TCVN: PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11039-5:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA Food aditive - Microbiological analyses - Part 5: Detection of salmonella Lời nói đầu TCVN 11039-5:2015 xây dựng sở tham khảo JECFA 2006, Combined compendium of food additive specifications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and referenced in the food additive specitications; TCVN 11039-5:2015 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố; Bộ tiêu chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm phần sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí kỹ thuật đếm đĩa; - TCVN 11039-2:2015, Phần 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí kỹ thuật đếm đĩa xoắn; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát định lượng coliform E coli kỹ thuật đếm số có xác suất lớn (Phương pháp chuẩn); - TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát định lượng coliform E coli kỹ thuật đếm số có xác suốt lớn (Phương pháp thông dụng); - TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát Salmonella; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát định lượng Staphylococcus aureus kỹ thuật đếm khuẩn lạc; - TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát định lượng Staphylococcus aureus kỹ thuật đếm số có xác suất lớn (MPN); - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men nấm mốc PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA Food additive - Microbiological analyses - Part 5: Detection of Salmonella Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát Salmonella phụ gia thực phẩm Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi AOAC 967.28 Salmonella in foods Serological tests (Salmonella thực phẩm Phép thử huyết thanh) AOAC 978.24 Salmonella spp in foods Biochemical identification kit method (Salmonella spp thực phẩm Phương pháp nhận diện kit sinh hóa) AOAC 989.12 Salmonella spp., Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods Biochemical identification kit method (Salmonella spp., Escherichia coli vi khuẩn Enterobacteriaceae khác thực phẩm Phương pháp nhận diện kit sinh hóa) AOAC 991.13 Salmonella, Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods Biochemical system identification (Vitek GNI+) screening method [Salmonella, Escherichia coli vi khuẩn Enterobacteriaceae khác thực phẩm Phương pháp sàng lọc nhận diện hệ sinh hóa (Vitek GNI+)] AOAC 994.04 Salmonella in dry foods Refrigerated pre-enrichment and selective enrichment broth culture methods (Salmonella thực phẩm dạng khô Phương pháp sử dụng tiền tăng sinh lạnh đông canh thang tăng sinh chọn lọc) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Salmonella (Salmonella) Các vi sinh vật hình thành khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình mơi trường đặc chọn lọc có đặc điểm sinh hóa huyết mơ tả tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn Nguyên tắc Quy trình phát Salmonella cần qua bốn giai đoạn nhau: a) Tăng sinh sơ môi trường lỏng không chọn lọc (canh thang lactose mơi trường thích hợp khác), ủ 24 h ± h 35 °C b) Tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc (môi trường Tetrathionat, môi trường RappaportVassiliadis mơi trường thích hợp khác), với nhiệt độ thời gian thích hợp c) Đổ đĩa nhận dạng: cấy dịch tăng sinh thu lên môi trường đặc chọn lọc (thạch BS, thạch XLD thạch HE) với nhiệt độ thời gian thích hợp d) Khẳng định Salmonella phép thử sinh hóa huyết thích hợp (xem 8.5) Mơi trường cấy, dịch pha loãng thuốc thử 4.1 Canh thang lactose (xem A.1) 4.2 Canh thang selenit cystin (SC) (xem A.2) 4.3 Canh thang tetrathionat (TT) (xem A.3) 4.4 Môi trường Rappaport-Vassiliadis (RV) (xem A.4) 4.5 Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD) (xem A.5) 4.6 Thạch Hektoen enteric (HE) (xem A.6) 4.7 Thạch bismuth sulfit (BS) (xem A.7) 4.8 Thạch sắt ba đường (TSI) (xem A.8) 4.9 Thạch lysin sắt (LIA) (Edwards Fife) (xem A.9) 4.10 Canh thang trypton (tryptophan) (xem A.10) 4.11 Canh thang trypticase đậu tương-tryptose (xem A.11) 4.12 Canh thang MR-VP (xem A.12) 4.13 Thạch xitrat Simmons (xem A.13) 4.14 Canh thang ure (xem A.14) 4.15 Canh thang ure (chuẩn bị nhanh) (xem A.15) 4.16 Canh thang malonat (xem A.16) 4.17 Canh thang lysin decarboxylase (xem A.17) 4.18 Môi trường thử nghiệm tính di động (bán đặc) (xem A.18) 4.19 Canh thang kali xyanua (KCN) (xem A.19) 4.20 Canh thang cacbohydrat phenol đỏ (xem A.20) 4.21 Canh thang cacbohydrat đỏ tía (xem A.21) 4.22 Thạch MacConkey (xem A.22) 4.23 Canh thang dịch tim não (BHI) (xem A.23) 4.24 Thạch máu tryptose (xem A.24) 4.25 Dung dịch papain, % (khối lượng) (xem A.25) 4.26 Thuốc thử Kovacs (xem A.26) 4.27 Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP) (xem A.27) 4.28 Creatin phosphat tinh thể 4.29 Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng) (xem A.28) 4.30 Dung dịch thuốc nhuộm bromcresol đỏ tía, 0,2 % 4.31 Chỉ thị metyl đỏ (xem A.31) 4.32 Dung dịch natri clorua (NaCI), % (khối lượng/thể tích) 4.33 Nước muối sinh lý, 0,85 % (khối lượng/thể tích) (vơ trùng) (xem A.29) 4.34 Nước muối sinh lý formalin (xem A.30) 4.35 Dung dịch mannan endo-1,4- betamannosidase (EC 3.2.178), 1,0 % (khối lượng/thể tích) Thêm g mannosidase vào 99 ml nước cất vô trùng 4.36 Kháng huyết Salmonella đa giá (O) 4.37 Kháng huyết Salmonella đa giá (H) 4.38 Các kháng huyết Salmonella đơn giá nhóm (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G, H, I, Vi, nhóm thích hợp khác 4.39 Các kháng huyết Salmonella Spicer-Edwards (H) 4.40 Nước cất vô trùng Thiết bị dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần chúng có đặc tính thích hợp Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm vi sinh cụ thể là: 5.1 Máy đồng hóa 5.2 Bình trộn vơ trùng 5.3 Bình nón nắp xốy, miệng rộng, dung tích 500 ml 5.4 Bình nón, dung tích 500 ml, vơ trùng 5.5 Cốc có mỏ, dung tích 250 ml, vô trùng 5.6 Phễu giấy phễu thủy tinh vơ trùng, có cỡ phù hợp 5.7 Bộ dàn mẫu, chất dẻo thủy tinh