5 – 5,0 Enzyme kém bền ở pH từ 5,5 – 7,5 Độ bền của enzyme qua mỗi ngày đều giảm và sau 6 ngày thì enzyme bị mất hoạt tính ở các pH từ 5,5- 7,5

- Khảo sát tỉ lệ enzyme đến quá trình thủy phân bã mía: Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cố định thời gian thủy phân là 48 giờ, nồng độ cơ chất là 5% và bổ sung enzyme với tỉ lệ khác nhau 2%, 3%, 4% Sau đó ủ ở nhiệt độ và pH tối thích của enzyme cellulase (55 0 C và pH 3,0) Kết quả thí nghiệm cho thấy với tỉ lệ enzyme bổ sung là 3%-4% thì hàm lượng đường khử sinh ra tương đối cao (tương ứng là 45,64mg/g bã mía và 45,93 mg/g bã mía)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH SÁCH BẢNG x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

TỔNG QUAN VỀ ENYME 2

2.1 KHÁI NIỆM ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYME 2

2.1.1 Đặc điểm của enzyme 2

2.1.2 Bản chất và cấu tạo hóa học của enzyme 3

2.1.2.1 Bản chất của enzyme 3

2.1.2.2 Cấu tạo hóa học của enzyme 3

2.1.3 Tính đặc hiệu của enzyme 4

2.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme 4

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme 5

2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 5

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 6

2.1.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 6

2.1.5.4 Ảnh hưởng của pH 8

2.1.5.5 Ảnh hưởng của các chất ức chế 8

2.1.5.6 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa 10

2.2 GIỚI THIỆU ENZYME CELLULASE 10

2.2.1 Khái niệm 10

2.2.2 Phân loại cellulase 10

2.2.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 11

2.2.4 Cơ chất cellulose 11

2.2.5 Tổng quan về Carboxy Methyl Cellulose (CMC) 12

2.3 CẤU TRÚC VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 13

2.3.1 Cấu trúc enzyme cellulase 13

2.3.2 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 13

2.4 MỘT SỐ ENZYME ĐƯỢC VI SINH VẬT TỔNG HỢP ĐỒNG THỜI VỚI CELLULASE 14

2.4.1 Hemicellulase 14

2.4.2 Lignase 15

2.5 HOẠT LỰC CỦA CELLULASE 15

2.6 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 16

2.6.1 Một số ứng dụng của cellulase trong thực phẩm 16

2.6.2 Trong sản xuất thức ăn gia súc 16

2.6.3 Trong công nghiệp dệt, giấy và xử lý môi trường 16

2.6.4 Trong kỹ thuật di truyền 17

2.6.5 Trong công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa 17

2.7 QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ 17

2.7.1 Tiền xử lý bã mía 17

2.7.2 Phương pháp tiền xử lý hóa học 17

2.7.3 Phương pháp tiền xử lý cơ học 18

2.7.4 Phương pháp tiền xử lý sinh học 18

2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 18

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 20

3.1.1 Địa điểm, thời gian 20

3.1.2 Nguyên liệu 20

3.1.3 Hóa chất 20

3.1.4 Dụng cụ 21

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và phân tích 21

3.2.1.1 Chuẩn bị mẫu 21

3.2.1.2 Phương pháp phân tích 21

3.2.1.3 Phương pháp thí nghiệm 21

3.2.2 Nội dung và bố trí thí nghiệm 21

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme cellulase được trích từ nấm mốc .21

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát độ bền pH của enzyme cellulase được trích từ nấm mốc 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ pH LÊN HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE 26

4.2 ĐỘ BỀN pH CỦA ENYME CELLULASE 28

4.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ ENZYME CELLULASE ĐẾN LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ SINH RA TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN BÃ MÍA 29

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 KẾT LUẬN 31

5.2 ĐỀ NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC viii

PHỤ LỤC 1 CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM ACETATE THUỐC THỬ DNS VÀ TÍNH TOÁN KẾT QUẢ viii

PHỤ LỤC 2 CÁCH XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE x

2.1 Cách xây dựng đồ thị chuẩn glucose x

2.2 Đường chuẩn của dung dịch glucose chuẩn x

PHỤ LỤC 3 CÁCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN xii

3.1 Cách xác định đường chuẩn protein xii

3.2 Đường chuẩn protein xii

PHỤ LỤC 4 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ xiv

4.1 BẢNG KẾT QUẢ THỐNG KÊ HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE Ở NHIỆT ĐỘ VÀ pH KHÁC NHAU xiv

4.2 BẢNG THỐNG KÊ ĐỘ BỀN CỦA ENZYME CELLULASE Ở CÁC pH KHÁC NHAU TRONG NHỮNG KHOẢNG THỜI GIAN KHÁC NHAU xviii 4.3 BẢNG THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ SINH RA TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VỚI CÁC TỈ LỆ ENZYME KHÁC NHAU xxii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Thuyết “ chìa và ổ khóa” của Fisher 3

