Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 2 ppsx

20 Các chất đồng vị phóng xạ thƣờng dùng để đánh dấu mẫu dò 32P, 35S 3H Trong 32P đƣợc sử dụng nhiều phát tia ß có lƣợng cao nên tín hiệu nhận đƣợc rõ Nhƣng bên cạnh 32P có hai nhƣợc điểm lớn là: - Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh Mẫu dò đƣợc đánh dấu 32P không sử dụng đƣợc nhiều lần thời gian dài dẫn đến chi phí cao - Do lƣợng cao tia xạ nên tín hiệu nhận đƣợc khơng tinh mà khuếch tán vùng rộng 35 S phát tia có lƣợng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – tháng) nên giúp giải đƣợc nhƣợc điểm 32P nhƣng lƣợng 35S phát thấp nên đƣợc sử dụng để đánh dấu mẫu dò Đối với số phƣơng pháp đặc biệt nhƣ lai chỗ cần độ phân giải cao ngƣời ta sử dụng 3H để đánh dấu mẫu dò, lƣợng tia phát yếu nhƣng bù lại tín hiệu phát tinh Nhìn chung, ƣu điểm đồng vị phóng xạ có độ nhạy cao, cho tín hiệu mạnh với thời gian phát sáng ngắn Nhƣng chúng có nhƣợc điểm có hại cho sức khỏe ngƣời Đặc biệt 32 P phát tia có độ xun sâu nên địi hỏi nhiều biện pháp an toàn tốn thao tác xử lý chất thải Ngoài ra, mẫu dị khơng thể dùng đƣợc thời gian dài chu kỳ bán rã đồng vị phóng xạ Các probe đƣợc đánh dấu theo phƣơng pháp phân tử lai đƣợc phát kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) B Probe đƣợc đánh dấu chất hóa học khác Việc sử dụng chất hóa học khác để đánh dấu mẫu dò giúp khắc phục đƣợc nhƣợc điểm việc đánh dấu đồng vị phóng xạ Tuy nhiên, lại vấp phải vấn đề độ nhạy thấp phƣơng pháp trƣớc Hiện nay, có hệ thống đánh dấu hóa học thơng dụng là: Hệ thống sử dụng avidin (hay streptavidin) – biotin: cặp ligand có số lực cao tìm thấy sinh học Đầu tiên, mẫu dò đƣợc đánh dấu biotin theo hai cách: biotin đƣợc gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học DNA đƣợc tổng hợp từ nucleotide có gắn biotin Sau trình lai, biotin diện 21 phân tử lai đƣợc phát cho ligand avidin (hay streptavidin) vào phản ứng Avidin (hay streptavidin) trƣớc có gắn với nhóm phát huỳnh quang hay enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu Kết tín hiệu phát sáng hay tín hiệu màu nhận đƣợc màng lai Hình 2.4: Cơ chế phát phân tử lai có probe đánh dấu biotin Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification) Hệ thống huỳnh quang: probe đƣợc đánh dấu chất phát huỳnh quang phát sáng quan sát dƣới tia UV (ultra violet) Cách đánh dấu hữu ích kiểm tra mẫu vi khuẩn mẫu tế bào trực tiếp dƣới kính hiển vi Thuận lợi hệ thống đánh dấu lúc ta lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với chất phát huỳnh quang khác phân tử lai đƣợc phát lúc Hệ thống dùng kháng thể: ngƣời ta dùng nhóm Hình 2.5: Cơ chế phát probe kháng nguyên gắn vào probe phát diện probe đánh dấu huỳnh quang kháng thể đặc hiệu Các kháng thể phải đƣợc đánh dấu tác nhân đánh dấu nhƣ để nhận biết Hệ thống đƣợc dùng rộng rãi hệ thống đánh dấu Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG 22 – AntiDIG/AP) Nếu probe đƣợc đánh dấu DIG – AntiDIG/AP phân tử lai đƣợc phát phản ứng tạo màu sau phản ứng Ngƣời ta dùng chất NTB/BCIP (Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa màu xanh nhìn dƣới kính hiển vi quang học Trong số quy trình, AntiDIG khơng đƣợc gắn với enzyme nên muốn phát tín hiệu sau lai ta phải nhờ vào cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG Hình 2.6: Cơ chế phát phân tử lai có probe đƣợc đánh dấu với DIG Hình a: dùng kháng thể; hình b dùng hai kháng thể Anti – DIG kháng nguyên kháng thể thứ cấp Hệ thống sử dụng Enzyme: Trƣớc hết mẫu dò đƣợc đánh dấu alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA enzyme hình thành phức hợp bền vững) Sau trình lai, ngƣời ta cho màng lai tiếp xúc với chất hai enzyme chất có khả phát sáng bị biến đổi Ánh sáng phát in dấu ấn lên phim kết thu nhận chấm phim Hệ thống dùng chất phát quang phản ứng hóa học: ngƣời ta dùng chất hóa học có khả phát sáng để đánh dấu vào probe phát chúng cách đo ánh sáng phát máy đo đặc hiệu 23 II.5.6 Các phƣơng pháp lai chỗ ISH II.5.6.1 Lai khuẩn lạc Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phát dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm ngân hàng gen Ngân hàng gen (tức tập hợp dòng vi khuẩn tái tổ hợp) đƣợc trải mặt thạch đĩa petri Sau khuẩn lạc đạt kích thƣớc xác định, ngƣời ta thu lấy dấu ấn chúng cách áp màng lai lên mặt khuẩn lạc Trƣớc thực thao tác này, đĩa thạch màng