Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lí đầu tôm
Thuyết minh:
• Nguyên liệu: Nguyên liệu đầu tôm sau khi mua về được chia nhỏ theo khối lượng sử dụng , đựng trong các túi bóng và đem đi bảo quản đông ở -200C, thời gian sử dụng không được quá bốn tuần.
• Xay nghiền: Cân 50g nguyên liệu đầu tôm đã bảo quản đông, đem đi xay nhỏ. Sau đó cho ra bình tam giác 250ml, cho dung dịch đệm phosphate với pH xác định vào với tỉ lệ 1:2 (50g đầu tôm/100ml đệm). Để hạn chế vi sinh vật làm ảnh hưởng đến kết quả cũng như ảnh hưởng đến hoạt độ của hệ enzyme trong
Nguyên liệu Xay nghiền Lọc ép Dịch lọc Li tâm Dịch li tâm Bổ sung đệm Bã Cặn
dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng, sử dụng tetracycline 1‰, với tỉ lệ bổ sung là 1: 1 so với đệm đã sử dụng (ml/ml). Tetracycline là kháng sinh có phổ tác dụng rất rộng, tác dụng nhiều vi khuẩn gram âm và gram dương, cả ưa khí và kị khí, xoắn khuẩn và vi khuẩn nội bào Clamydia, Rickettsia, Mycoplasma. Tetracycline có
tác dụng kiềm khuẩn là do ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn.
Tiếp tục lấy giấy bạc đậy miệng bình tam giác, rồi cho vào ngăn lạnh trong khoảng thời gian 40 phút, sau đó tiến hành lọc.
• Lọc: Tiến hành lọc qua rây, lấy phần dịch, bỏ bã. Dịch sẽ cho qua lọc với vải ra hai lớp. Thời gian lọc phải diễn ra nhanh chóng để hạn chế vi sinh vật lây nhiễm vào dịch chiết .
• Li tâm: Dịch lọc thu được sẽ cho vào các ống li tâm và được cân bằng với nhau trước khi thực hiện li tâm với chế độ 7000 vòng, 900 giây, 40C. Sau khi li tâm, thu dịch và bỏ phần cặn.
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình thủy phân dịch chiết đầu tôm.
Thuyết minh:
• Thủy phân: Dịch chiết sau khi được li tâm sẽ được cho vào các ống nghiệm và tiến hành thủy phân ở nhiệt độ và thời gian xác định (mỗi ống nghiệm chứa 3ml dịch và được kí hiệu đầy đủ) như Hình 3.3 bố trí thí nghiệm.
• Xác định hoạt độ: Sau đó được lấy ra, cho 3ml TCA 20% (Trichloroacetic acid), để lắng 20 phút, tiền hành lọc. Tiếp tục từ mỗi ống nghiệm, dịch đã lọc đem pha loãng với tỉ lệ 1:10 (ml/ml), đem vortex trước khi chuyển qua đo ở bước sóng 280 nm.
Xác định hoạt enzyme theo phương pháp Anson cải tiến:
+ Hóa chất: • Tyrosine / HCl.
• Đệm phosphate ( NaH2PO4, Na2HPO4). • TCA 20%. Dịch chiết đầu tôm Thủy phân Dịch thủy phân
Quan sát thời gian
Quan sát nhiệt độ
Xác định hoạt độ
+ Tiến hành:
• Cho 3ml dung dịch chứa enzyme vào ống nghiệm, sau đó cho 3ml TCA 20% vào. Để lắng 20 phút rồi lọc, tiến hành đo UV ở 280nm.
• Xây dựng đường chuẩn: (Tyrosine tan trong HCl 0,2M) 200 µg tyrosine/ ml 100 µg tyrosine/ ml 50 µg tyrosine/ ml 25 µg tyrosine/ ml 12,5 µg tyrosine/ml 6,25 µg tyrosine/ ml 3.2.2. Bố trí thí nghiệm:
Đánh giá khả năng thủy phân của hệ protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng ở các điều kiện thủy phân thích hợp (pH môi trường, nhiệt độ và thời gian thủy phân) của hệ các enzyme này.
pH của dung môi chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành thu dịch chiết chứa các enzyme protease từ mẫu đầu tôm thẻ chân trắng bằng đệm phosphate với các pH từ 4 đến pH=8 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/ dung dịch (w/v) là 1: 2, được giữ trong ngăn bảo quản lạnh 40C trong 40 phút. Sau đó lọc và tiến hành li tâm lạnh ở chế độ: 6000 vòng/phút, thời gian 15 phút, nhiệt độ 40C, thu được dịch chiết.