Hình 2: Thuyết “tương ứng cảm ứng” của Kosland 4

Hình 3: Sơ đồ tổng quát quá trình xúc tác của enzyme 5

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng 6

Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng .6

Hình 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme .7

Hình 7: Ảnh hưởng của pH lên tốc độ phản ứng 8

Hình 8: Ảnh hưởng của chất ức chế không cạnh tranh 9

Hình 9: Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose 11

Hình 10: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 14

Hình 11: Nguyên liệu bã mía 20

Hình 12: Bã mía sau khi nghiền 20

Hình 13: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 25

Hình 14: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính enzyme cellulase 27

Hình 15: Độ bền pH của enzyme cellulase theo thời gian 28

Hình 16: Biểu đồ đường chuẩn đường khử xi

Hình 17: Biểu đồ đường chuẩn protein xiii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính enzyme cellulase 26

Bảng 2: Hoạt tính của enzyme cellulase khi xử lý trong các môi trường có pH khác nhau theo thời gian 28

Bảng 3: Bảng so sánh hoạt tính enzyme cellulase còn lại sau 5 ngày và 7 ngày 29

Bảng 4: Hàm lượng đường sinh ra ở các nồng độ enzyme khác nhau 30

Bảng 5: Bảng pha dung dịch đệm viii

Bảng 6: Giá trị OD của dung dịch protein chuẩn x

Bảng 7: Cách xây dựng đường chuẩn protein xii

Bảng 8: Giá trị OD của protein chuẩn xii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, enzyme là một chất xúc tác sinh học ngày càng được chọn để sử dụng trong nhiều lĩnh vực do các đặc tính vượt trội của nó so với các chất xúc tác khác,

đáp ứng được các yêu cầu ngày càng cao của nhà sản xuất và tiêu dùng

Công nghệ enzyme ngày nay không chỉ khai thác enzyme vốn có trong hệ thống sống của động thực vật, mà còn nghiên cứu từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Trong các ngành công nghiệp hiện nay người ta thường sử dụng các enzyme amylase, pectinase, protease, cellulase Enzyme cellulase là một trong nhưng enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường Đặc biệt là sử dụng phụ phẩm phụ trong nông nghiệp, enzyme cellulase sẽ thủy phân tạo ra đường glucose cung cấp cho quá trình sản xuất cồn ethylic

Hoạt tính của enzyme cellulase chịu ảnh hưởng nhiều của nhiều yếu tố như: nồng

độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, các chất kìm hãm Chính vì thế, đề tài

này được nghiên cứu để hiểu rõ hơn về sự tác động của nhiệt độ, pH đến hoạt tính enzyme cellulase, khảo sát độ bền của enzyme cellulase, và ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân bã mía để tạo ra lượng đường khử

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài:

- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và pH lên hoạt tính enzyme cellulase,

từ đó xác định được nhiệt độ và pH tối thích của enzyme cellulase

- Khảo sát độ bền của enzyme cellulase

- Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme đến quá trình thủy phân bã mía để tạo ra hàm lượng đường khử

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

TỔNG QUAN VỀ ENYME

2.1 KHÁI NIỆM ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYME

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, enzyme có trong mọi tế bào sinh vật Enzyme có thể xúc tác đặc hiệu cho mọi phản ứng sinh hóa bên trong và bên ngoài cơ thể sinh vật Enzyme có hiệu lực xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hóa học hữu cơ và vô cơ khác Các chất tham gia trong phản ứng do enzyme xúc tác gọi là cơ chất Enzyme có tính đặc hiệu cao vì mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng nhất định tạo thành một hay một số sản phẩm nhất định Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản hay phát triển được

2.1.1 Đặc điểm của enzyme

Vì enzyme là những chất xúc tác nên chúng có tác dụng làm tăng nhanh tốc độ phản

ứng giống như chất xúc tác hóa học nên cũng có các đặc tính sau:

- Enzyme không tham gia vào thành phần sản phẩm cuối của phản ứng và tách ra khỏi phản ứng ở dạng ban đầu Nó không bị tiêu hao trong quá trình xúc tác

- Enzyme không thể kích thích cho những phản ứng trái quy luật nhiệt động học, chúng chỉ thúc đẩy những phản ứng xảy ra khi không có chúng