uốn đầu, vơ trùng 5.8 Cân cân, cân đến 2000 g, có độ nhạy 0,1 g 5.9 Cân cân, cân đến 120 g, có độ nhạy mg 5.10 Tủ ấm, trì nhiệt độ 35 °C ± °C 5.11 Tủ ấm, có chế độ làm lạnh tủ lạnh phịng thử nghiệm, trì nhiệt độ °C ± °C 5.12 Nồi cách thủy, kiểm soát nhiệt độ 49 °C ± °C 5.13 Nồi cách thủy, tuần hồn, kiểm sốt nhiệt độ 43 °C ± 0,2 °C 5.14 Nồi cách thủy, tuần hồn, kiểm sốt nhiệt độ 42 °C ± 0,2 °C 5.15 Thìa dụng cụ thích hợp khác để chuyển mẫu phụ gia thực phẩm, vô trùng 5.16 Đĩa cấy, vô trùng, thủy tinh chất dẻo, kích thước 15 mm x 100 mm 5.17 Pipet vơ trùng, phân phối ml, chia vạch đến 0,01 ml; phân phối ml 10 ml, chia vạch 0,1 ml 5.18 Kim cấy vịng cấy (đường kính khoảng mm), nicrom, platin-iridi, dây cromel chất dẻo vô trùng 5.19 Ống nghiệm ống cấy vơ trùng, kích thước 16 mm x 150 mm 20 mm x 150 mm; ống huyết thanh, kích thước 10 mm x 75 mm 13 mm x 100 mm 5.20 Máy trộn Vortex 5.21 Kéo, dao, kẹp, vô trùng 5.22 Đèn (để quan sát phản ứng huyết học) 5.23 Đèn Fisher Bunsen (đèn có đầu đốt sử dụng ga) đèn cồn 5.24 Giấy thử pH, có dải pH từ đến 8, chia vạch 0,4 đơn vị pH dải màu 5.25 Máy đo pH Lấy mẫu Mẫu gửi đến phịng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu khơng bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm bên có liên quan nên thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Mẫu trộn để thu phần mẫu thử đồng Cách tiến hành 8.1 Tăng sinh sơ Cân vơ trùng 25 g mẫu, cho vào bình nắp vặn miệng rộng vơ trùng dung tích 500 ml (5.3) vật chứa thích hợp khác Thêm 225 ml canh thang lactose vô trùng (4.1) trộn đều, chuẩn bị theo tỉ lệ mẫu : canh thang = : (thể tích) Vặn chặt nút bình để yên 60 ± nhiệt độ phòng Trộn kỹ cách xoay xác định pH giấy thử (5.24) Chỉnh pH cần, đến 6,8 ± 0,2 Nới lỏng nắp bình khoảng 1/4 vịng ủ 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) Trong số trường hợp đặc biệt, việc phân tích mẫu bị cản trở độ nhớt chất làm dày Có thể bổ sung bước xử lý sau: - Đối với gum ghatti, bổ sung natri clorua % (4.32) (nồng độ cuối 0,1 %) vào môi trường tăng sinh sơ canh thang lactose, chỉnh pH đến 6,5 - Đối với phân tích getatin, thêm ml dung dịch % papain (4.25) (nồng độ cuối 0,1 %) vào môi trường tăng sinh sơ canh thang lactose, trộn kỹ Vặn chặt nút bình ủ 35 °C tủ ấm (5.10) 60 ± Trộn cách xoay chỉnh pH đến 6,8, cần Nới lỏng bình khoảng 1/4 vòng ủ 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) - Đối với carob bean gum guar gum, cân vô trùng 25 g mẫu cho vào cốc có mỏ vơ trùng dung tích 250 ml (5.5) vật chứa thích hợp khác Chuẩn bị dung dịch mannan endo-1,4-betamannosidase 1,0 % (4.35) Phân phối vào chai 150 ml Dung dịch bảo quản °C đến °C tuần Thêm 225 ml canh thang lactose vô trùng 2,25 ml dung dịch mannosidase % vơ trùng vào bình nắp xoáy miệng rộng 500 ml (5.3) vật chứa thích hợp Khuấy mạnh canh thang mannosidase/lactose que khuấy từ, đồng thời đổ nhanh 25 g mẫu thử qua phễu thủy tinh vô trùng (5.6) vào canh thang mannosidase/lactose Vặn chặt nút bình để yên 60 ± nhiệt độ phịng Nới lỏng bình ủ 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) mà không điều chỉnh pH 8.2 Tăng sinh chọn lọc 8.2.1 Đối với gum carob bean gum guar Chuyển ml dịch cấy tăng sinh sơ (xem 8.1) vào 10 ml canh thang SC (4.2) ml dịch cấy tăng sinh sơ khác vào 10 ml canh thang TT (4.3) Trộn máy Vortex (5.20) Ủ canh thang SC canh thang TT 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) Tiến hành theo 8.2.2 b 8.2.2 Đối với mẫu khác Chuyển 0,1 ml dịch cấy tăng sinh sơ (xem 8.1) vào 10 ml môi trường RV (4.4) ml dịch cấy tăng sinh sơ khác vào 10 ml canh thang TT (4.3) Trộn máy Vortex (5.20) b) Ủ môi trường tăng sinh chọn lọc sau: - Mật độ vi sinh vật cao: Ủ môi trường RV 24 h ± h 42 °C ± 0,2 °C nồi cách thủy tuần hồn có kiểm soát nhiệt (5.14); ủ canh thang TT 24 h ± h 43 °C ± 0,2 °C nồi cách thủy tuần hồn có kiểm sốt nhiệt (5.13) - Mật độ vi sinh vật thấp (ngoại trừ gum carob bean gum guar): Ủ môi trường RV 24 h ± h 42 °C ± 0,2 °C (nồi cách thủy tuần hồn có kiểm sốt nhiệt) (5.14); ủ canh thang TT 24 h ± h 35 °C ± 2,0 °C tủ ấm (5.10) c) Trộn (vortex, ống) cấy ria vịng cấy mm (5.18) 10 µl canh thang TT ủ lên thạch BS (4.7) (chuẩn bị đĩa BS ngày trước cấy ria bảo quản nơi tối nhiệt độ phòng), thạch XLD (4.5) thạch HE (4.6) d) Cấy lặp lại với vòng cấy mm (10 µl) canh thang SC (đối với guar gum) môi trường RV (đối với mẫu khác) e) Đối với tùy chọn tăng sinh sơ mẫu ủ làm lạnh tăng sinh chọn lọc mẫu ủ (riêng canh thang SC TT) thực phẩm có độ ẩm thấp, xem AOAC 994.04 f) Ủ đĩa 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) g) Kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc Salmonella 8.3 Sàng lọc khuẩn lạc Kiểm tra đĩa (xem 8.2) sau: a) Hình thái khuẩn lạc Salmonella điển hình - Thạch HE: khuẩn lạc có màu xanh (từ lục lam đến lam), có khơng có tâm đen Nhiều chủng cấy Salmonella cho khuẩn lạc có tâm lớn, màu đen bỏng xuất dạng khuẩn lạc đen gần hồn tồn Số lồi Salmonella sinh khuẩn lạc màu vàng, có khơng có tâm màu đen, khơng đặc trưng - Thạch BS: khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu nâu, xám đen, đơi có ánh kim loại Xung quanh mơi trường thường ban đầu có màu nâu, sau thời gian ủ chuyển màu đen, tạo thành quầng Một số chủng cho khuẩn lạc màu xanh lá, môi trường xung quanh sẫm màu không - Thạch XLD: khuẩn lạc màu hồng có khơng có tâm màu đen Nhiều chủng cấy Salmonella cho khuẩn lạc có tâm lớn màu đen, bóng cho khuẩn lạc gần đen hồn tồn Số lồi Salmonella khơng điển hình sinh khuẩn lạc màu vàng, có khơng có tâm màu đen b) Hình thái khuẩn lạc Salmonella khơng điển hình Khi khơng thấy có khuẩn lạc điển hình nghi ngờ Salmonella, tìm khuẩn lạc Salmonella khơng điển sau: - Thạch HE thạch XLD: Số chủng cấy Salmonella khơng điển hình sinh khuẩn lạc màu vàng, có khơng có tâm màu đen thạch HE thạch XLD Khi khơng có khuẩn lạc Salmonella điển hình thạch HE thạch XLD sau ủ 24 h ± h chọn hai nhiều khuẩn lạc Salmonella khơng điển hình - Thạch BS: Một vài chủng khơng điển hình sinh khuẩn lạc màu xanh lá, môi