Hoạt tính của enzyme còn chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian ủ trong quá trình thủy phân vì nó liên quan đến độ bền protein dưới tác động của nhiệt độ trong thời gian nhất định. Tiến hành thủy phân dịch chiết ở các nhiệt độ: 40, 50, 60, 700C trong các bể ổn nhiệt, đồng thời với việc quan sát thời gian trong 6 giờ với bước nhảy là 30 phút để xác định hoạt độ của hệ protease.
Mặt khác mục đích của đề tài là đánh giá khả năng thủy phân của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng, cho nên trong dịch chiết mà chúng ta tiến hành khảo sát là một hệ gồm rất nhiều enzyme khác nhau với những điều kiện hoạt động thích hợp khác nhau. Do đó tiến hành thực nghiệm theo các sơ đồ bố trí như sau:
Hình 3.4: Bố trí thí nghiệm xác định khả năng thủy phân của hệ protease trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng.
Ở các nhiệt độ khác nhau (400C, 50°C, 60°C, 70°C) bố trí thí nghiệm ở các pH khác nhau (3, 4, 5, 6, 7, 8) và theo dõi ở các khoảng thời gian 30 phút (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 giờ)
Dịch chiết đầu tôm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pH 3 4 5 6 7 8 Thủy phân Quan sát thời gian 0-6 giờvới bước nhảy 0,5 giờ Quan sát nhiệt độ 40, 50, 60, 700C Xác định hoạt độ
Bảng 3.1: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 400C Thời gian (h) pH 0 0,2 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 3 3-0 3-0,5 3-1 3-1,5 3-2 3-2,5 3-3 3-3,5 3-4 3-4,5 3-5 3-5,5 3-6 4 4-0 4-0,5 4-1 4-1,5 4-2 4-2,5 4-3 4-3,5 4-4 4-4,5 4-5 4-5,5 4-6 5 5-0 5-0,5 5-1 5-1,5 5-2 5-2,5 5-3 5-3,5 5-4 5-4,5 5-5 5-5,5 5-6 6 6-0 6-0,5 6-1 6-1,5 6-2 6-2,5 6-3 6-3,5 6-4 6-4,5 6-5 6-5,5 6-6 7 7-0 7-0,5 7-1 7-1,5 7-2 7-2,5 7-3 7-3,5 7-4 7-4,5 7-5 7-5,5 7-6 8 8-0 8-0,5 8-1 8-1,5 8-2 8-2,5 8-3 8-3,5 8-4 8-4,5 8-5 8-5,5 8-6
Bảng 3.2: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 500C
Thời gian (h) pH 0 0,2 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 3 3-0 3-0,5 3-1 3-1,5 3-2 3-2,5 3-3 3-3,5 3-4 3-4,5 3-5 3-5,5 3-6 4 4-0 4-0,5 4-1 4-1,5 4-2 4-2,5 4-3 4-3,5 4-4 4-4,5 4-5 4-5,5 4-6 5 5-0 5-0,5 5-1 5-1,5 5-2 5-2,5 5-3 5-3,5 5-4 5-4,5 5-5 5-5,5 5-6 6 6-0 6-0,5 6-1 6-1,5 6-2 6-2,5 6-3 6-3,5 6-4 6-4,5 6-5 6-5,5 6-6 7 7-0 7-0,5 7-1 7-1,5 7-2 7-2,5 7-3 7-3,5 7-4 7-4,5 7-5 7-5,5 7-6 8 8-0 8-0,5 8-1 8-1,5 8-2 8-2,5 8-3 8-3,5 8-4 8-4,5 8-5 8-5,5 8-6
Bảng 3.3: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 600C Thời gian (h) pH 0 0,2 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 3 3-0 3-0,5 3-1 3-1,5 3-2 3-2,5 3-3 3-3,5 3-4 3-4,5 3-5 3-5,5 3-6 4 4-0 4-0,5 4-1 4-1,5 4-2 4-2,5 4-3 4-3,5 4-4 4-4,5 4-5 4-5,5 4-6 5 5-0 5-0,5 5-1 5-1,5 5-2 5-2,5 5-3 5-3,5 5-4 5-4,5 5-5 5-5,5 5-6 6 6-0 6-0,5 6-1 6-1,5 6-2 6-2,5 6-3 6-3,5 6-4 6-4,5 6-5 6-5,5 6-6 7 7-0 7-0,5 7-1 7-1,5 7-2 7-2,5 7-3 7-3,5 7-4 7-4,5 7-5 7-5,5 7-6 8 8-0 8-0,5 8-1 8-1,5 8-2 8-2,5 8-3 8-3,5 8-4 8-4,5 8-5 8-5,5 8-6
Bảng 3.4: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 700C