- Enzyme không xáo trộn vị trí cân bằng phản ứng mà chúng làm tăng nhanh sự

- Hiệu suất xúc tác của enzyme cao hơn những chất xúc tác không phải sinh học

- Enzyme có tính đặc hiệu cao, sự tác dụng của nó có hạn chế và có chọn lọc đối với cơ chất Enzyme chỉ tác dụng lên một chất hoặc một nhóm chất nhất định nào

đó mà không ảnh hưởng đến chất khác có cấu tạo tương tự Nhờ tính chất này mà

trong tế bào vô số các phản ứng enzyme xảy ra không mâu thuẫn, chúng luôn luôn

điều hòa hoạt động độc lập nhau ở các điều kiện bình thường của cơ thể

- Một vài hoạt động của enzyme có tính hiệu chỉnh

- Trong các phản ứng lên men khác với các phản ứng không lên men là chúng có các quá trình phụ không đáng kể, cho nên đối với những phản ứng lên men có đặc

điểm hầu như 100% sản phẩm tạo thành

2.1.2 Bản chất và cấu tạo hóa học của enzyme

2.1.2.1 Bản chất của enzyme

Bản chất của enzyme là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử phức tạp

Do kích thước phân tử lớn, các enzyme không đi qua được màng bàn thấm Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo, chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực khác Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính với nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm Kiềm, acid mạnh, kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính Cũng như protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính

2.1.2.2 Cấu tạo hóa học của enzyme

Enzyme là protein hình cầu có kích thước khác nhau Những phân tử enzyme lớn thường chứa hai hay nhiều chuỗi peptid Dựa vào thành phần cấu tạo của enzyme, người ta chia enzyme thành 2 loại:

- Enzyme đơn giản (enzyme một cấu tử): trong thành phần cấu tạo của nó chỉ gồm các gốc acid amin Những enzyme thuộc nhóm này thường là những enzyme thủy phân có ở đường tiêu hóa như amylase, protease, pepsin, tripsin

- Enzyme phức tạp (enzyme hai hay nhiều cấu tử): trong thành phần của nó ngoài acid amin (protein) nó còn có các nhóm phụ khác có phân tử lượng thấp gọi là phần phi protein hoặc là những yếu tố kết hợp gọi tắt là cofactor gồm các ion kim loại, vitamin, nucleotid, nhân profirin Phần protein của enzyme hai cấu tử gọi là apoenzyme hoặc feren, phần không phải protein dễ dàng phân ly ra khỏi hợp phần protein khi cho thẩm tích qua màng bán thấm và nó có thể tồn tại độc lập gọi là coenzyme

Tất cả các enzyme đều hoạt động xúc tác thông qua những bộ phận đặc hiệu của enzyme, gọi là trung tâm hoạt động Đây là nơi tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất để tạo thành phức hợp trung gian enzyme-cơ chất Trung tâm hoạt động của enzyme tham gia trực tiếp vào việc thành lập và cắt đứt liên kết Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm những nhóm hóa học, những liên kết peptid tiếp xúc trực tiếp với

cơ chất hoặc thông qua vai trò trung gian của nước

Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hình thành sẵn với một cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào thuyết “chìa và ổ khóa” (hình 1) Thuyết này tuy giải thích được một số hiện tượng nhưng không giải thích thỏa đáng được nhiều kết quả thu được trong thực nghiệm

Hình 1: Thuyết “ chìa và ổ khóa” của Fisher

Vì vậy, Koshland đã đưa ra một giả thuyết khác hấp dẫn và tế nhị hơn là thuyết

“tương ứng cảm ứng” Theo thuyết này thì đặc điểm của vùng trung tâm hoạt động

là rất mềm dẻo và linh hoạt, các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động, khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất (hình 2)

Hình 2: Thuyết “tương ứng cảm ứng” của Kosland 2.1.3 Tính đặc hiệu của enzyme

Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định Mỗi enzyme đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất

định và đối với một phản ứng hóa học nhất định Tính chất xúc tác đặc hiệu đó gọi

là tính đặc hiệu của enzyme Tính đặc hiệu là một trong những tính chất cơ bản nhất của một enzyme Do cấu trúc hóa lý đặc biệt của enzyme và đặc biệt là trung tâm hoạt động mà enzyme có tính đặc hiệu rất cao so với phản ứng thông thường khác

Đặc hiệu kiểu phản ứng mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một kiểu phản ứng

chuyển hóa nhất định trong các kiểu phản ứng như oxy hóa khử, phản ứng thủy phân

- Đặc hiệu tuyệt đối: enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định