trường xung quanh sẫm màu không Nếu không xuất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ thạch BS sau 24 h ± h khơng chọn khuẩn lạc mà ủ lại thêm 24 h ± h Nếu không xuất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ sau ủ 48 h ± h chọn hai nhiều khuẩn lạc khơng điển hình c) Chủng cấy kiểm chứng khuyến cáo sử dụng Cùng với chủng cấy kiểm chứng dương tính (Salmonella điển hình), ba chủng cấy Salmonella khuyến cáo sử dụng lựa chọn hình hình thái khuẩn lạc Salmonella khơng điển hình môi trường thạch chọn lọc Các chủng cấy S diarizonae (ATCC 12325) dương tính với lactose, dương tính với hydro sulfua (H2S) S abortus equi (ATCC 9842) âm tính với lactose, âm tính với hydro sulfua; S diarizonae (ATCC 29934) dương tính với lactose, âm tính với hydro sulfua CHÚ THÍCH: Các chủng cấy lấy từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kì, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 8.4 Cấy chuyển sang thạch nghiêng a) Chọn hai nhiều khuẩn lạc điển hình nghi ngờ Salmonella từ loại thạch chọn lọc (xem 8.3) Cấy vào thạch TSI (4.8) thạch LIA (4.9) Nếu đĩa thạch BS khơng có khuẩn lạc Salmonella điển hình nghi ngờ khơng thấy có khuẩn lạc mọc ủ thêm 24 h Dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào khuẩn lạc chọn ria cấy lên mặt nghiêng thạch TSI, sau đâm sâu xuống đáy Không cần khử trùng que cấy, cấy vào thạch LIA cách đâm sâu xuống đáy thạch hai lần sau ria lên mặt nghiêng Do phản ứng decarboxyl hóa lysin yếm khí bắt buộc nên thạch nghiêng LIA phải có phần chân cao cm Bảo quản đĩa thạch chọn lọc chọn nhiệt độ từ °C đến °C b) Ủ thạch nghiêng TSI LIA 35 °C 24 h ± h Nới lỏng nắp ống để trì điều kiện hiếu khí ủ, nhằm ngăn ngừa sinh nhiều hydro sulfua Salmonella điển hình sinh kiềm (màu đỏ) bề mặt nghiêng sinh axit (màu vàng) cấy đâm sâu, có khơng sinh hydro sulfua (làm đen thạch) thạch TSI Trên LIA, Salmonella điển hình sinh phản ứng kiềm (màu đỏ tía) đáy ống Chỉ ống có màu vàng đặc trưng đáy coi phản ứng axit (âm tính) Vì vậy, khơng loại bỏ ống cấy dựa sở thấy nhạt màu Hầu hết chủng Salmonella sinh hydro sulfua LIA Một số chủng Salmonella sinh phản ứng màu đỏ gạch mặt nghiêng thạch LIA c) Nếu có mặt khuẩn lạc điển hình thạch BS sau ủ 24 h ± h chọn hai nhiều khuẩn lạc Tất đĩa thạch BS chọn sau 24 h ± h ủ lại thêm 24 h ± h Sau ủ 48 h ± h, chọn hai nhiều khuẩn lạc điển hình, có, từ đĩa thạch BS Chỉ khuẩn lạc chọn từ đĩa thạch BS sau ủ 24 h ± h cho phản ứng khơng điển hình thạch TSI LIA loại bỏ Salmonella d) Tất chủng cấy cho phản ứng kiềm chân thạch LIA, chưa kể đến phản ứng TSI, có khả Salmonella, cần thử tiếp phản ứng sinh hóa huyết Các chủng cấy cho phản ứng axit chân thạch LIA, cho phản ứng kiềm mặt nghiêng phản ứng axit chân thạch TSI cần xem xét khả Salmonella nên thử tiếp phản ứng sinh hóa huyết Các chủng cấy cho phản ứng axit chân thạch LIA, cho phản ứng axit mặt nghiêng chân thạch TSI không coi Salmonella Các chủng giả định dương tính TSI giữ lại thử nghiệm hướng dẫn để khẳng định Salmonella, bao gồm S arizonae Nếu thạch TSI không thấy phản ứng đặc trưng Salmonella (phản ứng kiềm mặt nghiêng phản ứng axit chân thạch) chọn thêm khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa môi trường chọn lọc cấy vào thạch nghiêng TSI LIA mô tả e) Áp dụng phép thử sinh hóa đối với: - Ba chủng giả định thạch TSI chuyển từ dãy đĩa ria cấy mơi trường RV, có, ba chủng giả định thạch TSI chuyển từ dãy đĩa ria cấy môi trường tetrathionat, có - Nếu từ dãy đĩa thạch không phân lập ba chủng giả định dương tính TSI phân lập ba chủng giả định dương tính TSI từ dãy đĩa thạch khác, được, để thử phản ứng sinh hóa huyết Kiểm tra tối thiểu sáu chủng cấy TSI từ 25 g phần mẫu thử 8.5 Thử nghiệm sinh hóa huyết 8.5.1 Thử nghiệm với chủng chưa cấy Cấy ria lên thạch TSI (xem 8.4) khuẩn lạc chưa chủng chọn thạch MacConkey (4.22), thạch HE (4.6) thạch XLD (4.5) Ủ đĩa 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) Chọn khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella loại thạch đĩa chọn lọc sau: a) Thạch MacConkey: Khuẩn lạc điển hình suốt khơng màu, đơi có tâm màu sẫm Các khuẩn lạc Salmonella làm vùng kết tủa mật đơi xuất có mặt vi sinh vật khác b) Thạch HE: Xem quy trình nêu điểm a 8.3 c) Thạch XLD: Xem quy trình nêu điểm a 8.3 Chuyển hai khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella vào mặt nghiêng thạch TSI LIA mô tả tiếp tục 8.4 8.5.2 Thử nghiệm với chủng cấy a) Phép thử urease (phép thử thông thường) Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khuẩn mặt nghiêng thạch TSI dương tính giả định (xem 8.4) cấy vào ống canh thang ure (4.14) Hiếm ống canh thang ure chưa cấy có màu đỏ tía bền (như kết dương tính), ống chưa cấy canh thang dùng làm kiểm chứng Ủ 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) b) Phép thử urease tùy chọn (phép thử nhanh) Chuyển hai vòng cấy mm từ chủng cấy mặt nghiêng thạch TSI dương tính giả định (xem 8.4) vào ống canh thang ure thử nhanh (4.15) Ủ h 37 °C ± 0,5 °C nồi cách thủy Loại bỏ tất chủng cấy cho phản ứng dương tính Giữ lại để xem xét thêm tất chủng cấy cho phản ứng âm tính (khơng đổi màu mơi trường) 8.5.3 Phép thử ngưng kết kháng huyết lông (H) đa giá a) Thực phép thử ngưng kết kháng huyết đa giá điểm muộn mô tả Cấy vi sinh vật phát triển từ mặt nghiêng thạch TSI âm tính urease (xem 8.5.2) vào hai môi trường sau: - Canh thang dịch tim não (4.23) ủ từ h đến h 35 °C tủ ấm (5.10) nhìn mắt thường thấy vi sinh vật phát triển (để thử nghiệm ngày); - Canh thang trypticase đậu tương-tryptose (4.11) ủ 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) (để thử nghiệm ngày hôm sau) Thêm 2,5 ml nước muối sinh lý formalin (4.34) vào ml dịch cấy b) Từ canh thang formalin, chọn hai chủng cấy thử với kháng huyết ngưng kết đa giá Salmonella (H) (4.37) Cho 0,5 ml kháng huyết ngưng kết đa giá Salmonella pha lỗng thích hợp vào ống huyết 10 mm x 75 mm 13 mm x 100 mm (5.19) Thêm 0,5 ml kháng nguyên cần thử Chuẩn bị nước muối kiểm chứng cách trộn 0,5 ml nước