lai phải đƣợc đánh dấu trƣớc để làm đọc kết sau Khi áp màng lai lên mặt khuẩn lạc, khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khuẩn màng Hình 2.7: lai khuẩn xử lai Màng Laisau đƣợclạc lý NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn làm biến tính DNA Việc cố định DNA màng lai thao tác lai diễn tiến theo bƣớc tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp lai pha rắn nhƣ Southern Blot Northern Blot Kết phóng xạ tự ghi dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm đĩa petri ban đầu Dịng vi khuẩn sau đƣợc thu nhận thực phân tích khác II.5.6.2 Lai nhiễm sắc thể Phƣơng pháp lai cung cấp thơng tin xác vị trí phân bố trình tự DNA cần tìm nhiễm sắc thể nhờ mẫu dị (probe) chun biệt Hình 2.8: Lai nhiễm sắc thể ponticum nấm Thinopyrum 24 Các nhiễm sắc thể thƣờng có nguồn gốc từ bạch cầu giai đoạn trung kỳ đƣợc xử lý kỹ thuật tế bào học lame Sau công đoạn loại bỏ RNA RNase loại bỏ protein Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định lame đƣợc đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát phân tử lai, ngƣời ta phủ lên lame huyền dịch nhạy cảm với tia xạ Sau thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame đƣợc đem quan sát dƣới kính hiển vi Kết thể thành hạt nằm lớp huyền dịch vị trí có phân tử lai II.5.6.3 Lai tế bào mô Trong tế bào mô, DNA RNA đặc biệt mRNA có phân bố khơng gian xác định Sự phân bố không gian liên quan đến chức năng, điều hòa biểu nhƣ tƣơng tác mRNA với thành phần khác tế bào mô Nghiên cứu DNA RNA tách chiết tinh không cho phép thu nhận thông tin vừa kể Trong trƣờng hợp ngƣời ta thƣờng hay sử dụng phƣơng pháp lai tế bào mô Mô đƣợc xử lý phƣơng pháp mô học (cố định, khử nƣớc, tẩm paraffin, cắt thành lát mỏng, đính lame) dùng để thực lai Thao tác xử lý mẫu lai phát phân tử lai tƣơng tự nhƣ lai nhiễm sắc thể Kết đƣợc đọc trực tiếp lame nhờ kính hiển vi quang học Phương pháp sử dụng trường hợp sau: Đối tƣợng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhƣ não Ở ngƣời ta định xác vị trí phân bố DNA hay mRNA nhóm tế bào chuyên biệt tổ chức Các thơng tin góp phần vào việc xác định vai trị mRNA tổ chức Các phƣơng pháp miễn dịch tế bào cho phép phát protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trƣng Khi phối hợp phƣơng pháp miễn dịch tế bào lai chỗ, ngƣời ta phát đồng thời mRNA protein Từ xác định đƣợc mối tƣơng quan hoạt động phiên mã dịch mã gen 25 Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần nhƣ đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, ngƣời ta xác định vị trí, phân bố tƣơng tác mRNA tham gia vào trình sống Hiện kỹ thuật đánh dấu mẫu dị hóa chất có nhiều tiến lớn Điều tạo bƣớc nhảy vọt lớn cho phƣơng pháp lai chỗ, đặc biệt cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác mẫu dò đƣợc đánh dấu hóa chất cho nhiều màu khác II.5.7 Ứng dụng chủ yếu ISH Phát dòng vi khuẩn tái tổ hợp phƣơng pháp tạo dòng Định vị gen xác định nhiễm sắc thể Nghiên cứu sản phẩm phiên mã dịch mã gen xác định mô hay tế bào, từ giúp ngƣời ta chẩn đốn đƣợc bệnh nguy hiểm ngƣời nhƣ bệnh ung thƣ, bệnh viêm gan…Đây hƣớng ứng dụng rộng rãi phƣơng pháp ISH II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc bệnh đốm trắng, bệnh Taura ứng dụng phƣơng pháp ISH chẩn đốn mầm bệnh vật ni thủy sản II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước bệnh đốm trắng Taura Mở đầu cơng trình nghiên cứu loại mơ đích virus gây bệnh đốm trắng Lo ctv thực Họ gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV (White spot baculovirus) tôm sú đạt tỷ lệ nhiễm 100% Sau 40 nhiễm, họ phát virus gây bệnh phƣơng pháp In Situ hybridization xác định đƣợc mang gan tụy quan đích virus Các kết luận sau cho mơ đích virus đốm trắng mơ có nguốn gốc trung bì (Lo ctv, 1996) Một nghiên cứu khác nhóm sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot Southern Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng thu đƣợc nhiều kết tốt (Lo ctv, 1996) Arun K Dhar, Michelle M Roux Kurt R Klimpel (2001) sử dụng kỹ thuật Real – Time Quantitative PCR SYBR Green Chemistry để phát định lƣợng WSSV nhiễm Penaeus sp Qua kết nghiên cứu này, nhà khoa học 26 xác định đƣợc phƣơng pháp SYBR Green PCR phát virus đốm trắng nhanh, nhạy định lƣợng đƣợc lƣợng virus nhiễm vào tơm xác Các nghiên cứu bệnh Taura virus TSV tƣơng đối hơn, Nunan L.M., Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 