- Đặc hiệu lập thể: hầu hết các enzyme đều có tính đặc hiệu lập thể tức là nó chỉ

tác dụng lên một dạng đồng phân lập thể nhất định

nối hóa học nhất định trong phân tử cơ chất, không phụ thuộc vào bản chất hoá học của các cấu tử tham gia tạo thành liên kết đó

- Đặc hiệu kép: có một số enzyme có tính đặc hiệu kép tức là cùng một loại

enzyme nhưng có khả năng tác dụng đặc hiệu của cả hai cơ chất có cấu tạo hoàn toàn khác nhau

2.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme

Hầu như tất cả các biến đổi sinh hóa trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa số các chất xúc tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao

Trong phản ứng có sự xúc tác bởi enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme-cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế

năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản

ứng dễ dàng

Quá trình xúc tác enzyme xảy ra theo 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo

ra phức hệ enzyme-cơ chất Phức hệ này thường không bền Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lượng

- Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

- Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra khỏi enzyme

Sơ đồ tổng quát quá trình xúc tác của enzyme (hình 3)

E + S <=> ES → E + P

Hình 3: Sơ đồ tổng quát quá trình xúc tác của enzyme 2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme

2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ở giai đoạn đầu, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính

với nồng độ cơ chất Ở giai đoạn kế tiếp, tốc độ phản ứng cực đại và không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất Ở giai đoạn tiếp theo nếu nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng lên nữa mặc dù vẫn tiếp tục tăng nồng độ cơ chất Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó tốc độ phản ứng không cao hơn được

Sự phụ thuộc đó được thể hiện ở hình 4

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng.

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ lảm tăng tốc độ phản ứng Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào lượng enzyme

Tốc độ phản ứng: V= K [ ]E

Trong đó V là tốc độ phản ứng

[ ]E là nồng độ enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme lên vận tốc phản ứng được thể hiện ở hình 5

Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng.

2.1.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nảo cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu

[S]

Km

Vmax

0 Vmax/2

V

Người ta sử dùng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng:

Cứ tăng 100C thì vận tốc phản ứng sẽ tăng lên từ 1,5 đến 2 lần nếu trong khoảng nhiệt độ thích hợp

Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối

ưu Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau hoàn toàn khác nhau

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính

Ngược lại, ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đấn mức tối ưu Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ

Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính Phản ứng vô hoạt enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn thứ bậc một

E: nồng độ enzyme hoạt động ở thời gian t

E0: nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động

Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme được thể hiện ở hình 6

Hình 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme

Thấp nhất

2.1.5.4 Ảnh hưởng của pH

Enzyme rất nhạy cảm với pH của mội trường, do đó pH có tác dụng rất quan trọng

đối với tốc độ phản ứng của enzyme Mỗi enzyme đều có một trị số pH tối thích cho

sự hoạt động của nó và tại đó tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất Ngoài trị số pH đó thì tốc độ phản ứng sẽ giảm dần Nhiều enzyme có trị số pH tối thích ở vùng trung tính, nhưng cũng có những enzyme hoạt động mạnh ở vùng rất acid như pepsin (pH=1,5) hoặc vùng kiềm như arginase (pH=9,5-9,9)

Đối với một enzyme nhất định thì pH tối thích của nó cũng không cố định mà có thể

thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ của phản ứng hoặc bản chất dung dịch đệm

Như vậy, pH ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme là do chúng tác dụng vào trạng thái ion hóa của phân tử enzyme (nhất là trung tâm hoạt động của enzyme) và của cơ chất, vào độ bền vững của phân tử enzyme do ảnh hưởng của sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein (coenzyme) của enzyme

Nếu pH quá cao hay quá thấp sẽ sẽ làm biến chất enzyme và làm ảnh hưởng đến

điện tích của phân tử enzyme và cơ chất

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được thể hiện ở hình 7

Hình 7: Ảnh hưởng của pH lên tốc độ phản ứng

Tốt nhất Hoạt độ

enzyme

pH

Tùy theo cơ chất tác dụng của chất ức chế mà người ta chia thành hai loại chính: ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh:

- Chất ức chế cạnh tranh: là những chất có công thức cấu tạo gần giống với cơ chất hoặc giống với phần coenzyme của enzyme Khi thêm vào phản ứng enzyme

nó chiếm chỗ phần cơ chất hoặc phân coenzyme,dẫn đến làm enzyme ở trạng thái không hoạt động Do đó, làm giảm vận tốc phản ứng

- Chất ức chế không cạnh tranh

Chất ức chế kết hợp với phân tử enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi dạng không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt

động xúc tác của nó, do đó làm giảm tốc độ phản ứng Vì vậy sau khi kết hợp với

chất ức chế không cạnh tranh enzyme vẫn có thể tiếp tục kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất EIS Quá trình này có thể biểu diễn như sau:

Gọi Vp là là vận tốc cực đại của phản ứng khi có chất ức chế không cạnh tranh

⇒Vp=Vmax khi và chỉ khi [I]/KI →0

Vì vậy loại bỏ chất ức chế ra khỏi enzyme thì enzyme mới có thể hoạt động trở lại bình thường

Sự ảnh hưởng của chất ức chế không cạnh tranh được thể hiện ở hình 8

Hình 8: Ảnh hưởng của chất ức chế không cạnh tranh

Các chất ức chế không cạnh tranh có thể kiềm hãm nhiều loại enzyme khác nhau và chúng có cấu tạo không giống với cơ chất Các chất kìm hãm chung thường là muối của các kim loại nặng như Ag +, Hg2+ hoặc acid trichlor-acetic

2.1.5.6 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt

động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn Các chất

hoạt hóa thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ như các vitamin tan trong nước

2.2 GIỚI THIỆU ENZYME CELLULASE

2.2.1 Khái niệm

Cellulase là một loại enzyme có thể sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật

đơn bào Cellulase thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng thủy phân cellulose

và cả hemicellulose và xúc tác sự phân cắt các liên kết glucoside trong phân tử cellulose cho ra sản phẩm cuối cùng là đường glucose

Thực ra, cellulase là một phức hệ enzyme tùy theo tính chất và cơ chế tác dụng mà người ta chia ra 3 loại chủ yếu: cellobiohydrolase (ex-cellulose), endoglucanase (endo-cellulase), β-glucosidase (cellobiase)

Enzyme cellulase tuy được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn nhiều so với các enzyme amylase, protease, nhưng lại có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường

2.2.2 Phân loại cellulase

Enzyme cellulase tham gia thủy phân cellulose được các nhà khoa học phân ra làm

3 nhóm chủ yếu sau đây:

- Exoglucanase (CBH)= 1,4β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): là một exo-enzyme có khả năng phân cắt đầu không khử của chuỗi cellulose cho ra các

đường đôi cellobiose Enzyme này còn có tên khoa học khác như:

cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase Enzyme này không có khả năng phân hủy cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho endocellulase phân hủy

- Endoglucanase (EG)= 1,4β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): là một endo-enzyme có khả năng phân cắt liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose, trong lichenin và β-D-glucan Sản phẩm của quá trình thủy phân là cellodextrin, cellobiose, và glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh Enzyme này có một loạt các tên khác như: endoglucanase, endo 1,4β-glucanase, C-cellulase

- β-D-glucoside glucohydrolase= Cellobiase (EC 3.2.1.21): enzyme này thủy phân cellobiose và các cellodextrin phân tử thấp tạo thành các đường đơn glucose Chúng không có khả năng thủy phân cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là β-glucosidase

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện yếm khí và hiếu khí Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, trong thiên nhiên không có một vi sinh vật nào có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase Có loài này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzyme này, loài khác lại tổng hợp mạnh loại enzyme khác Chính vì thế sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm

Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này Trong đó, những vi sinh vật sau được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ nhất:

Altenaria tenuis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sidovii, Aspergillusterrus, Celluvibrio gilvus, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma rasem, Trichoderma reesei, Actinomyces spp, Penicilium spp

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.4 Cơ chất cellulose

Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolymer mạch thẳng,

bởi liên kết glucose, và các liên kết glucose này liên kết với nhau bằng liên kết α 1,4 glucoside Tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh Cellulose chứa các glucose không phân nhánh Các gốc glucose trong cellose thường lệch một gốc 1800

-và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc

đường và được cấu tạo như hình 9

Hình 9: Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose)

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000-2.500.000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút VanDerWaals và liên kết hydro

Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên các vi sợi thường không

đồng nhất Chúng thường tồn tại hai vùng:

- Vùng kết tinh: Ở vùng kết tinh, cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài Enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên

bề mặt hệ sợi ở vùng này

- Vùng vô định hình: Ở vùng này, cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác

động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme

cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần

so với chiều dài phân tử cellulose kết tinh Các cây gỗ lâu năm thường chứa đựng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình

Trong thiên nhiên, khi thực vật và vi sinh vật có chứa cellulose bị chết, cellulose của chúng chỉ bị phân hủy bởi cả một tập đoàn vi sinh vật Các loài vi sinh vật sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose được đi vào các con đường chuyển hóa trong chu kỳ chuyển hóa vô tận của thiên nhiên