muối sinh lý formalin (4.34) với 0,5 ml kháng nguyên formalin Ủ hỗn hợp nhiệt độ từ 48 °C đến 50 °C nồi cách thủy (5.12) Quan sát sau khoảng 15 đọc kết cuối h Dương tính: ngưng kết ống kháng huyết thử nghiệm không ngưng kết ống kiểm chứng Âm tính: khơng ngưng kết ống kháng huyết thử nghiệm ống kiểm chứng Không đặc hiệu: ngưng kết ống kháng huyết thử nghiệm ống kiểm chứng Tiếp tục thử nghiệm chủng cấy cho kết nêu với kháng huyết Spicer-Edwards theo 8.5.4 8.5.4 Phép thử huyết Spicer-Edwards Sử dụng phép thử thay cho phép thử ngưng kết (H) đa giá (8.5.3) Phép thử sử dụng cho chủng cấy ngưng kết không đặc hiệu phép thử ngưng kết kháng huyết (H) đa giá Thực phép thử kháng huyết ngưng kết Spicer-Edwards (H) (4.39) mô tả Thực phép thử sinh hóa bổ sung (8.5.6.2) với chủng cấy cho kết thử ngưng kết (H) dương tính mơ tả Nếu hai dịch cấy formalin hóa âm tính thực phép thử huyết với bốn chủng bổ sung cấy canh thang (như trên) Nếu có thể, thu lấy hai chủng cấy dương tính để thử nghiệm sinh hóa Nếu chủng cấy TSI âm tính urease mà cho kết âm tính phép thử ngưng kết huyết (H) cần thực phép thử sinh hóa bổ sung 8.5.5 Thử nghiệm chất cấy âm tính urease a) Canh thang lysin decarboxylase Nếu phép thử LIA đáp ứng khơng cần lặp lại phép thử Sử dụng canh thang lysin decarboxylase (4.17) phép xác định cuối lysin decarboxylase chủng cấy cho phản ứng nghi ngờ LIA Cấy vào canh thang lượng nhỏ vi sinh vật phát triển mặt nghiêng thạch TSI nghi ngờ Salmonella (xem 8.5.2) Vặn chặt nắp ủ 48 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10), kiểm tra sau 24 h Các loài Salmonella gây phản ứng kiềm làm cho môi trường chuyển màu đỏ tía (phản ứng dương tính) Nếu phép thử âm tính, mơi trường chuyển màu vàng Nếu mơi trường bị màu (khơng vàng khơng đỏ tía) thêm vài giọt thuốc nhuộm bromcresol đỏ tía 0,2 % (4.30) đọc lại phản ứng ống b) Canh thang phenol đỏ dulcitol canh thang đỏ tía có 0,5 % dulcitol Ủ canh thang phenol đỏ dulcitol (4.20) canh thang đỏ tía (4.21) lượng nhỏ vi sinh vật phát triển thạch TSI (xem 8.4) Nới lỏng nắp ủ 48 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10), có kiểm tra sau 24 h Hầu hết loài Salmonella cho phản ứng dương tính, thị việc sinh khí ống Durham pH axit (mơi trường chuyển màu vàng) Phép thử âm tính thị việc khơng sinh khí ống Durham màu đỏ (với chất thị phenol đỏ) đỏ tía (với chất thị bromcresol đỏ tía) tồn mơi trường c) Canh thang trypton (hoặc tryptophan) Cấy vào canh thang trypton (hoặc tryptophan) (4.10) lượng nhỏ vi sinh vật phát triển thạch TSI (xem 8.4) Ủ 24 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) tiến hành thử nghiệm sau: 1) Khả phát triển canh thang kali xyanua (4.19): Chuyển vòng cấy mm (5.18) canh thang tryptophan cấy vi khuẩn sau 24 h vào canh thang KCN Hơ nóng miệng ống cho ống bịt kín đậy nút bần phủ sáp Ủ 48 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) kiểm tra sau 24 h Vi sinh vật phát triển (làm đục mơi trường) coi dương tính Hầu hết lồi Salmonella khơng sinh trưởng mơi trường này, biểu qua việc không làm đục môi trường 2) Sử dụng canh thang malonat (4.16): Chuyển vòng cấy mm (5.18) canh thang tryptophan cấy vi khuẩn sau 24 h vào canh thang malonat Hiếm ống canh thang malonat chưa cấy cho màu xanh lam bền (như phép thử dương tính), ống canh thang chưa cấy dùng làm kiểm chứng Ủ 48 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10), kiểm tra sau 24 h Hầu hết lồi Salmonella cho phản ứng âm tính canh thang (màu xanh không đổi màu) 3) Phép thử indol: Chuyển ml canh thang tryptophan cấy vi khuẩn 24 h vào ống nghiệm Thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs (4.26) Hầu hết chủng cấy Salmonella cho phản ứng âm tính (khơng có màu đỏ đậm bề mặt canh thang) Màu sắc trung gian, chuyển màu da cam hồng không ổn định báo cáo kết ± 4) Các phép thử ngưng kết huyết (H) Salmonella: Nếu chưa thực phép thử ngưng kết (H) đa giá (8.5.3) phép thử ngưng kết (H) Spicer-Edwards (8.5.4) thực phép thử giai đoạn 5) Loại bỏ tất chủng cấy Salmonella vừa dương tính với phép thử indol vừa âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết (H), vừa dương tính với phép thử KCN vừa âm tính với phép thử lysin decarboxylase 8.5.6 Phép thử ngưng kết huyết thân (O) Salmonella Chú ý: Kiểm tra trước tất kháng huyết Salmonella với chủng cấy biết 8.5.6.1 Phép thử kháng huyết thân (O) đa giá Dùng chì sáp để đánh dấu hai phần khoảng cm x cm hai phía đĩa Petri (15 mm x 100 mm) thủy tinh chất dẻo (5.16) Có thể sử dụng lam kính bán sẵn Nhũ hóa vịng cấy mm vi khuẩn cấy mặt nghiêng thạch TSI ủ từ 24 h đến 48 h tốt cấy thạch máu tryptose (chưa bổ sung máu) (4.24) với ml nước muối 0,85 % (4.33) Nhỏ giọt huyền phù vi khuẩn lên phần hình chữ nhật đánh dấu chì sáp Nhỏ tiếp giọt nước muối vào phía ô giọt kháng huyết thân (O) Salmonella đa giá (4.36) vào phần lại Dùng que cấy vô trùng để trộn huyền phù vi khuẩn với nước muối ô thứ lặp lại với ô nhỏ kháng huyết Chao nghiêng hỗn dịch quan sát tối chiếu sáng tốt Phân loại kết thử ngưng kết kháng huyết thân (O) đa sau: Dương tính: ngưng kết hỗn dịch thử nghiệm khơng ngưng kết nước muối kiểm chứng Âm tính: không ngưng kết hỗn dịch thử nghiệm nước muối kiểm chứng Không đặc hiệu: ngưng kết hỗn dịch thử nghiệm mẫu kiểm chứng, cần thực phép thử huyết sinh hóa 8.5.6.2 Thử nghiệm kháng huyết đơn giá nhóm (O) Thực theo 8.5.6.1, sử dụng kháng huyết đơn giá nhóm (O), kể Vi (4.38) thay cho kháng huyết (O) đa giá Đối với việc xử lý cụ thể chủng cấy cho phản ứng ngưng kết Vi dương tính, xem AOAC 967.28B Các chủng cấy ngưng kết dương tính với kháng huyết thân (O) đơn giá báo cáo dương tính với nhóm (O) Các chủng cấy không ngưng kết với kháng huyết đơn giá báo cáo âm tính với nhóm (O) Xác định chủng cấy Salmonella với phản ứng Salmonella điển hình từ phép thử số đến 11, Bảng Nếu chủng cấy TSI từ 25 g mẫu thử xác định Salmonella không cần thử chủng cấy TSI khác từ mẫu thử Nếu chủng cấy chứng minh mang kháng nguyên Salmonella qua phép thử ngưng kết (H) Salmonella dương tính khơng