0

Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 2 ppsx

34 472 0

Đang tải.... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Tài liệu liên quan

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 28/07/2014, 02:21

20 Các chất đồng vị phóng xạ thƣờng dùng để đánh dấu mẫu dò là 32 P, 35 S và 3 H. Trong đó 32 P đƣợc sử dụng nhiều nhất và nó phát tia ß có năng lƣợng rất cao nên tín hiệu nhận đƣợc rõ. Nhƣng bên cạnh đó thì 32 P có hai nhƣợc điểm lớn là: - Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh. Mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng 32 P không sử dụng đƣợc nhiều lần trong một thời gian dài dẫn đến chi phí cao. - Do năng lƣợng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận đƣợc không tinh mà khuếch tán trên một vùng rộng. 35 S phát tia có năng lƣợng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – 3 tháng) nên giúp giải quyết đƣợc nhƣợc điểm trên của 32 P nhƣng năng lƣợng do 35 S phát ra thấp nên ít đƣợc sử dụng để đánh dấu mẫu dò. Đối với một số phƣơng pháp đặc biệt nhƣ lai tại chỗ cần độ phân giải cao thì ngƣời ta sử dụng 3 H để đánh dấu mẫu dò, mặc dù năng lƣợng do tia phát ra rất yếu nhƣng bù lại tín hiệu phát ra rất tinh. Nhìn chung, ƣu điểm của các đồng vị phóng xạ là có độ nhạy cao, cho tín hiệu mạnh với thời gian phát sáng ngắn. Nhƣng chúng có nhƣợc điểm là có hại cho sức khỏe của con ngƣời. Đặc biệt là 32 P phát tia có độ xuyên sâu nên đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn tốn kém trong thao tác và xử lý chất thải. Ngoài ra, các mẫu dò cũng không thể dùng đƣợc trong một thời gian dài do chu kỳ bán rã của các đồng vị phóng xạ. Các probe đƣợc đánh dấu theo phƣơng pháp này thì các phân tử lai đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography). B. Probe đƣợc đánh dấu bằng các chất hóa học khác Việc sử dụng các chất hóa học khác để đánh dấu mẫu dò giúp khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của việc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, ở đây lại vấp phải vấn đề về độ nhạy thấp hơn các phƣơng pháp trƣớc. Hiện nay, chúng ta có các hệ thống đánh dấu hóa học thông dụng nhất là: Hệ thống sử dụng avidin (hay streptavidin) – biotin: đây là một cặp ligand có hằng số ái lực cao nhất tìm thấy trong sinh học. Đầu tiên, mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng biotin theo hai cách: biotin đƣợc gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA đƣợc tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotin. Sau quá trình lai, biotin hiện diện trong 21 Hình 2.5: Cơ chế phát hiện probe đánh dấu huỳnh quang Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin. Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát hiện biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification). phân tử lai đƣợc phát hiện khi cho ligand của nó là avidin (hay streptavidin) vào phản ứng. Avidin (hay streptavidin) trƣớc đó có gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay một enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu. Kết quả là những tín hiệu phát sáng hay tín hiệu màu nhận đƣợc trên màng lai. Hệ thống huỳnh quang: các probe đƣợc đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang sẽ phát sáng khi quan sát dƣới tia UV (ultra violet). Cách đánh dấu này rất hữu ích khi kiểm tra các mẫu vi khuẩn hoặc mẫu tế bào trực tiếp dƣới kính hiển vi. Thuận lợi của hệ thống đánh dấu này là cùng một lúc ta có thể lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với các chất phát huỳnh quang khác nhau và các phân tử lai đƣợc phát hiện cùng một lúc. Hệ thống dùng kháng thể: ngƣời ta dùng một nhóm kháng nguyên gắn vào probe và phát hiện sự hiện diện của probe này bằng các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể này phải đƣợc đánh dấu bằng các tác nhân đánh dấu nhƣ trên để nhận biết. Hệ thống này đƣợc dùng rộng rãi hiện nay nhất là hệ thống đánh dấu bằng Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG 22 Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe đƣợc đánh dấu với DIG. Hình a: dùng một kháng thể; hình b dùng hai kháng thể trong đó Anti – DIG là kháng nguyên của kháng thể thứ cấp. – AntiDIG/AP). Nếu probe đƣợc đánh dấu bằng DIG – AntiDIG/AP thì các phân tử lai đƣợc phát hiện bằng phản ứng tạo màu sau phản ứng. Ngƣời ta dùng cơ chất NTB/BCIP (Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn trên AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa màu xanh khi nhìn dƣới kính hiển vi quang học. Trong một số quy trình, AntiDIG không đƣợc gắn với enzyme nên muốn phát hiện tín hiệu sau khi lai ta phải nhờ vào cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG. Hệ thống sử dụng Enzyme: Trƣớc hết mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA và các enzyme này hình thành một phức hợp bền vững). Sau quá trình lai, ngƣời ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của hai enzyme và cơ chất đó có khả năng phát sáng khi bị biến đổi. Ánh sáng phát ra sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim. Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: ngƣời ta dùng các chất hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu. 23 Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân hàng gen (tức tập hợp các dòng vi khuẩn tái tổ hợp) đƣợc trải trên mặt thạch của đĩa petri. Sau khi các khuẩn lạc đạt kích thƣớc xác định, ngƣời ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt các khuẩn lạc. Trƣớc khi thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và màng lai đều phải đƣợc đánh dấu trƣớc để làm căn cứ đọc kết quả sau này. Khi áp màng lai lên mặt các khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai. Màng lai sau đó đƣợc xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA. Việc cố định DNA trên màng lai và thao tác lai diễn tiến theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp lai trên pha rắn nhƣ Southern Blot và Northern Blot. Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên đĩa petri ban đầu. Dòng vi khuẩn này sau đó đƣợc thu nhận và thực hiện các phân tích khác. II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể Phƣơng pháp lai này cung cấp những thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò (probe) chuyên biệt. 24 Các nhiễm sắc thể thƣờng có nguồn gốc từ các bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ đƣợc xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame. Sau công đoạn loại bỏ RNA bằng RNase và loại bỏ protein bằng Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định trên lame đƣợc đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ. Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện phân tử lai, ngƣời ta phủ lên lame một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ. Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame đƣợc đem quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai. II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô Trong tế bào và mô, các DNA và RNA đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định. Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng nhƣ tƣơng tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô. Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể. Trong trƣờng hợp đó ngƣời ta thƣờng hay sử dụng phƣơng pháp lai trên tế bào và mô. Mô đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp mô học (cố định, khử nƣớc, tẩm paraffin, cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai. Thao tác xử lý mẫu lai và phát hiện phân tử lai tƣơng tự nhƣ lai trên nhiễm sắc thể. Kết quả đƣợc đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học. Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau: Đối tƣợng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau nhƣ não bộ. Ở đây ngƣời ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó. Các phƣơng pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trƣng của nó. Khi phối hợp phƣơng pháp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, ngƣời ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó. Từ đó xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen. 25 Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần nhƣ đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, ngƣời ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tƣơng tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống. Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn. Điều này đã tạo những bƣớc nhảy vọt lớn cho các phƣơng pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau. II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH Phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phƣơng pháp tạo dòng. Định vị một gen xác định trên nhiễm sắc thể. Nghiên cứu sản phẩm phiên mã và dịch mã của một gen xác định trong mô hay tế bào, từ đó giúp ngƣời ta chẩn đoán đƣợc các bệnh nguy hiểm trên ngƣời nhƣ bệnh ung thƣ, bệnh viêm gan…Đây là một hƣớng ứng dụng rộng rãi nhất của phƣơng pháp ISH. II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura Mở đầu là công trình nghiên cứu về loại mô đích của virus gây bệnh đốm trắng do Lo và ctv thực hiện. Họ đã gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV (White spot baculovirus) trên tôm sú và đạt tỷ lệ nhiễm 100%. Sau 40 giờ nhiễm, họ phát hiện virus gây bệnh bằng phƣơng pháp In Situ hybridization và xác định đƣợc mang và gan tụy là cơ quan đích của virus này. Các kết luận sau đó cho rằng mô đích của virus đốm trắng chính là các mô có nguốn gốc trung bì (Lo và ctv, 1996). Một nghiên cứu khác của nhóm là sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot và Southern Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng cũng thu đƣợc nhiều kết quả tốt (Lo và ctv, 1996). Arun K. Dhar, Michelle M. Roux và Kurt R. Klimpel (2001) đã sử dụng kỹ thuật Real – Time Quantitative PCR và SYBR Green Chemistry để phát hiện và định lƣợng WSSV nhiễm trên Penaeus sp. Qua kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học 26 đã xác định đƣợc phƣơng pháp SYBR Green PCR phát hiện virus đốm trắng nhanh, nhạy và định lƣợng đƣợc lƣợng virus nhiễm vào tôm chính xác nhất. Các nghiên cứu về bệnh Taura và virus TSV thì tƣơng đối ít hơn, Nunan L.M., Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 đã dùng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện virus TSV. Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng primer tạo ra từ một đoạn cDNA trên genome của TSV và khuếch đại đƣợc một gen có kích thƣớc 231 bp. Bằng kỹ thuật này, nhóm nghiên cứu đã phát hiện đƣợc TSV khi gây nhiễm thực nghiệm trên P. vannamei và P. stylirostris. Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M., Lightner D.V. đã thực hiện nghiên cứu các phƣơng pháp khác nhau để chẩn đoán và phát hiện TSV trên tôm thẻ nói chung. Qua thí nghiệm này nhóm đã đƣa ra các phƣơng pháp hiện nay có thể áp dụng để chẩn đoán TSV nhƣ RT – PCR, Western blot, Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 2002). II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản Trong thủy sản mà đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm, ngoài các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng trƣớc đây thì ISH đã phát huy đƣợc thế mạnh của một phƣơng pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao. Một loạt các thí nghiệm đã đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp ISH nhƣ phân biệt các dòng Baculovirus BP – type khác nhau (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát hiện Piscirickettsia salmonis trên họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J. và Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với loài chình nuôi và đã xác định đƣợc 27 dòng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar R., 1999); phát hiện Macrobrachium rosenbergii nodavirus trên tôm càng xanh (Sri Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R. và ctv, 2003); phát hiện virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm he, cua và tôm hùm (Poh-Shing Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)… II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này Hiện nay, phƣơng pháp ISH đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và đã đƣợc phát triển thêm một bƣớc mới, ngƣời ta có thể đồng thời phát hiện nhiều trình tự đích khác nhau trên cùng một mẫu mô hoặc tế bào bằng cách lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với nhiều tác nhân khác nhau. Các tín hiệu sau khi lai sẽ đƣợc phát hiện dựa vào các phản 27 ứng tạo màu khác nhau. Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp dùng nhiều probe này là các trình tự đích này nằm trùng với nhau trên mẫu mô nên rất khó khăn khi phân biệt, làm sao để phân biệt các tín hiệu tạo ra do nhiều probe cùng liên kết với cùng một vị trí trên mô. Để khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này, ngƣời ta gắn các chất nhuộm huỳnh quang vào các probe, các chất nhuộm huỳnh quang này phát ra tín hiệu ở các bƣớc sóng khác nhau, dựa vào đó ngƣời ta phát hiện các probe sau khi lai (Paddock, 2001). CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm  Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005.  