Trong thực vật cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn, số lượng cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật Người ta cho thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể chiếm tới 80-95%

Ở vi sinh vật, cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực

vật Ở đó, cellulose thường thuộc loại cellulose vô định hình Chính vì thế việc phân hủy chúng thường rất dễ dàng

(Theo Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.2.5 Tổng quan về Carboxy Methyl Cellulose (CMC)

CMC là một hợp chất được tổng hợp qua phản ứng giữa cellulose và acid chloroacetic trong môi trường kiềm

Phân tử CMC có độ nhớt cao và tan trong nước

CMC có khả năng ổn định hệ huyền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn dùng trong khai mỏ và dầu khí Trong công nghiệp, CMC được dùng để hồ vải

NaOH ClCH 2 -COOH

2.3 CẤU TRÚC VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 2.3.1 Cấu trúc enzyme cellulase

Trong những năm 1970, nhờ những phát triển trong lĩnh vực hóa sinh và sinh học phân tử, người ta có thể nghiên cứu được cấu trúc của cellulase thông qua giống

nấm mốc Trichoderma reesi Đây là chủng nấm mốc phổ biến sản sinh ra enzyme

cellulase Vào cuối những năm 1980, các nhà khoa học đã đề nghị cấu trúc bậc 3

của Trichoderma reesi CBH I (enzyme thủy phân cellobiose I- cellobiohydrolase I)

và CBH II

Trong đó enzyme gồm:

- Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain) với kích thước lớn

- Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) có kích thước nhỏ hơn Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose CBD của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm có 36 amino acid và có một mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh Về mặt lý thuyết có thể kết luận rằng CBD có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời của cellulase và bề mặt cellulose Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho các phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này Chính tương tác giữa hai vùng có tính chất kỵ nước của celllulose và CBD mà enzyme được liên kết với cellulose

- Cầu nối peptide: có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau Đối với enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino acid serine, threonin và proline

Cellulase có nguồn gốc từ các giống nấm mốc khác cũng như từ vi khuẩn đều có cấu trúc tương tự

2.3.2 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Trong tự nhiên, các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase là endoglucanase (EG), cellobiohydrolase (CBH) và β-glucosidase (BGL) hay cellobiase sẽ phối hợp với nhau từng bước thủy phân hoàn toàn cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose

Trước tiên EG (endoglucanase) sẽ tác động mạnh đến vùng cellulose vô định hình cắt bất kỳ cho ra những đoạn cello-oligomers, sau đó CBH sẽ tác động vào phần kết tinh và phân hủy cho ra các cellobiose, cuối cùng thì β-glucosidase sẽ thủy phân cellobiose cho sản phẩm là glucose (một cellobiose bị thủy phân cho ra hai glucose)

Cơ chế tác dụng được thể hiện ở hình 10

Hình 10: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Ở thực vật, hemicellulose chiếm một số lượng rất lớn Hemicellulose được cấu tạo

từ các loại đường khác nhau Vì thế tên gọi của chúng thường theo tên một loại

đường nào đó chiếm tỷ lượng lớn trong thành phần cùa hemicellulose

Phân tử lượng của hemicellulose nhỏ hơn phân tử lượng của cellulose rất nhiều Hemicellulose thường được cấu tạo từ 150 gốc đường Các gốc đường này được nối với nhau bằng các liên kết β-1,4, β-1,3, β-1,6 glucoside Chúng thường là những mạch ngắn, phân nhánh Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng dễ dàng bị phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm Khi hemicellulose bị phân hủy, chúng tạo thành các monosaccharide

Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ, cây lá rộng Ở những cây lá kim thường chứa ít xylan

Trong tế bào thực vật, xylan thường nằm xen kẽ giữa các bó sợi cellulose tạo nên một dạng cấu trúc bền vững

Các hemicellulase là enzyme phân giải cellulose thường được vi sinh vật tổng hợp với số lượng khá lớn Các cấu trúc của chúng cũng đơn giản hơn và kém bền vững hơn enzyme cellulase

Trong khi nuôi cấy vi sinh vật theo quy mô công nghiệp, enzyme hemicellulase thường được vi sinh vật sinh tổng hợp sớm hơn enzyme cellulase Quá trình tổng hợp này có liên quan đến cơ chất mà chúng tham gia phân hủy So với cellulose, hemicellulose kém bền hơn, do đó chúng bị phân hủy trước cellulose