có đặc tính sinh hóa Salmonella cần thử nghiệm lại Bảng - Tổng hợp phản ứng sinh hóa huyết Salmonella Dương tính Âm tính Các phản ứnga) Glucose (TSl) Chân thạch màu vàng Chân thạch màu đỏ + Lysin decarboxylase (LIA) Chân thạch màu đỏ tía Chân thạch màu vàng + Hydro sulfua (TSI LIA) Có màu đen Khơng có màu đen + Urease Màu đỏ tía Không đổi màu - Canh thang lysin decarboxylase Màu đỏ tía Màu vàng + Màu vàng và/hoặc sinh khí Khơng sinh khí; khơng đổi màu +b Vi sinh vật phát triển Vi sinh vật không phát triển - Màu xanh lam bề mặt Không đổi màu -c Màu đỏ đậm bề mặt Màu vàng bề mặt - 10 Phép thử ngưng kết đa giá Ngưng kết Không ngưng kết + 11 Phép thử tế bào đa giá Ngưng kết Không ngưng kết + 12 Canh thang phenol đỏ lactose Màu vàng và/hoặc sinh khí Khơng sinh khí; khơng đổi màu -c 13 Canh thang phenol đỏ sacarose Màu vàng và/hoặc sinh khí Khơng sinh khí; khơng đổi màu - Màu hồng đến đỏ không đổi màu - Màu đỏ phai Màu vàng phai + Vi sinh vật phát triển; màu xanh lam Vi sinh vật không phát triển; không đổi màu v Phép thử chất Canh thang phenol đỏ dulcitol Canh thang KCN Canh thang malonat Phép thử indol 14 Phép thử VogesProskauer 15 Phép thử metyl đỏ 16 Thạch xitrat Simmons a) (+) ≥ 90 % dương tính ngày ngày; (-) ≥ 90 % âm tính ngày ngày; (v) thay đổi b) Phần lớn chủng cấy S arizonae âm tính c) Phần lớn chủng cấy S arizonae dương tính 8.6 Thử nghiệm khuẩn lạc Salmonella khơng điển hình Thực phép thử sinh hóa bổ sung sau chủng cấy không cho phản ứng Salmonella điển hình phép thử số đến 11 Bảng 2, không phân loại Salmonella (xem Bảng 3) a) Canh thang phenol đỏ lactose canh thang đỏ tía lactose 1) Cấy vào canh thang phenol đỏ lactose (4.20) canh thang đỏ tía lactose (4.21) lượng nhỏ vi khuẩn phát triển mặt nghiêng thạch TSI từ 14 h đến 48 h Ủ 48 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10), kiểm tra sau 24 h Dương tính: sinh axit (màu vàng) sinh khí ống Durham Nếu sinh axit coi phản ứng dương tính Hầu hết chủng cấy Salmonella cho kết âm tính, thị việc khơng sinh khí ống Durham đổi màu môi trường thành màu đỏ (chất thị phenol đỏ) màu đỏ tía (chất thị bromcresol đỏ tía) 2) Loại bỏ chủng cấy Salmonella (dương tính với phép thử lactose), ngoại trừ chủng cấy sinh axit mặt nghiêng TSI có phản ứng dương tính LIA chủng cấy cho phản ứng dương tính với canh thang malonat Thực phép thử chủng cấy để xác định có phải S arizonae b) Canh thang phenol đỏ sacarose (4.20) canh thang đỏ tía sacarose (4.21) Thực quy trình mơ tả Loại bỏ chủng cấy Salmonella (dương tính với sacarose), trừ chủng sinh axit bề mặt nghiêng TSI cho phản ứng dương tính LIA c) Canh thang MR-VP Cấy vào mơi trường MR-VP (4.12) lượng nhỏ vi sinh vật phát triển mặt nghiêng TSI chưa xác định, nghi ngờ có Salmonella Ủ 48 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) 1) Thực phép thử Voges-Proskauer (VP) nhiệt độ phòng sau: Chuyển ml chủng cấy 48 h vào ống nghiệm ủ phần lại canh thang MR-VP thêm 48 h 35 °C Thêm 0,6 ml naphthol (4.27) lắc Tiếp tục thêm 0,2 ml dung dịch kali hydroxit 40 % (4.29) lắc Để tăng nồng độ tăng tốc độ phản ứng, thêm vài tinh thể creatin (4.28) Đọc kết sau h; Nếu môi trường chuyển màu đỏ hồng ruby phản ứng dương tính Hầu hết chủng cấy Salmonella âm tính VP (môi trường không chuyển màu) 2) Thực phép thử metyl đỏ sau: cho ml canh thang 96 h MR-VP, thêm đến giọt chất thị metyl đỏ (4.31) Đọc kết Hầu hết chủng cấy Salmonella cho kết dương tính, cho thấy màu đỏ phai môi trường Phản ứng âm tính có màu vàng đặc trưng Loại bỏ chủng cấy khơng phải Salmonella (có phản ứng KCN VP dương tính phản ứng metyl đỏ âm tính) Bảng - Các tiêu chí để loại bỏ chủng cấy Salmonella Phép thử chất Urease Kết dương tính (màu đỏ tía) Phép thử indol phép thử ngưng kết (H) đa giá phép thử ngưng kết Spicer-Edwards dương tính (màu tím bề mặt) âm tính (khơng ngưng kết) Canh thang lysin decarboxylase KCN âm tính (màu vàng) dương tính (vi sinh vật phát triển) Canh thang phenol đỏ lactose Canh thang phenol đỏ sacarose Canh thang KCN, phép thử Voges-Proskauer, phép thử metyl đỏ dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí) a,b dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí)b dương tính (Vi sinh vật phát triển) dương tính (màu hồng đến đỏ) âm tính (màu vàng phai) a Thử tiếp chủng cấy dương tính với canh thang malonat để xác định có phải Salmonella arizonae b Không bỏ chủng cấy canh thang dương tính chủng cấy LIA tương ứng cho phản ứng Salmonella điển hình; thử tiếp để xác định có phải lồi Salmonella d) Thạch xitrat Simmons Ria cấy mặt nghiêng cấy đâm sâu vào thạch xitrat Simmons (4.13) vi khuẩn phát triển mặt nghiêng thạch TSI chưa xác định Ủ 96 h ± h 35 °C tủ ấm (5.10) Đọc kết sau: Dương tính: có vi sinh vật phát triển, thường kèm theo thay đổi từ màu xanh sang màu xanh lam Hầu hết chủng cấy Salmonella dương tính xitrat Âm tính: khơng có vi sinh vật phát triển có vi sinh vật phát triển không đổi màu 8.7 Phương pháp thay xác định Salmonella Phương pháp thay cho cách thử phản ứng sinh hóa thơng thường, dùng năm kit sinh hóa thương mại (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID Vitek GNI) để nhận diện Salmonella giả định Lựa chọn kit thương mại phù hợp với tính chất sinh hóa phần nhận diện Các kit sinh hóa thương mại khơng sử dụng để thay phép thử huyết Lắp ráp phận thiết bị chuẩn bị thuốc thử cần cho kít Cấy đơn vị theo AOAC 978.24 (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II), AOAC 989.12 (MICRO-ID), AOAC 991.13 (Vitek GNI), ủ thời gian nhiệt độ quy định Bổ sung thuốc thử, quan sát ghi kết Đối với việc nhận diện vi sinh vật giả định, phân loại chủng cấy, thực theo AOAC Salmonella Salmonella Đối với việc khẳng định chủng cấy giả định nhận diện Salmonella, thực phép thử ngưng kết kháng huyết thân (O) Salmonella (8.5.6) phép thử ngưng kết kháng huyết lông (H) Salmonella (8.5.3) phép thử ngưng kết (H) Spicer-Edwards (8.5.4) để phân loại chủng cấy theo hướng dẫn sau: a) Báo cáo chủng cấy Salmonella khẳng định từ Salmonella giả định kit sinh hóa