dùng kỹ thuật RT – PCR để phát virus TSV Trong thí nghiệm này, họ sử dụng primer tạo từ đoạn cDNA genome TSV khuếch đại đƣợc gen có kích thƣớc 231 bp Bằng kỹ thuật này, nhóm nghiên cứu phát đƣợc TSV gây nhiễm thực nghiệm P vannamei P stylirostris Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M., Lightner D.V thực nghiên cứu phƣơng pháp khác để chẩn đoán phát TSV tơm thẻ nói chung Qua thí nghiệm nhóm đƣa phƣơng pháp áp dụng để chẩn đốn TSV nhƣ RT – PCR, Western blot, Immuno – dot blot, Immunohistochemistry In Situ hybridization (11 – 2002) II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH chẩn đoán mầm bệnh động vật nuôi thủy sản Trong thủy sản mà đặc biệt chẩn đoán mầm bệnh nguy hiểm tơm, ngồi biện pháp truyền thống đƣợc áp dụng trƣớc ISH phát huy đƣợc mạnh phƣơng pháp chẩn đoán mới, hiệu cao Một loạt thí nghiệm đƣợc thực dựa phƣơng pháp ISH nhƣ phân biệt dòng Baculovirus BP – type khác (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát Piscirickettsia salmonis họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với lồi chình ni xác định đƣợc 27 dịng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar R., 1999); phát Macrobrachium rosenbergii nodavirus tôm xanh (Sri Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R ctv, 2003); phát virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm tôm he, cua tôm hùm (Poh-Shing Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)… II.5.9 Xu hƣớng phát triển phƣơng pháp Hiện nay, phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rộng rãi đƣợc phát triển thêm bƣớc mới, ngƣời ta đồng thời phát nhiều trình tự đích khác mẫu mô tế bào cách lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với nhiều tác nhân khác Các tín hiệu sau lai đƣợc phát dựa vào phản 27 ứng tạo màu khác Nhƣợc điểm phƣơng pháp dùng nhiều probe trình tự đích nằm trùng với mẫu mô nên khó khăn phân biệt, để phân biệt tín hiệu tạo nhiều probe liên kết với vị trí mơ Để khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này, ngƣời ta gắn chất nhuộm huỳnh quang vào probe, chất nhuộm huỳnh quang phát tín hiệu bƣớc sóng khác nhau, dựa vào ngƣời ta phát probe sau lai (Paddock, 2001) CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM III.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm  Thời gian thực thí nghiệm từ – – 2005 đến 30 – – 2005  Địa điểm thực thí nghiệm phịng Mơ học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trƣờng Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ (TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB) trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh III.2 Vật liệu sinh học Đối tƣợng thí nghiệm P monodon P vannamei dạng sau: Tôm thƣơng phẩm Tôm giống Postlarvae Các mẫu tôm sú P monodon đƣợc phƣơng pháp mơ học PCR xác định dƣơng tính với WSSV Các mẫu tôm TCT P vannamei đƣợc phƣơng pháp mơ học PCR xác định dƣơng tính với TSV Các mẫu tôm sú TCT dạng postlarve hay thƣơng phẩm có dấu hiệu bệnh lý đƣợc lấy từ trại giống ao nuôi thƣơng phẩm tỉnh ĐBSCL Phú Yên Các mẫu đƣợc thực chẩn đoán đồng thời ba phƣơng pháp mơ học, PCR ISH III.3 Hóa chất thí nghiệm III.3.1 Hóa chất có sẵn kit chẩn đoán DiagXotics Mỹ 28 Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer) Proteinase K (dạng bột) Đệm PBS lần (1X PBS Buffer) Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer) Dung dịch lai (Hybridization Solution) Đệm SSC đậm đặc 30 lần (30X SSC Buffer) Dung dịch đệm ngăn ngừa phản ứng dƣơng tính giả đậm đặc 10 lần (10X Blocking Buffer) Dung dịch kháng Digoxigenin (Anti – Digoxigenin/AP Conjugate Solution) Đệm TBS đậm đặc 10 lần (10X TBS Buffer) Dung dịch phát triển màu (Development Solution) Đệm dừng phản ứng (Stop Buffer) Mẫu đối chứng dƣơng Mẫu đối chứng âm Trong đó, thành phần dung dịch lai gồm: Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin) SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer Formamide 50% Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP) Dextran Sulfate 5% DNA cá hồi 0,5 mg/l Thành phần kit chẩn đoán WSSV TSV hầu nhƣ giống khác thành phần dung dịch lai Đối với kit chẩn đoán WSSV, dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh đốm trắng kit chẩn đốn TSV dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh Taura III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng khơng có kit chẩn đốn 29 Cồn tuyệt đối, xylene chất thay xylene, nƣớc cất hai lần, chloroform, paraffin, formalin, formaldehyde 37%, acid acetic nguyên chất, paraformaldehyde dạng bột, Bismark Brown Y dạng bột, keo dán (Boume du Canada) Các loại hóa chất mua từ cơng ty Prolabo Merck, có độ tinh khiết cao III.