THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - YÊU CẦU CHUNG VÀ ĐỊNH NGHĨA

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7608 : 2007 THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - YÊU CẦU CHUNG VÀ ĐỊNH NGHĨA Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements and definitions Lời nói đầu TCVN 7608:2007 hồn tồn tương đương với ISO 24276:2007; TCVN 7608:2007 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Mục đích việc phân tích để nhận dạng định lượng gel protein thông thường từ sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen loại chất Mục tiêu tiêu chuẩn phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) dựa phương pháp luận Tuy nhiên, tốc độ phát triển công nghệ lĩnh vực nhanh, tương lai xem xét đến công nghệ khác Việc nghiên cứu thành phần gốc biến đổi gen thực phương pháp với bước liên tục (hoặc đồng thời) Sau thu thập mẫu, axit nucleic protein chiết khỏi phần mẫu thử Các mẫu phân tích chiết phải làm tiếp, đồng thời với việc chiết sau chiết Sau định lượng (nếu cần), pha lỗng (nếu cần) phân tích, PCR hấp phụ lực liên kết enzym (ELISA) Các bước mô tả chi tiết tiêu chuẩn tài liệu sau: ISO 21568, Foodstuffs - Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling (Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Lấy mẫu) TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa định tính axit nucleic ISO 21570:2005, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods (Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa định tính axit nucleic TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách chiết axit nucleic TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa protein Thông tin cụ thể liên quan đến phương pháp phát protein nêu TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - YÊU CẦU CHUNG VÀ ĐỊNH NGHĨA Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements and definitions Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định cách sử dụng tiêu chuẩn phương thức lấy mẫu ISO 21568, tách chiết axit nucleic TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005), phân tích định tính axit nucleic TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), phân tích định lượng axit nucleic ISO 21570 phương pháp dựa vào protein TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) giải thích mối quan hệ tiêu chuẩn phân tích sinh vật biến đổi gen thực phẩm Tiêu chuẩn bao gồm định nghĩa, yêu cầu hướng dẫn chung để thiết lập phịng thử nghiệm, u cầu tính hợp lệ phương pháp, mô tả phương pháp báo cáo thử nghiệm Tiêu chuẩn xây dựng để áp dụng cho loại chất thực phẩm, tiêu chuẩn áp dụng cho loại chất khác (ví dụ: loại hạt, thức ăn chăn nuôi mẫu thực vật từ môi trường) 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) liên quan đến đánh giá hiệu lực, có [1] thuật ngữ sau đây: 3.1 Các thuật ngữ chung 3.1.1 taxon đích (target taxon) taxon mà sinh vật biến đổi gen thuộc loại CHÚ THÍCH Trong tiêu chuẩn taxon thường có nghĩa lồi có cấp phân loại thấp cao 3.1.2 mẫu phòng thử nghiệm (laboratory sample) mẫu dùng để kiểm tra thử nghiệm phòng thử nghiệm [ISO 7002:1986] 3.1.3 mẫu thử (test sample) phần mẫu thử, mẫu chuẩn bị để thử nghiệm phân tích, tồn lượng mẫu dùng để tách chiết chất cần phân tích vào thời điểm 3.1.4 tính đặc trưng (specificity) đặc tính phương pháp phản ánh đặc điểm hay chất cần phân tích 3.1.5 độ nhạy (sensitivity) thay đổi kết thay đổi tương ứng nồng độ đồ thị chuẩn CHÚ THÍCH Đây độ dốc đồ thị phân tích chuẩn 3.1.6 giới hạn phát (LOD) (limit of detection) (LOD) lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu chất phân tích mẫu thử phát không cần thiết phải định lượng, chứng minh thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác CHÚ THÍCH Xem [2] thử nghiệm cộng tác xem [3] việc xác nhận hiệu lực 3.1.7 giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantitation) (LOQ) (Qui trình phân tích) nồng độ nhỏ hay lượng chất phân tích nhỏ mẫu thử mà định lượng