thương mại chủng cấy dương tính với phép thử ngưng kết kháng huyết (O) Salmonella phép thử (H) Salmonella b) Loại bỏ chủng cấy giả định Salmonella kit sinh hóa thương mại chủng cấy phù hợp với tiêu chí AOAC chủng cấy Salmonella c) Đối với chủng cấy không phù hợp với a b, phân loại theo phép thử bổ sung (8.6) gửi đến phòng thử nghiệm để xác định typ huyết nhận diện 8.8 Xử lý chủng cấy âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết lông (H) Nếu chủng cấy có tính chất sinh hóa phù hợp với Salmonella cho kết ngưng kết với kháng huyết (H) âm tính (xem 8.5.3) chủng không di động kháng nguyên lông phát triển không trọn vẹn Tiến hành kiểm tra sau: Đổ mơi trường thử tính di động (4.18) vào đĩa Petri (5.16) Dùng que cấy lấy lượng nhỏ vi khuẩn phát triển mặt nghiêng thạch TSI cấy đâm sâu lên đĩa môi trường, cách cạnh đĩa khoảng 10 mm, sâu từ mm đến mm Khơng cấy chạm đến đáy đĩa vị trí khác Ủ 24 h 35 °C tủ ấm (5.10) Nếu thấy vi khuẩn di chuyển 40 mm lớn thử nghiệm lại sau: Chuyển vòng cấy vi khuẩn di chuyển xa vào canh thang trypticase đậu tương-tryptose (4.11) Lặp lại phép thử ngưng kết (H) đa giá phép thử huyết Spicer-Edwards Nếu chủng cấy không di động sau 24 h đầu ủ thêm 24 h 35 °C tủ ấm (5.10); Nếu khơng di động ủ tiếp ngày 25 °C Kết luận chủng cấy không di động phép thử cho kết âm tính Biểu thị kết Theo kết diễn giải (xem 8.6, 8.7 8.8), rõ có mặt hay khơng có mặt Salmonella 25 g phần mẫu thử 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy chọn cố ảnh hưởng đến kết quả; e) kết thử nghiệm thu Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị môi trường cấy thuốc thử A.1 Canh thang lactose A.1.1 Thành phần Chất chiết thịt bò 3g Pepton 5g Lactose 5g Nước cất lít A.1.2 Chuẩn bị Phân phối phần 225 ml vào bình nón 500 ml Sau hấp áp lực 121 °C 15 trước sử dụng, chỉnh vô trùng đến thể tích 225 ml pH cuối đạt 6,9 ± 0,2 A.2 Canh thang selenit cystin A.2.1 Môi trường A.2.1.1 Thành phần Tryptone polypepton 5g Lactose 4g Natri hydro selenit (NaHSeO3) 4g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) 10 g L-Cystin 0,01 g Nước cất lít A.2.1.2 Chuẩn bị Đun đến sơi để hịa tan Phân phối phần 10 ml vào ống nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng Đun 10 nước (flowing steam) Không hấp áp lực pH cuối đạt 7,0 ± 0,2 Không khử trùng môi trường Sử dụng ngày chuẩn bị A.2.2 Môi trường (North-Bartram điều chỉnh) A.2.2.1 Thành phần Polypepton 5g Lactose 4g Natri hydro selenit (NaHSeO3) 4g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) 5,5 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 4,5 g L-Cystin 0,01 g Nước cất lít A.2.2.2 Chuẩn bị Gia nhiệt có khuấy để hòa tan Phân phối phần 10 ml vào ống nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng Gia nhiệt 10 nước Không khử trùng môi trường Sử dụng ngày chuẩn bị A.3 Canh thang tetrathionat A.3.1 Thành phần Polypepton 5g Các muối mật 1g Canxi cacbonat 10 g Natri thiosulfat ngậm năm phân tử nước 30 g Nước cất lít A.3.2 Chuẩn bị Tạo huyền phù thành phần lít nước cất, trộn đun sơi (phần kết tủa khơng tan hồn tồn) Khơng hấp áp lực Để nguội đến 45 °C Bảo quản nhiệt độ từ °C đến °C pH cuối đạt 8,4 ± 0,2 A.4 Môi trường Rappaport-Vassiliadis A.4.1 Thành phần a) Canh thang Tryptone 5g Natri clorua (NaCI) 8g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,6 g Nước cất lít b) Dung dịch magie clorua: Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI 2·6H2O) Nước cất 400 g lít c) Dung dịch malachite green oxalat: Malachite green oxalat 0,4 g Nước cất 100 ml A.4.2 Chuẩn bị Để chuẩn bị mơi trường hồn chỉnh, gộp 1000 ml canh thang, 100 ml Dung dịch magie clorua 10 ml Dung dịch malachite green oxalat (tổng thể tích mơi trường hoàn chỉnh 1110 ml) Canh thang phải chuẩn bị ngày với thành phần cấu tạo nên mơi trường hồn chỉnh Dung dịch magie clorua bảo quản tối nhiệt độ phịng năm Để chuẩn bị dung dịch này, hòa tan hoàn toàn lượng MgCI2.6H20 từ vật chứa mở nắp dựa theo cơng thức, loại muối hút ẩm Dung dịch malachite green oxalat bảo quản chai tối màu nhiệt độ phòng đến tháng Phân phối thể tích 10 ml mơi trường hồn chỉnh vào ống nghiệm 16 mm x 150 mm Hấp áp lực 15 115 °C pH cuối đạt 5,5 ± 0,2 Bảo quản tủ lạnh dùng tháng Môi trường phải chuẩn bị từ thành phần riêng lẻ Không nên sử dụng môi trường khô bán sẵn Người sử dụng môi trường cần nhận thức rõ công thức nhiệt độ ủ môi trường khác với hướng dẫn tiêu chuẩn A.5 Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD) A.5.1 Thành phần Chất chiết nấm men 3g Sắt (III) amoni xitrat 0,8 g L-lysin 5g Natri thiosulfat 6,8 g Xylose 3,75 g Natri clorua (NaCI) 5g Lactose 7,5 g Thạch 15 g Sacarose 7,5 g Phenol đỏ 0,08 g Natri desoxycholat 2,5 g Nước cất lít A.5.2 Chuẩn bị Gia nhiệt có khuấy đến sơi mức độ trung bình Khơng để q nhiệt Rót vào đĩa mơi trường nguội đến 50 °C Để khô khoảng h, mở nắp Sau đậy nắp pH cuối 7,4 ± 0,2 Không bảo quản ngày A.6 Thạch Hektoen Enteric (HE) A.6.1 Thành phần Pepton 12 g Natri thiosulfat 5g Chất chiết nấm men 3g Sắt (III) amoni xitrat 1,5 g Muối mật Bromthymol xanh 9g 0,064 g Lactose 12 g Fuchsin axit 0,1 g Sacarose 12 g Thạch 13,5 g Salicin 2g Nước cất lít Natri clorua (NaCI) 5g A.6.2 Chuẩn bị Đun đến sôi, khuấy liên tục để hịa tan Để sơi khơng q Khơng để nhiệt Để nguội nồi cách thủy Rót phần 20 ml vào đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng Để khô khoảng 2h, mở nắp pH cuối 7,6 ± 0,2 Không bảo quản ngày A.7 Thạch bismuth sulfit (Wilson and Blair) A.7.1 Thành phần Polypepton (hoặc pepton) 10 g Chất chiết thịt bò 5g Dextrose 5g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) (dạng khan) 4g FeSO4 (dạng khan) Bismuth sulfit (chất thị) Brilliant green 0,3 g 8g 0,025 g Thạch 20 g Nước cất lít A.7.2 Chuẩn bị Trộn kỹ đun có khuấy Để sơi khoảng đến thu huyền phù đồng (nếu kết lắng khơng hịa tan) Để nguội đến nhiệt độ từ 45 °C đến 50 °C Tạo huyền phù phần kết lắng cách khuấy nhẹ rót phần 20 ml vào đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng Để đĩa khô khoảng min, có mở