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm III.4.1 Thiết bị thí nghiệm Máy xử lý mẫu tự động, bình rót paraffin, Electrothermal, bàn lạnh, máy cắt mẫu Microtome, bể nƣớc ấm có chỉnh nhiệt độ, bàn ấm cố định mẫu lame kính, tủ ấm có chỉnh nhiệt độ, buồng ẩm chuyên dụng cho lai chỗ Slide Moat, tủ lạnh âm 200C tủ mát 40C – 70C, kính hiển vi quang học III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm Cassette chứa mẫu có nắp đậy, khung inox dùng để đúc mẫu, lame lamelle, ống eppendorf, bếp điện nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu, micropipette loại tích 10 – 100 µl 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl 1000 µl, loại pipette tích 1ml, ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame dƣơng dụng cụ cần thiết khác III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình kit III.5.1 Chuẩn bị hóa chất Pha lỗng hóa chất có kit nồng độ làm việc nhƣ PBS 1X, PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50% Tất dung dịch đƣợc pha loãng nƣớc cất hai lần Chuẩn bị Proteinase K cách dùng pipette hút ml đệm PBS 1X có sẵn kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất hút ml lọ Proteinase K cho vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất hịa vào Sau ta phân dung dịch vừa thu đƣợc vào eppendorf trữ -200C, ml cho eppendorf Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% cách thêm 0,2 gram bột paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy dung dịch 370C paraformaldehyde hòa tan hồn tồn Sau trữ dung dịch – 70C dùng tuần 39 Áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh giảm thời gian Biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu Kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai Trong đó: (a) Quy trình xử lý mẫu: Quy trình xử lý mẫu chuẩn theo kit nhƣ nêu mục III.5.2.2 sơ đồ 3.1 Quy trình xử lý mẫu nhanh thí nghiệm: quy trình đƣợc Bộ môn Mô học TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II áp dụng chẩn đốn mơ học Quy trình đƣợc thực microwave, nhiệt độ thấp khoảng 40 – 500C gồm bƣớc sau: Cồn 70% Cồn 80% Cồn 95% Cồn tuyệt đối phút phút phút (1) phút Xylene (3) Xylene (2) Xylene (1) Cồn tuyệt đối phút phút phút (2) phút Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh Cả quy trình xử lý khoảng 55 phút, sau xử lý xong ta ngâm mẫu paraffin khoảng – giờ, lấy mẫu đúc cắt bình thƣờng (b) Biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai Biến tính mẫu probe theo quy trình kit: theo quy trình kit probe dung dịch lai đƣợc biến tính trƣớc nhiệt độ 950C 10 phút, làm lạnh nhanh giữ 40C cho lên mẫu lai Khi lai, ta cho dung dịch lai có probe 40 đƣợc biến tính lên mẫu thực biến tính mẫu 950C phút, sau ủ qua đêm 420C để probe bắt cặp với trình tự đích mẫu Biến tính mẫu probe đồng thời lame thí nghiệm: thí nghiệm này, chúng tơi bỏ qua bƣớc biến tính probe dung dịch lai trƣớc lai Khi thực lai, chúng tơi cho dung dịch lai có probe chƣa biến tính lên mẫu thực biến tính đồng thời mẫu probe 950C phút, sau ổn định nhiệt độ 420C ủ qua đêm (c) Kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu probe đồng thời lame trƣớc lai Trong thí nghiệm chúng tơi thực kết hợp hai quy trình chẩn đốn WSSV ISH III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh phương pháp ISH với mô học PCR Trong phần bố trí này, mẫu có dấu hiệu bệnh sau thu phịng thí nghiệm đƣợc chia thành hai phần, phần cố định cồn 950 để thực chẩn đốn PCR; phần cịn lại cố định dung dịch Davidson tôm sú cố định dung dịch R-F TCT dùng để kiểm tra mơ học ISH Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: Đối với bệnh Taura tơm thẻ chân trắng Penaeus vannamei Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học PCR P vannamei Phƣơng Cách cố Số Penaeus Số lần pháp định mẫu mẫu vannamei lặp lại Kết So sánh kết 41 chẩn Post Thƣơng đoán Larvae phẩm Lần Mô học R-F 30 15 15 ISH R-F 30 15 15 PCR Cồn 95% 30 15 15 Lần 2 Đối với bệnh đốm trắng tôm sú Penaeus monodon Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học PCR P monodon Phƣơng Penaeus pháp Cách cố Số