Địa điểm thực hiện thí nghiệm tại phòng Mô học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ (TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB) trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh. III.2 Vật liệu sinh học 1. Đối tƣợng thí nghiệm là P. monodon và P. vannamei ở các dạng sau: Tôm thƣơng phẩm Tôm giống Postlarvae 2. Các mẫu tôm sú P. monodon đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định dƣơng tính với WSSV. 3. Các mẫu tôm TCT P. vannamei đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định dƣơng tính với TSV. 4. Các mẫu tôm sú và TCT ở dạng postlarve hay thƣơng phẩm có các dấu hiệu bệnh lý đƣợc lấy từ các trại giống và các ao nuôi thƣơng phẩm ở các tỉnh ĐBSCL và Phú Yên. Các mẫu này đƣợc thực hiện chẩn đoán đồng thời ba phƣơng pháp mô học, PCR và ISH. III.3 Hóa chất thí nghiệm III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ 28 Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer) Proteinase K (dạng bột) Đệm PBS 1 lần (1X PBS Buffer) Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer) Dung dịch lai (Hybridization Solution) Đệm SSC đậm đặc 30 lần (30X SSC Buffer) Dung dịch đệm ngăn ngừa phản ứng dƣơng tính giả đậm đặc 10 lần (10X Blocking Buffer) Dung dịch kháng Digoxigenin (Anti – Digoxigenin/AP Conjugate Solution) Đệm TBS đậm đặc 10 lần (10X TBS Buffer) Dung dịch phát triển màu (Development Solution) Đệm dừng phản ứng (Stop Buffer) Mẫu đối chứng dƣơng Mẫu đối chứng âm Trong đó, thành phần của dung dịch lai gồm: Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin) SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer Formamide 50% Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP) Dextran Sulfate 5% DNA cá hồi 0,5 mg/l Thành phần bộ kit chẩn đoán WSSV và TSV hầu nhƣ giống nhau chỉ khác nhau ở thành phần của dung dịch lai. Đối với bộ kit chẩn đoán WSSV, dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh đốm trắng và bộ kit chẩn đoán TSV thì dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh Taura. III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán 29 Cồn tuyệt đối, xylene hoặc chất thay thế xylene, nƣớc cất hai lần, chloroform, paraffin, formalin, formaldehyde 37%, acid acetic nguyên chất, paraformaldehyde dạng bột, Bismark Brown Y dạng bột, keo dán (Boume du Canada). Các loại hóa chất này mua từ công ty Prolabo và Merck, có độ tinh khiết cao. III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm III.4.1 Thiết bị thí nghiệm Máy xử lý mẫu tự động, bình rót paraffin, Electrothermal, bàn lạnh, máy cắt mẫu Microtome, bể nƣớc ấm có chỉnh nhiệt độ, bàn ấm cố định mẫu trên lame kính, tủ ấm có chỉnh nhiệt độ, buồng ẩm chuyên dụng cho lai tại chỗ Slide Moat, tủ lạnh âm 20 0 C và tủ mát 4 0 C – 7 0 C, kính hiển vi quang học. III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm Cassette chứa mẫu có nắp đậy, khung inox dùng để đúc mẫu, lame và lamelle, ống eppendorf, bếp điện và nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu, micropipette loại có thể tích 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl và 1000 µl, các loại pipette có thể tích 1ml, 5 ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame dƣơng và các dụng cụ cần thiết khác. III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit III.5.1 Chuẩn bị hóa chất Pha loãng các hóa chất có trong bộ kit về nồng độ làm việc nhƣ PBS 1X, PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50%. Tất cả các dung dịch trên đƣợc pha loãng trong nƣớc cất hai lần. Chuẩn bị Proteinase K bằng cách dùng pipette hút 1 ml đệm PBS 1X có sẵn trong bộ kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất rồi hút 1 ml của lọ Proteinase K cho vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất này hòa đều vào nhau. Sau cùng ta phân dung dịch vừa thu đƣợc vào các eppendorf và trữ ở -20 0 C, 1 ml cho mỗi eppendorf. Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% bằng cách thêm 0,2 gram bột paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy đều dung dịch ở 37 0 C cho đến khi nào paraformaldehyde hòa tan hoàn toàn. Sau đó trữ dung dịch ở 2 – 7 0 C và dùng trong 2 tuần. [...]... Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P vannamei IV.1.1 Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phƣơng pháp ISH 42 Hiện nay, ISH là một phƣơng pháp khá mới đƣợc ứng dụng trong chẩn đoán mầm bệnh trên tôm nuôi và phƣơng pháp này chƣa ứng dụng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên tôm TCT một cách phổ biến, nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm bƣớc đầu ứng dụng phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh do TSV và ổn... đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 tôm postlarvae và 5 tôm thƣơng phẩm) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm) Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại 2 lần trên các nghiệm thức sau: 100 l, 75 l, 50 l III.6 .2. 