nắp, sau đậy đĩa pH cuối đạt 7,7 ± 0,2 Không hấp áp lực Chuẩn bị đĩa ngày trước cấy ria bảo quản tối Độ chọn lọc giảm 48 h Bảo quản đĩa nơi tối A.8 Thạch sắt ba đường (TSI) A.8.1 Môi trường Môi trường Polypepton 20 g Natri clorua (NaCI) 5g Lactose 10 g Sacarose 10 g Glucose 1g Fe(NH4)2(SO4)·6H2O 0,2 g Na2S2O3 0,2 g Phenol đỏ 0,025 g Thạch 13 g Nước cất lít Mơi trường Chất chiết thịt bị 3g Chất chiết nấm men 3g Pepton 15 g Proteose pepton 5g Glucose 1g Lactose 10 g Sacarose 10 g Sắt (II) sulfat (FeSO4) 0,2 g Natri clorua (NaCI) Na2S2O3 Phenol đỏ 5g 0,3 g 0,024 g Thạch 12 g Nước cất lít Hai mơi trường nói chung thay A.8.2 Chuẩn bị Tạo huyền phù thành phần Môi trường nước cất, trộn kỹ gia nhiệt, có khuấy Để sơi khoảng cho hịa tan thành phần Cho vào 1/3 ống 16 mm x 150 mm đậy nắp nút lại để trì điều kiện hiếu khí Hấp áp lực Mơi trường 15 118 °C Chuẩn bị Môi trường Môi trường 1, không hấp áp lực 15 121 °C Trước mơi trường đơng đặc, nghiêng ống để có bề mặt nghiêng từ cm đến cm độ sâu từ cm đến cm pH cuối đạt 7,3 ± 0,2 Môi trường 7,4 ± 0.2 Môi trường A.9 Thạch sắt lysin (Edwards and Fife) A.9.1 Thành phần Gelysate pepton 5g Chất chiết nấm men 3g Dextrose 1g L-Lysin hydroclorua 10 g Sắt (III) amoni xitrat 0,5 g Natri thiosulfat (dạng khan) 0,04 g Bromcresol tía 0,02 g Thạch 15 g Nước cất lít A.9.2 Chuẩn bị Gia nhiệt để hòa tan thành phần Phân phối phần ml vào ống nắp xoáy 13 mm x 100 mm Hấp áp lực 12 121 °C Để cho đơng đặc vị trí nghiêng để tạo thành đáy cm bề mặt nghiêng 2,5 cm pH cuối đạt 6,7 ± 0,2 A.10 Canh thang trypton (tryptophan), % A.10.1 Thành phần Tryptone trypticase 10 g Nước cất lít A.10.2 Chuẩn bị Phân phối phần ml vào ống nghiệm 16 mm x 125 mm 16 mm x 150 mm Hấp áp lực 15 121 °C pH cuối đạt 6,9 ± 0,2 A.11 Canh thang trypticase đậu tương-tryptose A.11.1 Thành phần Canh thang trypticase đậu tương (loại khô, bán sẵn) 15 g Canh thang tryptose (loại khô, bán sẵn) 13,5 g Chất chiết nấm men 3g Nước cất lít A.11.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần lít nước Đun nhẹ để hòa tan Phân phối phần ml vào ống nghiệm 16 mm x 150 mm Hấp áp lực 15 121 °C pH cuối đạt 7,2 ± 0,2 A.12 Canh thang MR-VP A.12.1 Môi trường A.12.1.1 Thành phần Bột nước đệm pepton 7g Glucose 5g Kali hydro phosphat (K2HPO4) 5g Nước cất lít A.12.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần 800 ml nước có đun nhẹ Lọc để nguội đến 20 °C pha lỗng đến lít Hấp áp lực từ 12 đến 15 121 °C pH cuối đạt 6,9 ± 0,2 A.12.2 Môi trường A.12.2.1 Thành phần Pepton casein 3,5 g Pepton thịt 3,5 g Dextrose 5g Kali phosphat 5g Nước cất lít A.12.2.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần nước có đun nhẹ cần Phân phối 10 ml vào ống nghiệm 16 mm x 150 mm hấp áp lực 15 nhiệt độ từ 118 °C đến 121 °C pH cuối đạt 6,9 ± 0,2 A.12.3 Môi trường A.12.3.1 Thành phần Pepton 5g Glucose 5g Đệm phosphat 5g Nước cất lít A.12.3.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước Phân phối 10 ml vào ống nghiệm 16 mm x 150 mm hấp áp lực 12 đến 15 121 °C pH cuối đạt 7,5 ± 0,2 A.13 Thạch xitrat Simmons A.13.1 Thành phần Natri xitrat ngậm hai phân tử nước 2g Natri clorua (NaCI) 5g Kali hydro phosphat (K2HPO4) 1g Amoni dihydro phosphat (NH4H2PO4) 1g Magie sulfat (MgSO4) 0,2 g Bromthymol xanh 0,08 g Thạch 15 g Nước cất lít A.13.2 Chuẩn bị Đun nhẹ, khuấy Để sôi từ đến đến thạch hòa tan Cho vào ống nắp xoáy 13 mm x 100 mm 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống Hấp áp lực 15 121 °C Trước môi trường đông đặc, nghiêng ống để có bề mặt nghiêng từ cm đến cm độ sâu từ cm đến cm pH cuối đạt 6,8 ± 0,2 A.14 Canh thang ure A.14.1 Thành phần Ure 20 g Chất chiết nấm men 0,1 g Kali hydro phosphat (K2HPO4) 9,1 g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) 9,5 g Phenol đỏ 0,01 g Nước cất lít A.14.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần nước cất Khơng gia nhiệt Khử trùng cách lọc qua màng 0,45 µm Phân phối vô trùng phần từ 1,5 ml đến 3,0 ml vào ống nghiệm 13 mm x 100 mm vô trùng pH cuối đạt 6,8 ± 0,2 A.15 Canh thang ure (chuẩn bị nhanh) A.15.1 Thành phần Ure 20 g Chất chiết nấm men 0,1 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 0,091 g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) 0,095 g Phenol đỏ 0,01 g Nước cất lít A.15.2 Chuẩn bị Chuẩn bị Canh thang ure (A.14) A.16 Canh thang malonat A.16.1 Thành phần Chất chiết nấm men 1g Amoni sulfat [(NH4)2SO4] 2g Kali hydro phosphat (K2HPO4) 0,6 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 0,4 g Natri clorua (NaCI) 2g Natri malonat 3g Dextrose 0,25 g Bromthymol xanh 0,025 g Nước cất lít A.16.2 Chuẩn bị Đun để hòa tan, cần Phân phối phần ml vào ống nghiệm 13 mm x 100 mm Hấp áp lực 15 121 °C pH cuối đạt 6,7 ± 0,2 A.17 Canh thang lysin decarboxylase (Falkow) A.17.1 Thành phần Gelysate pepton 5g Chất chiết nấm men 3g Glucose 1g L-Lysin 5g Bromcresol tía Nước cất 0,02 g lít A.17.2 Chuẩn bị Đun đến hòa tan Phân phối phần ml ống nắp vặn 16 mm x 125 mm Hấp áp lực ống vặn lỏng nắp 15 121 °C Vặn nắp kín bảo quản sau lần cấy pH cuối đạt 6,8 ± 0,2 A.18 Mơi trường thử nghiệm tính di động (bán đặc) A.18.1 Thành phần Chất chiết thịt bò 3g Pepton gelysate 10 g Natri clorua (NaCI) 5g Thạch 4g Nước cất lít A.18.2 Chuẩn bị Gia nhiệt đồng thời khuấy đun sơi 1-2 để hịa tan thạch Phân phối phần 20 ml vào ống nắp xoáy 20 mm x 150 mm, thay nắp lỏng Hấp áp lực 15 121 °C Để nguội đến 45 °C sau hấp áp lực Vặn chặt nắp bảo quản lạnh nhiệt độ từ °C đến 8°C Để sử dụng, làm tan chảy nước sơi dịng nước để nguội đến 45 °C Phân phối vô trùng phần 20 ml vào đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng Đậy đĩa đông đặc Sử dụng ngày chuẩn bị pH cuối đạt 7,4 ± 0,2 A.19 Canh thang kali xyanua (KCN) A.19.1 Thành phần Kali xyanua 0,075 g Proteose pepton No polypepton 3g Natri clorua (NaCI) 5g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 0,225 g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) 5,64 g Nước cất lít A.19.