monodon chẩn định mẫu mẫu đoán Post Kết Số lần So sánh Thƣơng lặp lại kết Larvae phẩm Mô học Davidson 30 15 15 Davidson 30 15 15 PCR Cồn 95% 30 15 15 Lần 2 ISH Lần CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN IV.1 Kết tôm thẻ chân trắng P vannamei IV.1.1 Thí nghiệm thử nghiệm khả phát TSV phƣơng pháp ISH 42 Hiện nay, ISH phƣơng pháp đƣợc ứng dụng chẩn đốn mầm bệnh tơm ni phƣơng pháp chƣa ứng dụng chẩn đoán mầm bệnh TSV tôm TCT cách phổ biến, nên tiến hành thử nghiệm bƣớc đầu ứng dụng phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh TSV ổn định phƣơng pháp để ứng dụng chẩn đốn mầm bệnh tơm TCT Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo bố trí kết thu đƣợc hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Bảng 4.1: Kết thử nghiệm khả phát TSV ISH Mẫu Mô học PCR + ++ + ++ + ++ +++ +++ - - Đối chứng dƣơng Đối chứng âm ISH Kết lai không rõ ràng, hầu nhƣ khơng có tín hiệu lai Kết lai khơng rõ ràng, hầu nhƣ khơng có tín hiệu lai Có tín hiệu lai xuất nhƣng mờ nên không kết luận đƣợc Tín hiệu lai tƣơng đối rõ nhƣng khơng tập trung Khơng có tín hiệu lai phát ra, mẫu rõ nhuộm màu thuốc nhuộm bổ sung Kết đƣợc đọc dƣới KHV quang học cách đọc nhƣ sau: Mẫu dƣơng tính: vùi kết tủa màu xanh đến đen tế bào chất, tế bào không bị nhiễm virus cấu trúc mơ bình thƣờng bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam) Mẫu âm tính: khơng có màu xanh đen, bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) có màu cam sau trình lai Hình 4.1: Đối chứng dƣơng Hình 4.2: Đối chứng âm mang tơm phụ tơm lớn, X10 lớn, X10 43 Chú thích: “+”: mức độ nhiễm bệnh tƣơng đối thấp (số tế bào bị nhiễm bệnh dƣới 30% số tế bào quan sát mẫu) “++”: mức độ nhiễm bệnh trung bình (số tế bào bị nhiễm bệnh lớn 30% nhƣng nhỏ 60% số tế bào quan sát mẫu) “+++”: mức độ nhiễm bệnh cao (số tế bào bị nhiễm bệnh lớn 60% số tế bào quan sát mẫu) “-“: không phát tác nhân gây bệnh KHV: kính hiển vi Qua hai lần thực thí nghiệm, nhận thấy kết lai thu đƣợc chƣa đƣợc tốt khơng ổn định Các tín hiệu lai thu đƣợc lame mờ nhạt khơng tập trung nên khó việc kết luận Hiện tƣợng nguyên nhân định Thứ nhất, chúng tơi khơng thu đƣợc mẫu tơm bệnh điển hình nên phải sử dụng mẫu tơm lƣu lại phịng thí nghiệm mơ học Mẫu đƣợc lƣu thời gian năm nên số tính chất ban đầu mẫu khơng cịn giữ đƣợc nữa, cấu trúc mô bị biến dạng,… nên thực lai nhƣ trên, mẫu thu đƣợc kết khơng tốt Thứ hai, lƣợng RNA bị trình bảo quản mẫu thực lai Điều xảy trƣớc ba mẫu đƣợc cố định dung dịch Davidson để làm thí nghiệm mô học dùng ba mẫu để thực ISH Theo Hasson ctv (1997), dung dịch Davidson có mặt acid acetic, acid phân hủy dần lƣợng RNA mẫu sau thời gian định nên ta khơng nhận đƣợc tín hiệu lai từ mẫu, mẫu dƣơng tính với TSV Do thí nghiệm sau sử dụng dung dịch cố định mẫu khơng có mặt acid (dung dịch RNA – friendly) để khắc phục nhƣợc điểm Ngoài ra, lƣợng RNA mẫu bị thực 44 lai, giai đoạn biến tính mẫu 950C phút Vì TSV virus mang vật chất di truyền RNA mạch đơn nên ta biến tính mẫu 950C làm phân hủy hồn tồn cấu trúc RNA nên probe khơng tìm thấy trình tự đích để bắt cặp tạo tín hiệu sau lai Bên cạnh đó, lƣợng RNA dung dịch lai dung dịch rửa có mặt RNase, enzyme có tác dụng phân cắt RNA mẫu mô, nhƣng lý xảy hóa chất mà chúng tơi sử dụng có kit ISH chẩn đốn mầm bệnh TSV cơng ty DiagXotics Mỹ cung cấp Ngồi ra, chúng tơi thực lai đối chứng dƣơng kit tín hiệu lai không nhiều rải rác Ngƣời ta thực đối chứng dƣơng cách gây nhiễm tôm thẻ chân trắng với virus Taura liều cao, thu lấy quan nhƣ phụ bộ, gan tụy, dày, mang…cố định, đúc, cắt đính lên lame dƣơng Theo lý thuyết, tín hiệu lai nhận đƣợc đối chứng dƣơng phải nhiều, rõ ràng tập trung khơng phải nhƣ kết mà chúng tơi thu đƣợc, kể lần thí nghiệm thứ hai Điều khẳng định lần lƣợng RNA mẫu bị phân hủy trình lai, giai đoạn biến tính mẫu Trên đối chứng âm, mẫu rõ không bị nhiễm bẩn chứng tỏ trình lai đƣợc thực tốt không bị ngoại nhiễm Qua kết mà nhận đƣợc nhƣ lý đƣợc đƣa nhƣ vậy, tiến hành loạt thí nghiệm khác để ổn định phƣơng pháp lai áp dụng chẩn đoán mầm bệnh TSV IV.1.2 Kết thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH P vannamei IV.1.2.1 Kết thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu lai Do mẫu probe mà chúng tơi sử dụng khác hồn tồn chất, mẫu chứa RNA mạch đơn probe cDNA mạch đôi nên cần thử nghiệm để tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu cần thiết lai Chúng tơi thực thí nghiệm nhƣ thu đƣợc kết qua hai lần thực nhƣ sau: Kết tôm postlarvae Bảng 4.2: Kết thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tôm postlarvae Nghiệm thức I II III IV V 45 Mẫu Khơng phát Phát Có tín hiệu lai tín hiệu tín hiệu lai, đa tƣơng đối rõ, mẫu lai, nhuộm số nhuộm màu tốt màu bổ sung Khơng bị nhiễm tạp ít, hầu nhƣ khơng có Tín hiệu lai ít, hầu nhƣ khơng có phát tín hiệu lai, mẫu bổ sung khơng Tín hiệu lai nhuộm màu bổ Khơng phát tín hiệu lai Có tín hiệu lai rõ, cấu trúc mẫu rõ, khơng nhiễm tạp Có tín hiệu lai Khơng nhƣng có tín hiệu lai sung Khơng phát tín hiệu lai Có tín hiệu lai nhƣng khơng rõ phát tín hiệu lai Đối Có tín hiệu lai chứng không dƣơng tập trung Đối chứng âm bổ sung nhƣng Có tín hiệu lai nhƣng mờ, khơng thể kết luận Khơng Mẫu nhuộm Có tín hiệu lai Mẫu nhuộm màu bổ sung ít, rải rác Mẫu trúc mô rõ màu bổ sung không bị nhiễm tạp Có tín hiệu lai nhiều cấu trúc mơ rõ nhuộm tín hiệu Mẫu nhuộm màu bổ sung khơng bị nhiễm tạp tín hiệu lai lai lai tốt, cấu nhƣng cấu trúc mơ rõ Tín hiệu lai phát Khơng phát Mẫu có tín hiệu Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai tốt, mờ Khơng mờ Khơng Khơng có tín hiệu lai phát Khơng phát tín hiệu tín hiệu lai lai Có tín hiệu lai Tín hiệu lai nhƣng Mẫu nhuộm màu bổ sung không bị nhiễm tạp rải rác Mẫu nhuộm màu bổ sung Kết tôm thƣơng phẩm Trên tôm thƣơng phẩm thu đƣợc kết tƣơng tự nhƣ tơm postlarvae thực thí nghiệm nhƣ trên: Bảng 4.3: Kết thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tôm thƣơng phẩm Nghiệm thức I II III IV V 46 Mẫu Khơng phát Phát Có tín hiệu lai tín hiệu tín hiệu lai, đa tƣơng đối rõ, mẫu lai, nhuộm số nhuộm màu tốt màu bổ sung Không bị nhiễm tạp ít, hầu nhƣ khơng có Tín hiệu lai ít, hầu nhƣ khơng có phát tín hiệu lai, mẫu bổ sung khơng Tín hiệu lai nhuộm màu bổ Khơng phát tín hiệu lai Có tín hiệu lai rõ, cấu trúc mẫu rõ, không nhiễm tạp Có tín hiệu lai Khơng nhƣng có tín hiệu lai sung Khơng phát tín hiệu lai Có tín hiệu lai nhƣng khơng rõ Khơng phát lai Đối Có tín hiệu lai chứng không dƣơng tập trung Đối chứng âm Mẫu nhuộm màu bổ sung bổ sung nhƣng Có tín hiệu lai nhƣng mờ, kết luận tín hiệu Mẫu nhuộm Có tín hiệu lai ít, rải rác Mẫu trúc mô rõ màu bổ sung khơng bị nhiễm tạp Có tín hiệu lai nhiều cấu trúc mơ rõ nhuộm tín hiệu Mẫu nhuộm màu bổ sung không bị nhiễm tạp tín hiệu lai lai lai tốt, cấu nhƣng cấu trúc mơ rõ Tín hiệu lai phát Khơng phát Mẫu có tín hiệu Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai tốt, mờ Khơng mờ Khơng Khơng có tín hiệu lai phát Khơng phát tín hiệu tín hiệu lai lai Có tín hiệu lai Tín hiệu lai nhƣng Mẫu nhuộm màu bổ sung không bị nhiễm tạp rải rác Mẫu nhuộm màu bổ sung Qua kết trên, thấy nghiệm thức III cho kết tốt hai đối chứng mẫu thực thí nghiệm tơm postlarvae thƣơng phẩm, tín hiệu lai cấu trúc mô rõ quan sát dƣới KHV quang học Cịn nghiệm thức thứ IV V tín hiệu lai hầu nhƣ khơng có mẫu hai đối chứng, điều cấu trúc RNA có số đoạn có trình tự bổ sung với nên chúng tự bắt cặp hình thành cấu trúc thứ cấp, nhiệt độ thấp chƣa đủ để làm phá vỡ hoàn toàn liên kết nên bắt cặp RNA mẫu probe hạn chế 47 Vì vậy, chúng tơi khơng thu đƣợc tín hiệu lai mẫu dƣơng tính với TSV Cịn hai trƣờng hợp I II, không phát tín hiệu lai mẫu nhiệt độ biến tính q cao làm phân hủy hồn tồn lƣợng RNA có mẫu Ở nghiệm thức thứ ba, chúng tơi thực biến tính probe riêng thực biến tính mẫu 700C phút thu đƣợc kết lai tốt Do chúng tơi kết luận nhiệt độ 700C thích hợp cho việc biến tính mẫu trƣớc lai sử dụng kết cho thí nghiệm sau Giai đoạn biến tính probe thực lai giai đoạn quan trọng q trình lai, có ảnh hƣởng định đến kết lai sau này, việc tìm điều kiện tối ƣu để tiến hành lai giai đoạn có ý nghĩa lớn trình thí nghiệm Hình 4.3: Mẫu lai đƣợc thực theo nghiệm thức thứ III, quan sát phụ X10 X40 IV.1.2.2 Kết thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K Nếu theo quy trình kit thời gian cắt với Proteinase K 15 phút 600C thực buồng ẩm Đây thời gian mà kit khuyến cáo sử dụng chung tất đối tƣợng, nhƣng đối tƣợng khác cấu trúc mô khác nên thời gian cắt với Proteinase khác Thực thí nghiệm theo cách bố trí thu đƣợc kết hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Kết tôm postlarvae 48 Bảng 4.4: Kết thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K postlarvae Nghiệm thức 