2.4.2 Lignase

Nhiều nhà khoa học cho thấy rằng, có nhiều enzyme tham gia quá trình oxy hóa đều

có khả năng phân hủy lignin Lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ở thực vật bậc cao, có trong các cây dương xỉ Trong rong rêu, địa y và tảo chưa thấy

có lignin

Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và trong acid vô cơ Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4, lignin bị phân giải, tạo ra những hợp chất thơm Trong thực vật, chúng như chất xi măng liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố, các vi sinh vật từ bên ngoài

Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin được tạo ra, không bị biến đổi sinh lý Chúng có cấu tạo rất phức tạp, tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu khác nhau Trong đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, cynafilic, cumarylic Các loại rượu này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-C và C-O

Quá trình phân giải lignin là một quá trình phức tạp, có rất nhiều ý kiến nhưng những kết luận sau được nhiều nhà khoa học đồng tình hơn cả Quá trình này qua các bước sau:

- Lignase oxy hóa mạch bên của phenylpropan

- Hình thành nhóm carboxyl thơm

- Tách nhóm methoxyl

- Hydroxyl hóa vòng thơm

2.5 HOẠT LỰC CỦA CELLULASE

Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của nó Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác được 1 micromol cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên phương pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng khác nhau

Cơ chất thường sử dụng để xác định hoạt độ enzyme là: sợi bông, giấy, bột cellulase, hydrocellulase Các dẫn xuất của cellulose (như CMC, oxyethyl cellulose) Đối với enzyme CBH, cơ chất tốt nhất là CMC và oxyethyl cellulase

(Theo Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

Có nhiều phương pháp để xác định hoạt độ của cellulase và các phương pháp này dựa vào một trong các nguyên tắc sau:

- Xác định sự giảm trọng lượng cơ chất cellulose không hòa tan

- Xác định sự giảm tính chất cơ học của các sợi hay các màng mỏng

- Xác định sự thay đổi độ đục của dung dịch cơ chất

- Xác định sự tăng các nhóm khử tận cùng

- Dùng phương pháp so màu để xác định sản phẩm hòa tan của cellulose

- Xác định bán kính vòng thủy phân trên môi trường thạch cellulose

Các phương pháp thích hợp để xác định hoạt độ cellulase là các phương pháp xác

định trực tiếp đơn vị hoạt động Nồng độ enzyme trong dịch môi trường thường được biễu diễn bằng số đơn vị/ml

Độ hoạt động của enzyme được tính bằng đơn vị/ml môi trường hoặc gam chế

phẩm Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme phân giải cơ chất tạo thành 1 mg glucose sau 1 giờ tác dụng ở nhiệt độ 400C, pH= 5,0

(Theo Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.6 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE

Hiện nay, enzyme cellulase có nguồn gốc từ vi sinh vật được sản xuất với quy mô công nghiệp và được ứng dụng rộng rãi vào các lĩnh vực khác nhau của cuộc sống Một số ứng dụng chủ yếu như sau:

2.6.1 Một số ứng dụng của cellulase trong thực phẩm

- Trong công nghiệp rượu bia và chế biến nước quả:

Thành phần β-glucanase trong nho và các loại quả thì thường thấp hơn trong ngũ cốc nhưng cũng rất quan trọng trong việc bảo vệ thành phần bên trong Cellulase kết hợp với các enzyme khác như pectinase, hemicellulase ứng dụng vào trong các sản phẩm rượu và nước quả với chức năng làm mềm lớp vỏ vên ngoài của chúng, tăng hiệu suất trích ly màu và dễ dàng thực hiện cho quá trình lọc và phân tách sản phẩm

- Trong sản xuất bánh

Khi cho enzyme vào trong quá trình làm bánh sẽ làm tăng chất lượng sản phẩm Enzyme sẽ hoạt động trên vách tế bào để thủy phân cellulose trên vách chính là thành phần xơ lẫn trong bánh

2.6.2 Trong sản xuất thức ăn gia súc

Cellulase kết hợp với pectinase thành phức hợp enzyme có thể tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc đối với các loại thức ăn cứng, góp phần vận dụng tối đa vật liệu thừa thải làm thức ăn cho vật nuôi, hạ giá thành thức ăn

2.6.3 Trong công nghiệp dệt, giấy và xử lý môi trường

Thủy phân cây bông trong dệt, gỗ trong sản xuất giấy Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được sử dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường

2.6.4 Trong kỹ thuật di truyền

Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền Người ta dùng enzyme phá vỡ thành tế bào thực vật

Trong sản xuất dược liệu có nguồn gốc thực vật, trong nuôi cấy tế bào và tái tổ hợp Cellulase phá vỡ tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật được dễ dàng Điều này còn giúp việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào “trần” lai tạo những tế bào khác nhau tạo ra tế bào mới theo ý muốn