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần trên, ngoại trừ kali xyanua hấp áp lực 15 121 °C Để nguội làm lạnh đến nhiệt độ từ °C đến °C pH cuối đạt 7,6 ± 0,2 Chuẩn bị dung dịch gốc kali xyanua cách hòa tan 0,5 g kali xyanua 100 ml nước cất vô trùng làm lạnh đến nhiệt độ từ °C đến °C Dùng pipet bầu, thêm 15 ml dung dịch gốc kali xyanua vào lít base lạnh vơ trùng Khơng hút pipet miệng Sử dụng găng tay Trộn phân phối vô trùng phần từ 1,0 ml đến 1,5 ml vào ống 13 mm x 100 mm vô trùng Dùng kỹ thuật vô trùng, nút ống nút bần No có tẩm parafin Chuẩn bị nút bần cách đun sôi parafin khoảng Nút ống nút bần cho parafin không chảy vào canh thang mà tạo thành lớp xi miệng ống nút bần Bảo quản ống nhiệt độ từ °C đến °C không tuần trước sử dụng A.20 Canh thang cacbohydrat phenol đỏ A.20.1 Thành phần Trypticase proteose pepton No 10 g Natri clorua (NaCI) 5g Chất chiết thịt bò (tùy chọn) 1g Phenol đỏ (7,2 ml dung dịch phenol đỏ 0,25 %) Nước cất 0,018 g lít Cacbohydrat, sử dụng ba loại đường sau: Dulcitol 5g Lactose 10 g Sacarose 10 g A.20.2 Chuẩn bị Hòa tan cacbohydrat vào canh thang Phân phối phần 2,5 ml vào ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa ống Durham Hấp áp lực 10 118 °C pH cuối đạt 7,4 ± 0,2 Cách khác, hòa tan thành phần, ngoại trừ cacbohydrat, 800 ml nước cất có đun khuấy Phân phối phần 2,0 ml vào ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa ống lên men úp ngược Hấp áp lực 15 118 °C để nguội Hòa tan cacbohydrat 200 ml nước cất khử trùng cách cho dung dịch qua lọc vi khuẩn Thêm vô trùng 0,5 ml dịch lọc vào ống canh thang khử trùng sau làm nguội đến 45 °C Lắc nhẹ để trộn pH cuối đạt 7,4 ± 0,2 A.21 Canh thang cacbohydrat đỏ tía A.21.1 Thành phần Proteose pepton No 10 g Chất chiết thịt bị (tùy chọn) 1g Natri clorua (NaCI) 5g Bromcresol tía Nước cất 0,02 g lít A.21.2 Chuẩn bị Chuẩn bị canh thang phenol đỏ cacbohydrat (A.20) pH cuối đạt 6,8 ± 0,2 A.22 Thạch MacConkey A.22.1 Thành phần Proteose pepton polypepton 3g Pepton gelysate 17 g Lactose 10 g Các muối mật No (hoặc hỗn hợp muối mật): 1,5 g Natri clorua (NaCI) 5g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,001 g Thạch 13,5 g Nước cất lít A.22.2 Chuẩn bị Tạo huyền phù thành phần đun có khuấy để hịa tan Để sơi từ đến Hấp áp lực 15 121 °C, để nguội đến nhiệt độ từ 45°C đến 50 °C, rót phần 20 ml vào đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng Để khơ nhiệt độ phịng, có đậy nắp Khơng dùng đĩa ẩm pH cuối đạt 7,1 ± 0,2 A.23 Canh thang thạch dịch tim não (BHI) A.23.1 Môi trường A.23.1.1 Thành phần Dịch não bê 200 g Dịch tim bò 250 g Proteose pepton gelysate 10 g Natri clorua (NaCI) 5g Na2HPO4·12H2O 2,5 g Dextrose 2g Nước cất lít A.23.1.2 Chuẩn bị Hịa tan thành phần nước cất, có đun nhẹ Phân phối canh thang vào chai ống nghiệm để bảo Hấp áp lực 15 121 °C pH cuối đạt 7,4 ± 0,2 A.23.2 Môi trường A.23.2.1 Thành phần Bột tim não 6g Pepton thịt 6g Natri clorua (NaCI) 5g Dextrose 3g Pepton gelatin 14,5 g Natri hydro phosphat (Na2HPO4) 2,5 g Nước cất lít A.23.2.2 Chuẩn bị Tạo huyền phù thành phần Môi trường nước cất đun để hịa tan hồn tồn Đối với Môi trường Môi trường 2, phân phối canh thang vào hai ống nghiệm để bảo quản Hấp áp lực 15 121 °C pH cuối đạt 7,4 ± 0,2 Có thể dùng BHI có bán sẵn Để chuẩn bị thạch tim não, thêm 15 g thạch vào lít canh thang BHI Đun để hòa tan thạch trước phân phối vào chai bình nón Hấp áp lực 15 121 °C A.24 Thạch máu tryptose A.24.1 Thành phần Tryptose 10 g Chất chiết thịt bò 3g Natri clorua (NaCI) 5g Thạch 15 g Nước cất lít A.24.2 Chuẩn bị Tạo huyền phù thành phần nước cất, trộn kỹ gia nhiệt, khuấy Để sôi khoảng Cho vào ống 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống đậy nắp vặn nút để trì điều kiện hiếu khí Hấp áp lực 15 121 °C Trước mơi trường đơng đặc, nghiêng ống để có bề mặt nghiêng từ cm đến cm độ sâu từ cm đến cm A.25 Dung dịch papain, % (khối lượng/thể tích) A.25.1 Thành phần Papain 50 g Nước cất lít A.25.2 Chuẩn bị Thêm papain vào nước cất vô trùng xoay bình để hịa tan hồn tồn Phân phối phần 100 ml vào chai A.26 Thuốc thử Kovacs A.26.1 Thành phần p-Dimethylaminobenzaldehyde 5g 2-Metylbutan-2-ol (amyl alcohol) 75 ml Axit clohydric (HCI) đặc 25 ml A.26.2 Chuẩn bị Hòa tan p-dimethylaminobenzaldehyde amyl alcohol Thêm từ từ axit clohydric (HCI) đặc Bảo quản °C Để thử indol, thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử chuẩn bị vào ml chủng cấy vi khuẩn canh thang trypton 24 h Phản ứng dương tính indol có màu đỏ sẫm lớp bề mặt A.27 Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP) A.27.1 Thành phần Dung dịch 1: alpha-Naphthol Etanol (tuyệt đối) 5g 100 ml Dung dịch 2: Kali hydroxit Nước cất đến 40 g 100 ml A.27.2 Chuẩn bị Phép thử Voges-Proskauer (VP) Ở nhiệt độ phòng, chuyển ml chủng cấy 48 h vào ống nghiệm thêm 0,6 ml dung dịch 0,2 ml dung dịch Lắc sau thêm dung dịch Để tăng cường độ tốc độ phản ứng, thêm vài tinh thể creatin vào hỗn hợp Đọc kết h sau thêm thuốc thử Phản ứng dương tính xuất màu hồng eosin A.28 Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng/thể tích) Kali hydroxit (KOH) Nước cất vừa đủ A.29 Nước muối vô trùng, 0,85 % A.29.1 Thành phần 40 g 100 ml Natri clorua (NaCl) 8,5 g Nước cất lít A.29.2 Chuẩn bị Hòa tan 8,5 g natri clorua nước Hấp áp lực 15 121 °C Để nguội đến nhiệt độ phòng A.30 Nước muối formalin A.30.1 Thành phần Dung dịch formaldehyde (từ 36 % đến 38 %) ml Natri clorua (NaCI) 8,5 g Nước cất lít A.30.2 Chuẩn bị Hòa tan 8,5 g natri clorua lít nước cất Hấp áp lực 15 121 °C Để nguội đến nhiệt độ phòng Thêm ml dung dịch formaldehyde Không hấp áp lực sau thêm formaldehyde A.31 Chất thị metyl đỏ A.31.1 Thành phần Metyl đỏ 0,1 g Etanol (95 %) 300 ml Nước cất 500 ml THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát Salmonella đĩa thạch [2] TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật [3] TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Hướng dẫn chuẩn bị sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy phòng thử nghiệm [4] FDA, Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5, Salmonella