11 phút 13 phút 15 phút 17 phút 19 phút Mẫu Mẫu tính, âm cấu trúc mô rõ Mẫu âm, cấu trúc mơ rõ Mẫu âm tính, Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai ít, cấu trúc mơ nhƣng ít, cấu nhƣng cấu trúc cấu trúc mô không rõ hiệu hiệu lai Mẫu nhƣng cấu trúc mô rõ tốt, nhƣng lai, mơ rõ đẹp trúc mơ rõ tín hiệu lai khơng rõ cấu trúc mơ khơng có luận tín Mẫu có tín hiệu Mẫu có tín hiệu lai Mẫu dƣơng, âm, Mẫu dƣơng Mẫu dƣơng nhƣng lai hiệu lai nhƣng lai, cấu trúc mô rải rác, cấu trúc mô không rõ ít, cấu lai trúc mơ khơng rõ mơ mờ âm, Mẫu có tín Mẫu dƣơng hiệu mơ nhƣng ít, cấu khơng rõ dƣơng, Mẫu tín lai cấu trúc mơ rõ nhƣng cấu trúc khơng thể kết nhƣng tín hiệu lai rõ cấu trúc mơ rõ âm, Mẫu có tín Mẫu Đối chứng âm thể kết luận đƣợc lai Mẫu dƣơng, Đối chứng rõ lai có tín hiệu hiệu rõ Mẫu trúc mơ khơng nhƣng khơng tín Có tín hiệu lai Có cấu trúc mơ hiệu Mẫu dƣơng, cấu Mẫu có tín hiệu lai có rõ Mẫu cịn rõ nhƣ lúc đầu không Mẫu cấu trúc mô hiệu dƣơng, mờ nhƣng Mẫu mơ mờ Mẫu có tín Mẫu có tín Mẫu trúc mơ rõ âm, bị ngoại nhiễm mờ Mẫu dƣơng, Mẫu dƣơng, cấu cấu trúc mô rõ trúc mô mờ mờ Mẫu dƣơng nhƣng ít, cấu trúc mơ khơng rõ Mẫu âm, cấu trúc mô rõ, Mẫu âm, cấu Mẫu âm, cấu trúc không bị ngoại trúc mô mờ mô mờ nhiễm Qua bảng kết trên, nhận thấy tơm postlarvae thời gian cắt với Proteinase K thích hợp 15 phút Ở thời gian này, cấu trúc mơ rõ tín hiệu lai tốt nhất, đảm bảo đƣợc tính ƣu việt ISH vừa phát đƣợc bệnh vừa xác định xác quan đích tác nhân gây bệnh Cịn thời gian cắt 11 13 phút khơng có có tín hiệu lai nhƣng cấu trúc mơ lại rõ Điều 49 probe xâm nhập qua thành tế bào vào bên để lai với trình tự RNA đích làm cho kết âm tính Nguyên nhân việc có lẽ thời gian cắt mẫu với enzyme ngắn, enzyme không đủ thời gian cắt bỏ thành tế bào mẫu, tạo điều kiện thuận lợi cho probe hoạt động Ở số trƣờng hợp, probe xâm nhập vào nhƣng với lƣợng nên tạo tín hiệu lai khơng rõ ràng mờ Trong trƣờng hợp thời gian cắt 17 phút 19 phút có tín hiệu lai nhƣng đa số cấu trúc mơ bị mờ Hiện tƣợng thời gian cắt lâu, enzyme phá hủy hồn tồn cấu trúc mơ Vì vậy, ta nói thời gian cắt có ảnh hƣởng lớn đến kết lai sau Nếu ta cắt chƣa đủ thời gian khơng phát đƣợc tín hiệu lai có mặt RNA mẫu (âm tính giả) nhƣng thời gian cắt q lâu cấu trúc mơ bị phá hủy hồn tồn, khó nhận biết quan thể nên làm hạn chế ƣu điểm phƣơng pháp ISH định vị đƣợc vị trí tác nhân gây bệnh thể sinh vật Kết tôm thƣơng phẩm Trên tôm thƣơng phẩm thu đƣợc kết tƣơng tự nhƣ sau: Bảng 4.5: Kết thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K tôm thƣơng phẩm Nghiệm thức 11 phút 13 phút 15 phút 17 phút 19 phút Mẫu Mẫu âm tính, cấu trúc mơ rõ âm tính, cấu trúc mơ rõ Mẫu âm, cấu Mẫu trúc mơ rõ Mẫu có tín hiệu lai nhƣng mờ Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai ít, nhƣng ít, cấu tốt, cấu trúc mô cấu trúc mô không trúc mơ rõ Mẫu hiệu cấu trúc mơ rõ có Mẫu dƣơng, cấu trúc mơ rõ cịn rõ nhƣ lúc đầu Mẫu có tín hiệu lai nhƣng khơng thể kết luận đƣợc tín Có tín hiệu lai Có tín hiệu lai lai có tín hiệu hiệu lai ít, cấu tốt, cấu trúc nhƣng ít, cấu nhƣng dƣơng nhƣng ít, Mẫu có tín Mẫu không Mẫu rõ lai, mô rõ trúc mô rõ Mẫu âm, cấu Mẫu có tín Mẫu có mơ rõ trúc mơ khơng rõ tín Mẫu dƣơng Mẫu dƣơng nhƣng 50 trúc mô hiệu rõ lai hiệu lai nhƣng rõ cấu trúc khơng thể kết nhƣng rất ít, khơng mơ đẹp luận kết luận đƣợc Khơng phát Khơng phát Mẫu tín Mẫu có tín hiệu Mẫu có tín hiệu lai tín hiệu tín hiệu hiệu lai nhƣng lai tốt, cấu trúc rải rác, cấu trúc mô lai chứng dƣơng tín hiệu lai ít, cấu trúc mơ rõ Mẫu dƣơng, Mẫu Mẫu âm mô rõ, đẹp mờ dƣơng Mẫu dƣơng Mẫu dƣơng nhƣng tín hiệu lai nhƣng ít, cấu tốt, cấu trúc mơ ít, khơng rõ Mẫu Đối chứng không rõ lai Mẫu dƣơng, Đối âm có khơng ngoại trúc mơ rõ âm, rõ cấu trúc mô không rõ Mẫu âm, cấu bị Mẫu âm, cấu trúc trúc mô rõ nhiễm mô rõ, Mẫu âm, cấu trúc không bị ngoại mô mờ nhiễm Dựa vào bảng kết trên, nhận thấy thời gian cắt tối ƣu cho tôm thƣơng phẩm 17 phút Sở dĩ thời gian cắt với Proteinase K khác hai loại tôm cấu trúc mô tơm thƣơng phẩm hồn chỉnh cứng cấu trúc mơ tơm postlarvae Do đó, tơm thƣơng phẩm cần kéo dài thời gian cắt với Proteinase K, đủ để enzyme mềm hóa cấu trúc mô, giúp probe xâm nhập vào tế bào dễ dàng lai Qua thí nghiệm này, nhận thấy đối tƣợng khác địi hỏi thời gian cắt khác Tùy theo đối tƣợng thí nghiệm mà ta ƣớc lƣợng thời gian cắt thích hợp để thu đƣợc kết