Ứng dụng phương pháp in Situ hybridiza để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú

Ứng dụng phương pháp in Situ hybridiza để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng – 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng – 2005 ii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trƣờng TS Nguyễn Văn Hảo tận tình bảo, hƣớng dẫn giải đáp khó khăn, vƣớng mắc suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp CN Phạm Văn Điền CN Hứa Đức Quới giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài TS Lý Thị Thanh Loan ThS Đinh Thị Thủy tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực tập Viện Các anh chị làm việc phịng Mơ Học, phòng Sinh Học Phân Tử phòng Chất Lƣợng Nƣớc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Cơ Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú n giúp tơi thu mẫu hồn thành đề tài Các bạn bè thân yêu lớp CNSH K27 chia xẻ vui buồn thời gian học nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Thành phố HCM, tháng năm 2005 Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh iii TÓM TẮT PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng – 2005 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO Đề tài đƣợc thực từ – – 2005 đến 30 – – 2005, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, hai đối tƣợng TSV P vannamei (Postlarvae thƣơng phẩm) WSSV P monodon (Postlarvae thƣơng phẩm) Hai loại virus có mức độ nguy hiểm khả tạo dịch bệnh lớn tôm ni Việt Nam Do đó, chúng tơi sử dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai chỗ nhằm mục tiêu phát nhanh xác mẫu tơm nhiễm bệnh Taura đốm trắng, để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phịng ngừa lây lan bùng phát hai loại dịch bệnh Đề tài gồm thí nghiệm sau: Các thí nghiệm P vannamei Thí nghiệm theo quy trình chuẩn kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán TSV P vannamei Sau thực thí nghiệm này, chúng tơi nhận thấy phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng hiệu chẩn đoán TSV P vannamei Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm Viện, gồm thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu, thực nghiệm thức Kết nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe đƣợc biến tính trƣớc 950C 10 phút, làm lạnh nhanh giữ 40C; lai cho dung dịch lai có probe biến tính lên mẫu thực biến tính mẫu 700C phút, sau ủ mẫu qua đêm 420C) tốt postlarvae tơm thƣơng phẩm  Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ƣu với Proteinase K, thực nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút 19 phút Kết thời gian cắt với Proteinase K tối ƣu postlarvae 15 phút tơm thƣơng phẩm 17 phút  Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực nghiệm thức: 100µl, 75µl 50µl Kết thể tích dung dịch lai thích hợp tơm postlarvae tơm thƣơng phẩm 75µl Các thí nghiệm P monodon Thí nghiệm theo quy trình chuẩn kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán WSSV P monodon Sau thực thí nghiệm này, nhận thấy iv phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng hiệu chẩn đoán WSSV P monodon Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng điều kiện phịng thí nghiệm Viện, gồm thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm thay đổi số hóa chất thơng dụng nhƣ cồn tuyệt đối, xylene paraformaldehyde Việt Nam Trung Quốc sản xuất, nhằm giảm chi phí chẩn đốn Kết thí nghiệm cho thấy khơng có khác biệt so với thí nghiệm dùng hóa chất nhƣ kit khuyến cáo sử dụng  Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực tôm postlarvae thƣơng phẩm, kết lai thực theo quy trình khơng khác với kết lai theo quy trình chuẩn  Thí nghiệm biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai: thực tôm postlarvae thƣơng phẩm thu đƣợc kết không khác với kết lai theo quy trình chuẩn  Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe mẫu đồng thời lame: thực tôm postlarvae thƣơng phẩm thu đƣợc kết không khác với kết lai theo quy trình chuẩn Thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mơ học PCR Thí nghiệm đƣợc thực P vannamei (postlarvae tôm thƣơng phẩm) P monodon (postlarvae tôm thƣơng phẩm) Kết thí nghiệm cho thấy phƣơng pháp ISH có độ ổn định, độ xác nhạy mơ học PCR Từ kết thực nghiệm nhƣ trên, chúng tơi đƣa quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ xác cao thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng đƣợc việc kiểm tra mầm bệnh WSSV TSV gây tơm ni điều kiện phịng thí nghiệm hệ thống nuôi tôm Việt Nam v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt xi Danh sách hình sơ đồ xii Danh sách bảng xiv CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU I.1 Đặt vấn đề I.2 Mục tiêu đề tài I.3 Yêu cầu đề tài I.4 Nội dung đề tài CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Tình hình ni tơm giới II.1.1 Hiện trạng chung II.1.2 Các hình thức nuôi II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm giới II.2 Tình hình ni tơm Việt Nam II.2.1 Hiện trạng chung II.2.2 Các mơ hình ni tơm đƣợc áp dụng II.2.3 Tình hình dịch bệnh tơm Việt Nam II.3 Một số đặc điểm sinh học tôm sú thẻ chân trắng II.3.1 Vị trí phân loại tơm sú P monodon tôm thẻ chân trắng P vannamei II.3.2 Đặc điểm phân bố tôm sú thẻ chân trắng vi II.3.2.1 Đặc điểm phân bố tôm sú II.3.2.2 Đặc điểm phân bố tôm thẻ chân trắng II.3.3 Vòng đời phát triển tôm sú thẻ chân trắng II.3.3.1 Vòng đời phát triển tôm sú II.3.3.2 Vòng đời phát triển tôm thẻ chân trắng II.3.4 Dinh dƣỡng II.3.4.1 Dinh dƣỡng tôm sú II.3.4.2 Dinh dƣỡng tôm thẻ chân trắng II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú thẻ chân trắng phát triển II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) bệnh Taura (Taura syndrome TS) II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý 11 II.4.1.3 Lịch sử phân bố lan truyền bệnh 11 II.4.1.