Thời gian (h) pH 0 0,2 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 3 3-0 3-0,5 3-1 3-1,5 3-2 3-2,5 3-3 3-3,5 3-4 3-4,5 3-5 3-5,5 3-6 4 4-0 4-0,5 4-1 4-1,5 4-2 4-2,5 4-3 4-3,5 4-4 4-4,5 4-5 4-5,5 4-6 5 5-0 5-0,5 5-1 5-1,5 5-2 5-2,5 5-3 5-3,5 5-4 5-4,5 5-5 5-5,5 5-6 6 6-0 6-0,5 6-1 6-1,5 6-2 6-2,5 6-3 6-3,5 6-4 6-4,5 6-5 6-5,5 6-6 7 7-0 7-0,5 7-1 7-1,5 7-2 7-2,5 7-3 7-3,5 7-4 7-4,5 7-5 7-5,5 7-6 8 8-0 8-0,5 8-1 8-1,5 8-2 8-2,5 8-3 8-3,5 8-4 8-4,5 8-5 8-5,5 8-6
Chương IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
4.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme
protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở các nhiệt độ khác nhau
4.1.1.Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắngở 40°C
Protease từ đầu tôm thẻ được tách chiết theo quy trình trên bằng cách hòa tan mẫu đã được làm nhỏ vào đệm phosphate ở các pH khác nhau từ pH 3 đến pH 8. Thực hiện theo quy trình, ở mỗi pH thực hiện việc ủ với nhiệt độ 40°C và cứ cách 30 phút thực hiện việc lấy mẫu một lần để tiến hành bước xác định lượng acid amin tương đương tyrosine tạo thành sau khi tủa bằng TCA. Kết quả được trình bày ở phần phụ lục-Bảng 5 và trên Hình 4.1.
Thực nghiệm cho thấy, ở cùng một nhiệt độ 40°C, hàm lượng tyrosine hình thành tăng dần khi ta tăng thời gian ủ trong khoảng thời gian thí nghiệm 6 giờ. Ở cuối thí nghiệm (tại thời điểm 6 giờ) lượng acid amin tương đương tyrosine hình thành vẫn còn tăng, điều này có nghĩa phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease vẫn còn, hay nói cách khác, enzyme protease vẫn còn hoạt tính. Do điều kiện phòng thí nghiệm nên chưa thể kéo dài để xác định thời điểm cuối cùng mà phản ứng thủy phân giảm mạnh hoặc ngừng hẳn.
Hình 4.1: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của
Khi so sánh với các phản ứng ở các pH khác nhau thì hàm lượng acid amine tương đương tyrosine hình thành cũng khác nhau.
Ở pH 5 và pH 6, phản ứng thủy phân do protease xảy ra mạnh ở khoảng 3 giờ đầu, hơn hẳn so với pH cao hơn (7-8), điều này cho thấy các enzyme acid (thích hợp ở pH thấp) hoạt động mạnh ở nhiệt độ này nhiệt độ 400C. Ở thời gian sau từ 3-6 giờ lượng acid amin tương đương tyrosine hình thành tăng không nhiều, chứng tỏ enzyme này đã giảm bớt hoạt tính, kéo dài phản ứng thủy phân không có lợi.
Ở pH 3, pH 4, cũng có kết quả tương tự, nhưng trên số liệu và đồ thị cho thấy kết quả đo được vẫn còn tiếp tục tăng ở cuối khoảng thời gian khảo sát (6 giờ). Tại thời điểm 6 giờ, kết quả đo được có ít hơn so với kết quả thủy phân ở pH 5, pH 6. Dự đoán nếu kéo dài thời gian tổng lượng acid amin tương đương tyrosine hình thành sẽ lớn hơn.
Trái lại, ở pH 7 và pH 8, lượng acid amin tương đương tyrosine đo được tăng lên chậm nhưng đều theo thời gian trong khoảng 6 giờ khảo sát. Những enzyme kiềm (thích hợp ở pH 8) hoạt động yếu ở 40°C, và rõ ràng cũng ít bị biến tính, nếu thủy phân trong điều kiện này, kéo dài thời gian thủy phân sẽ không có lợi .