lai tốt nhất, phát huy hết tính ƣu việt phƣơng pháp ISH IV.1.2.3 Kết thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp Thể tích dung dịch lai yếu tố quan trọng định kết trình lai Sau thực thí nghiệm nhƣ cách bố trí trên, thu đƣợc kết qua hai lần thực nhƣ sau: 51 Kết postlarvae Bảng 4.6: Kết thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp tôm postlarvae Nghiệm thức 100 l 75 l 50 l Mẫu Mẫu có tín hiệu lai rõ nhƣng xuất hiện tƣợng dƣơng tính giả màu nhiều Mẫu có tín hiệu lai rõ, Tín hiệu lai xuất dƣơng khơng có tín tính giả nhƣng hiệu lai mẫu, đa trƣờng hợp dùng 100 số bắt màu thuốc l, mẫu đẹp rõ nhuộm bổ sung Đối Mẫu rõ, tín hiệu lai Mẫu rõ, tín hiệu lai Mẫu rõ nhƣng tín chứng nhiều dƣơng tính giả nhiều dƣơng tính hiệu lai ít, đa số dƣơng nhiều Đối Mẫu nhuộm màu bổ chứng âm sung, cấu trúc mô rõ giả nhuộm màu bổ sung Mẫu nhuộm màu Mẫu nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô bổ sung, cấu trúc mô rõ rõ Kết tơm thƣơng phẩm Bảng 4.7: Kết thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp tơm thƣơng phẩm Nghiệm thức 100 l 75 l 50 l Mẫu Mẫu có tín hiệu lai Mẫu có tín hiệu lai rõ Mẫu có tín hiệu lai rải rõ nhƣng có nhƣng xuất rác hai mẫu đầu, tƣợng dƣơng tính dƣơng tính giả, màu ba mẫu cịn lại hầu nhƣ giả tín hiệu nền có giảm, mẫu rõ khơng có tín hiệu lai, đa 52 nhiều đẹp số nhuộm màu bổ sung Mẫu rõ, tín hiệu lai Đối chứng dƣơng nhiều, màu dƣơng tính giả nhiều Mẫu Đối chứng âm Mẫu rõ, tín hiệu lai Mẫu rõ nhƣng tín hiệu nhiều dƣơng tính lai ít, đa số nhuộm giả nhuộm Mẫu nhuộm màu màu bổ sung, cấu bổ sung, cấu trúc mô trúc mô rõ rõ màu bổ sung Mẫu nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ Sau thực lai, thu đƣợc tín hiệu lai ba nghiệm thức nhƣng nghiệm thức thứ ba tín hiệu lai thấp không thấy xuất hiện tƣợng dƣơng tính giả Ở trƣờng hợp dung dịch lai khơng đủ để bắt cặp hồn tồn với lƣợng RNA có mẫu Trong hai nghiệm thức đầu có tƣợng dƣơng tính giả, thể tích dung dịch lai 100 l lại xuất thêm màu nhiều làm cho mẫu bị sậm màu, quan sát quan không rõ ràng Hiện tƣợng dƣơng tính giả bắt cặp khơng đặc hiệu probe với quan khác RNA đích, probe bắt cặp với lớp cutin thành tế bào tạo thành lớp kết tủa màu xanh dày đặc Trong thí nghiệm này, chúng tơi nhận thấy tƣợng dƣơng tính giả tỷ lệ thuận với thể tích dung dịch lai sử dụng lai Ở nghiệm thức sử dụng 100 l dung dịch lai có tƣợng dƣơng tính giả nhiều nhất, giảm dần khơng phát dƣơng tính giả nghiệm thức cuối Vì vậy, khơng nên sử dụng dung dịch lai nhiều lai, thể tích dung dịch lai 75 l/mẫu nhƣ kit khuyến cáo thích hợp Hình 4.4: Hiện tƣợng dƣơng tính giả phụ tơm lớn, X10 53 IV.2 Kết tôm sú P monodon IV.2.1 Kết thí nghiệm theo quy trình kit để ổn định phƣơng pháp Quy trình lai chỗ ISH đƣợc thử nghiệm để kiểm tra virus WSSV tôm sú Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Ở đây, tiến hành thử nghiệm lại quy trình để xem xét tính ổn định độ xác phƣơng pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV P monodon, kết hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Bảng 4.8: Kết thí nghiệm thực theo quy trình hóa chất kit Mẫu Mô WSSV học + ISH PCR + Lần Mẫu dƣơng (+) rõ Mẫu dƣơng (+) rõ quan sát dƣới KHV Mẫu dƣơng (++), lát cắt ++ ++ Lần mẫu lame không bị trôi rõ quan sát dƣới KHV quan sát dƣới KHV Mẫu dƣơng (++), cấu trúc mô rõ quan sát dƣới KHV Mẫu dƣơng (+++), lát cắt Mẫu dƣơng (+++) nhƣng +++ +++ không bị trôi nhuộm mờ, cấu trúc không rõ màu rõ Đối chứng Mẫu dƣơng (+++), cấu Mẫu dƣơng (+++), cấu +++ +++ dƣơng âm trúc mô rõ nhuộm trúc mô rõ lát cắt màu tốt Đối chứng quan sát dƣới KHV khơng bị trơi Khơng phát tín hiệu Khơng phát tín hiệu - - lai, mẫu không bị nhiễm lai, mẫu không bị nhiễm bẩn bắt màu thuốc bẩn bắt màu thuốc ... mầm bệnh tơm ni phƣơng pháp chƣa ứng dụng chẩn đoán mầm bệnh TSV tôm TCT cách phổ biến, nên tiến hành thử nghiệm bƣớc đầu ứng dụng phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh TSV ổn định phƣơng pháp để. .. sau: III.6 .2. 1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei A Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phƣơng pháp Để thử nghiệm khả chẩn đoán mầm bệnh TSV TCT phƣơng pháp. .. Immunohistochemistry In Situ hybridization (11 – 20 02) II.5.8 .2 Ứng dụng phương pháp ISH chẩn đoán mầm bệnh động vật nuôi thủy sản Trong thủy sản mà đặc biệt chẩn đoán mầm bệnh nguy hiểm tơm, ngồi biện pháp