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 12 II.4.1.5 Phòng bệnh 12 II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 12 II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh 12 II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 13 II.4.2.3 Phân bố lan truyền bệnh 14 II.4.2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 14 II.4.2.5 Phòng trị bệnh 14 II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION 14 II.5.1 Sơ lƣợc phƣơng pháp In situ hybridization 14 II.5.2 Khái niệm lai phân tử 15 II.5.3 Cơ sở lai phân tử 16 II.5.3.1 Khái niệm nhiệt độ nóng chảy DNA 16 II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhiệt độ nóng chảy DNA 16 II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến lai phân tử 17 vii II.5.5 Probe 17 II.5.5.1 Khái niệm 17 II.5.5.2 Các loại probe 18 II.5.5.3 Các phƣơng pháp đánh dấu probe 18 II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe cách phát phân tử lai 19 II.5.6 Các phƣơng pháp lai chỗ ISH 23 II.5.6.1 Lai khuẩn lạc 23 II.5.6.2 Lai nhiễm sắc thể 23 II.5.6.3 Lai tế bào mô 24 II.5.7 Ứng dụng chủ yếu ISH 25 II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc bệnh đốm trắng, bệnh Taura ứng dụng phƣơng pháp ISH chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản 25 II.5.8.1 Một số nghiên cứu trƣớc bệnh đốm trắng Taura 25 II.5.8.2 Ứng dụng phƣơng pháp ISH chẩn đoán mầm bệnh động vật nuôi thủy sản 26 II.5.9 Xu hƣớng phát triển phƣơng pháp 26 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 27 III.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 27 III.2 Vật liệu sinh học 27 III.3 Hóa chất thí nghiệm 27 III.3.1 Hóa chất có sẵn kit chẩn đốn DiagXotics Mỹ 27 III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng khơng có kit chẩn đoán 28 III.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 28 III.4.1 Thiết bị thí nghiệm 28 III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm 29 III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình kit 29 III.5.1 Chuẩn bị hóa chất 29 III.5.2 Chuẩn bị mẫu 30 III.5.2.1 Cố định mẫu 30 viii III.5.2.2 Cách xử lý mẫu 30 III.5.2.3 Đúc mẫu paraffin 31 III.5.2.4 Cắt mẫu 31 III.5.3 Quy trình chẩn đốn theo kit 31 III.5.3.1 Ngày thứ 31 III.5.3.2 Ngày thứ hai 32 III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu 34 III.6.2 Bố trí thí nghiệm 34 III.6.2.1 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei 35 III.6.2.2 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV tôm sú Penaeus monodon 36 III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mô học PCR 39 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 IV.1 Kết tôm thẻ chân trắng P vannamei 41 IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả phát TSV phƣơng pháp ISH 41 IV.1.2 Kết thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH P vannamei 43 IV.1.2.1 Kết thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu lai 43 IV.1.2.2 Kết thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K 46 IV.1.2.3 Kết thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp 49 IV.2 Kết tôm sú P monodon 52 IV.2.1 Kết thí nghiệm theo quy trình kit để ổn định phƣơng pháp 52 IV.2.2 Kết ứng dụng kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng phịng thí nghiệm 54 IV.2.2.1 Kết thí nghiệm theo quy trình kit nhƣng có thay đổi số hóa chất thơng dụng khơng có kit 54 IV.2.2.2 Trƣờng hợp xử lý mẫu nhanh 56 IV.2.2.3 Trƣờng hợp biến tính mẫu probe trƣớc lai 59 ix IV.2.2.4 Trƣờng hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu probe trƣớc lai 61 IV.3 Kết thí nghiệm so sánh ISH với mô học PCR 65 IV.3.1 Kết Penaeus vannamei 65 IV.3.1.1 Kết tôm postlarvae 65 IV.3.1.2 Kết tôm thƣơng phẩm 66 IV.3.2 Kết Penaeus monodon 68 IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae 69 IV.3.2.2 Đối với tôm thƣơng phẩm 70 IV.5 Nhận xét chung 73 IV.6 Những thuận lợi khó khăn 74 IV.6.1 Thuận lợi 74 IV.6.2 Khó khăn 74 IV.7 Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp In situ hybridization 75 IV.7.1 Ƣu điểm 75 IV.7.2 Nhƣợc điểm 75 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76 V.1 Kết luận 76 V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei 76 V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon 76 V.2 Đề nghị 77 CHƢƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 x ... 76 V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh TSV P vannamei 76 V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon ... HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐỐN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TƠM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV... hành thực đề tài: ? ?Ứng dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh WSSV (White Spot Syndrome Virus) tôm sú Penaeus monodon TSV (Taura Syndrome Virus) tôm thẻ chân trắng