2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon A Bố trí thí nghiệm theo quy trình bộ kit ổn định phƣơng pháp Chúng tôi thực hiện chẩn đoán theo... ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện Thí nghiệm để so sánh độ ổn định, độ chính xác và hiệu quả giữa phƣơng pháp ISH vừa tìm đƣợc với mô học và PCR Các bố trí cụ thể nhƣ sau: III.6 .2. 1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei A Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phƣơng pháp Để thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT của phƣơng pháp ISH,... với tôm sú và cố định trong dung dịch R-F đối với TCT và dùng để kiểm tra mô học và ISH Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: Đối với bệnh Taura trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei Bảng 3. 2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P vannamei Phƣơng Cách cố Số Penaeus Số lần pháp định mẫu mẫu vannamei lặp lại Kết quả So sánh kết quả 41 chẩn Post Thƣơng đoán Larvae phẩm Lần 1 Mô học R-F 30 15 15 2. .. 30 15 15 2 PCR Cồn 95% 30 15 15 Lần 2 2 Đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon Bảng 3. 3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P monodon Phƣơng Penaeus pháp Cách cố Số monodon chẩn định mẫu mẫu đoán Post Kết quả Số lần So sánh Thƣơng lặp lại kết quả Larvae phẩm Mô học Davidson 30 15 15 Davidson 30 15 15 2 PCR Cồn 95% 30 15 15 Lần 2 2 ISH Lần 1 2 CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN IV.1... Cồn 95% (3) 30 phút Paraffin (1) Paraffin (2) 3 giờ 3 giờ Sơ đồ 3. 1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán Tổng thời gian xử lý mẫu: 12, 5 giờ Paraffin đƣợc dùng trong quy trình xử lý mẫu này là hỗn hợp với sáp ong theo tỷ lệ 5 paraffin : 1 sáp ong III.5 .2. 3 Đúc mẫu trong paraffin Đặt mẫu đã xử lý vào khuôn inox, dùng bình rót paraffin (5 paraffin : 1 sáp ong) vào khuôn chứa mẫu, cố định... tính mẫu Trên đối chứng âm, mẫu rất rõ và không bị nhiễm bẩn chứng tỏ quá trình lai đƣợc thực hiện rất tốt và không bị ngoại nhiễm Qua kết quả mà chúng tôi nhận đƣợc nhƣ trên và những lý do đã đƣợc đƣa ra nhƣ vậy, chúng tôi tiến hành một loạt các thí nghiệm khác để ổn định phƣơng pháp lai áp dụng trong chẩn đoán mầm bệnh TSV IV.1 .2 Kết quả thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH trên P vannamei IV.1 .2. 1 Kết... 4. 4: Hiện tƣợng dƣơng tính giả trên phụ bộ tôm lớn, X10 53 IV .2 Kết quả trên tôm sú P monodon IV .2. 1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp Quy trình lai tại chỗ ISH đã đƣợc thử nghiệm để kiểm tra virus WSSV trên tôm sú tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Ở đây, chúng tôi tiến hành thử nghiệm lại quy trình để xem xét tính ổn định và độ chính xác của phƣơng pháp trong chẩn. .. Mẫu âm tính: không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam sau quá trình lai Hình 4. 1: Đối chứng dƣơng trên Hình 4. 2: Đối chứng âm trên mang tôm phụ bộ tôm lớn, X10 lớn, X10 43 Chú thích: “+ : mức độ nhiễm bệnh tƣơng đối thấp (số tế bào bị nhiễm bệnh dƣới 30% số tế bào quan sát trong mẫu) “++ : mức độ nhiễm bệnh trung bình (số tế bào bị nhiễm bệnh lớn... năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, chúng tôi thực hiện một số thí nghiệm tiếp theo để tìm ra quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên TCT trong phòng thí nghiệm, các thí nghiệm đó l : (a) Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu thích hợp Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này trên 10 mẫu tôm TCT đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5 mẫu postlarvae) và hai . áp dụng để chẩn đoán TSV nhƣ RT – PCR, Western blot, Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 20 02) . II.5.8 .2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên. độ chính xác và hiệu quả giữa phƣơng pháp ISH vừa tìm đƣợc với mô học và PCR. Các bố trí cụ thể nhƣ sau: III.6 .2. 1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus. phẩm) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại 2 lần trên các nghiệm thức sau: 100 l, 75 l, 50 l. III.6 .2. 2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng
- Xem thêm -

Xem thêm: Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 2 ppsx, Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 2 ppsx,

Từ khóa liên quan