4.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme
protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C
Kết quả thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4 phần phụ lục, và được minh họa ở Hình 4.2. Kết quả thực nghiệm cho thấy lượng acid amin tương đương tyrosine hình thành ở tất cả các pH đều tăng, tăng nhanh và rõ trong khoảng 3 giờ thí nghiệm đầu.
Ở pH khác nhau, mức độ thủy phân theo thời gian cũng khác nhau
Ở pH 8, lượng acid amin tương đương tyrosine đo được tăng cao, rõ ở khoảng thời gian 3 giờ đầu. Sau đó có lẽ do enzyme bị bất hoạt mạnh nên kết quả
đo được tăng không đáng kể. So vói kết quả thu được ở 40°C (Hình 4.1), enzyme kiềm này hoạt động tốt hơn ở 50°C.
Ở các pH còn lại, pH 4 và pH 5, kết quả có phần trội hơn, các enzyme acid vẫn còn có tác dụng. Ở pH 5, đến thời điểm 5 giờ, enzyme vẫn còn hoạt tính thủy phân. Tuy nhiên sau 5 giờ, đường biểu diễn nằm ngang, enzyme đã bị bất hoạt.
Hình 4.2 : Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 50°C
Ở pH 3, cho thấy ở 50°C enzyme hoạt động yếu, sau 2 giờ đã bị bất hoạt đáng kể, trong khoảng thời gian khảo sát từ 2 giờ đến 6 giờ, lượng acid amin tương đương tyrosine đo được hầu như không thay đổi.
4.1.3 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme
protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C
Kết quả được trình bày ở phần phụ lục, Bảng 3 và được thể hiện trên đồ thị Hình 4.3. Qua lượng tyrosine hình thành được trình bày ở Hình 4.3 cho thấy khi ta tăng nhiệt độ thủy phân lên 600C, ảnh hưởng của pH khá rõ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ở pH 8, kết quả tăng rõ ở 3,5 giờ đầu, sau đó enzyme bị bất hoạt, kết quả tương tự như ở nhiệt độ 50°C.
Ở pH 5, kết quả thu được cho thấy tác dụng thủy phân protein tốt ở 2 giờ đầu, sau 2 giờ enzyme bị mất hoạt tính rõ. Kết quả thủy phân thấp hơn nhiều so với pH 7.
Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 60°C
4.1.4 Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 70°C
Kết quả được trình bày ở Bảng 2 phần phụ lục, được minh họa ở Hình 4.4.
Hình 4.4: Ảnh hưởng của pH môi trường, thời gian ủ đến hoạt độ của enzyme protease trong dịch chiết từ đầu tôm thẻ chân trắng ở 70°C
Ở nhiệt độ cao 70°C, kết quả thủy phân xảy ra rất tốt trong 1 giờ đầu tiên, sau đó phản ứng giảm hẳn. Ở pH 8, kết quả cho thấy tác dụng thủy phân tốt nhất.
Đặc biệt ở pH=3 thì lại thể hiện sự gia tăng tuy ít và chậm nhưng lại có một lần nữa chứng tỏ rằng trong hệ enzyme dịch chiết tôm có enzyme protease acid họat động trong môi trường pH 3, nhiệt độ cao 70°C, và tương đối bền nhiệt so với các enzyme hoạt động tốt trong môi trường kiềm nhẹ và trung tính.
Qua những phân tích trên có thể tóm tắt lại như sau: pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ của enzyme thông qua lượng acid amin thủy phân được tính theo tyrosine có sự khác biệt với nhau. Hoạt tính của hệ enzyme protease trong dịch chiết đầu tôm hoạt động mạnh khi ở nhiệt độ cao (nhiệt độ càng cao thì lượng acid amin thủy phân được nhiều trong khoảng thời gian đầu) điều này rất có ý nghĩa trong việc bố trí trong quá trình thủy phân có áp dụng bài toán kinh tế. Nếu thực hiện quá trình thủy phân ở nhiệt độ cao thì nên duy trì thời gian ngắn, trong khoảng 2 giờ là được. Mặt khác chúng ta còn có thể nhận ra được rằng tuy ở pH kiềm nhẹ thì cho kết quả thủy phân cao hơn nhưng thời gian