(Nguyễn Đức Lượng et al.,2004)

2.6.5 Trong công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa

Enzyme cellulase được ứng dụng trong chất tẩy rửa nhằm mục đích làm mềm vải cotton

(Nguyễn Đức lượng, 2004)

Từ nguồn nguyên liệu cellulose sẵn có sử dụng enzyme cellulase của Trichoderma

viride để chuyển hóa thành dịch đường và dịch đường được sử dụng để cho nấm

men lên men tạo thành ethanol là dạng nhiên liệu trong tương lai đang được nghiên cứu áp dụng

Để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose

thành glucose, các polymer phải bị bẽ gãy thành những phân tử đường Tuy nhiên bản chất của cellulose lại rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền

xử lý (bằng NaOH) là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose diễn ra tốt

Vì vậy, enzyme không thể thủy phân lignocellulose mà không tiền xử lý, đây là một trong những bước quan trọng nhất của quá trình thu nhận đường từ lignocellulose Nói tóm lại, quá trình tiền xử lý nhằm:

- Tăng vùng vô định hình của cellulose

- Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass

-Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose

Tiền xử lý bao gồm các phương pháp:

2.7.2 Phương pháp tiền xử lý hóa học

Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình

- Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi nước có acid Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kỹ nhất, hiển nhiên vì

nó rẻ và hiệu quả Tuy nhiên vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu

được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hòa với Ca(OH)2

- Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là xút (NaOH) trong nước sôi hoặc xút cùng các hóa chất khác Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất thì vôi tôi là hóa chất thích hợp

- Ngoài ra còn có các phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2,

NH3

Nhóm phương pháp này có tác dụng làm thay đổi trong sinh khối (biomass): tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của lignocellulose, quá trình delignification một phần hoặc gần như hoàn toàn, giảm vùng kết tinh của cellulose, giúp thủy phân một phần hoặc hoàn toàn hemicellulose Hầu hết các phương pháp thuộc nhóm này dễ ứng dụng trong công nghiệp, thường tốc độ xử lý nhanh

2.7.3 Phương pháp tiền xử lý cơ học

Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý Gồm các phương pháp như: nghiền, chiếu bức xạ năng lượng, xử lý thủy nhiệt, nổ hơi Ưu điểm làm tăng bề mặt tiếp xúc, kích thước lỗ rỗng, giảm vùng kết tinh của cellulose Tuy nhiên phương pháp tiền xử lý cơ học cần năng lượng cao, không thể loại bỏ lignin trong cấu trúc lignocellulose Được ứng dụng trong sản xuất ethanol

từ ngũ cốc, quá trình nghiền làm giảm kích thước của hạt tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme thủy phân Tuy nhiên đối với lignocellulose đòi hỏi tiền xử lý bằng cơ học

ở cường độ cao hơn, như nổ hơi nước

2.7.4 Phương pháp tiền xử lý sinh học

Sử dụng nấm và vi khuẩn có tác dụng giảm mức độ trùng hợp của cellulose, thủy phân một phần hemicellulose Phương pháp này yêu cầu năng lượng thấp, không hóa chất, điều kiện môi trường ấm Tuy nhiên tốc độ xử lý chậm, thời gian xử lý rất lâu

2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

- Theo Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh và các cộng sự của Viện sinh học nhiệt đới- Viện khoa học và công nghệ Việt Nam nghiên cứu trên enzyme cellulase

được trích từ Trichoderma reesei trong đề tài: “Thu nhận enzyme cellulase của

Trichoderma reesei trên môi trường bán rắn” cho thấy: môi trường tối ưu cho Trichoderma reesei sinh ra cellulase là với tỉ lệ bã mía:cám mì là 7:3; 8 lần nồng độ

dinh dưỡng, độ ẩm ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày Hoạt tính CMCase là 280,63 IU/g Dịch chiết enzyme cellulase đường hóa khoảng 20% giấy in đã qua sử dụng (10%) trong 24 giờ thủy phân ở 500C, pH 5,0; dịch đường hóa chứa 23,62 mg

đường khử/ml có thể sử dụng để lên men ethanol hoặc để lên men sản xuất các sản

phẩm có giá trị

- Theo M Sadia, N Aslam, S Naim, H Salee và A Jamil nghiên cứu trên

endoglucanase được trích từ Trichoderma harzianum trong đề tài: “Purification of Endoglucanase From Trichoderma harzianum” cho thấy: khi sử dụng

carboxymethylcellulose làm cơ chất, enzyme có nhiệt độ tối thích là 600C và pH tối