với mức chấp nhận độ chụm độ xác, chứng minh thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác CHÚ THÍCH Xem [2] thử nghiệm cộng tác xem [3] việc xác nhận hiệu lực 3.1.8 độ xác (accuracy) mức độ gần kết thử nghiệm giá trị quy chiếu chấp nhận 3.1.9 độ (trueness) mức độ gần giá trị trung bình dãy lớn kết thử nghiệm giá trị quy chiếu chấp nhận CHÚ THÍCH Thước đo độ thường thể độ chệch Độ coi “độ xác giá trị trung bình” 3.1.10 độ chụm (precision) mức độ gần kết thử nghiệm độc lập nhận điều kiện quy định CHÚ THÍCH Độ chụm phụ thuộc vào phân bố sai số ngẫu nhiên không liên quan tới giá trị thực giá trị xác định CHÚ THÍCH Thước đo độ chụm thường thể độ phân tán tính tốn độ lệch chuẩn kết thử nghiệm Độ chụm thấp độ lệch chuẩn lớn CHÚ THÍCH “Các kết thử nghiệm độc lập” có nghĩa kết nhận theo cách không bị ảnh hưởng kết trước đối tượng thử tương tự Thước đo định lượng độ chụm phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện quy định Điều kiện lặp lại điều kiện tái lập tập hợp cụ thể điều kiện bắt buộc 3.1.11 độ lặp lại (repeatability) độ chụm điều kiện lặp lại 3.1.12 độ tái lập (reproducibility) độ chụm điều kiện tái lập 3.1.13 điều kiện lặp lại (repeatability conditions) điều kiện mà kết thử nghiệm độc lập nhận với phương pháp, mẫu thử giống hệt nhau, phịng thí nghiệm, người thao tác, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn 3.1.14 điều kiện tái lập (reproducibility conditions) điều kiện mà kết thử nghiệm nhận phương pháp, mẫu thử giống hệt phịng thí nghiệm khác nhau, với người thao tác khác nhau, sử dụng thiết bị khác CHÚ THÍCH Khi phương pháp khác cho kết khác không đáng kể phương pháp khác cho phép cách thiết kế thực nghiệm (như nghiên cứu thành thạo nghiên cứu chứng nhận sản phẩm để thiết lập giá trị thỏa thuận vật hiệu chuẩn) thuật ngữ “tái lập” áp dụng tham số kết Các điều kiện phải nêu rõ 3.1.15 độ lệch chuẩn lặp lại (repeatability standard deviation) độ lệch chuẩn kết thử nghiệm nhận điều kiện lặp lại CHÚ THÍCH Đây thước đo phân tán phân bố kết thử nghiệm điều kiện lặp lại Tương tự, “phương sai lặp lại” “hệ số biến thiên lặp lại” xác định sử dụng làm phép đo phân tán kết thử nghiệm điều kiện lặp lại 3.1.16 độ lệch chuẩn tái lập (reproducibility standard deviation) độ lệch chuẩn kết thử nghiệm nhận điều kiện tái lập CHÚ THÍCH Đây thước đo phân tán phân bố kết thử nghiệm điều kiện tái lập Tương tự, “phương sai tái lập” “hệ số biến thiên tái lập” xác định sử dụng phép đo phân tán kết thử nghiệm điều kiện tái lập 3.1.17 giới hạn lặp lại (repeatability limit) giá trị mà độ lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm nhận điều kiện lặp lại nhỏ giá trị với xác suất 95% CHÚ THÍCH Ký hiệu sử dụng r CHÚ THÍCH Khi xét hai kết thử nghiệm đơn lẻ thu điều kiện lặp lại, phép so sánh thực với giới hạn lặp lại r = 2,8 s r 3.1.18 giới hạn tái lập (reproducibility limit) giá trị mà độ lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm nhận điều kiện tái lập nhỏ giá trị với xác suất 95% CHÚ THÍCH Ký hiệu sử dụng R CHÚ THÍCH Khi xét hai kết thử ghiệm đơn lẻ thu điều kiện tái lập, phép so sánh thực với giới hạn tái lập R = 2,8 s R 3.1.19 thử nghiệm cộng tác, nghiên cứu liên phòng thử nghiệm (collaborative trial, interlaboratory study) nghiên cứu mà vài phịng thử nghiệm phát và/hoặc xác định chất phân tích nhiều phần “giống hệt nhau” mẫu thử đồng nhất, ổn định điều kiện ghi lại tài liệu CHÚ THÍCH Các hướng dẫn thực thử nghiệm cộng tác giải thích chi tiết TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) nghị định thư iso/AOAC/IUPAC [6] 3.1.20 độ phù hợp mục đích (fitness for purpose) khả áp dụng (applicability) phạm vi áp dụng phương pháp mà xác nhận chất nền, chất phân tích lồi cần đo, dải nồng độ kiểu loại nghiên cứu/kiểm tra qui trình đánh giá phù hợp CHÚ THÍCH Cũng mơ tả hạn chế biết phương pháp [3] 3.1.21 tính khả thi (practicability) dễ dàng thao tác, lượng mẫu đưa vào chi phí phân tích để đạt tiêu chuẩn thực theo yêu cầu đạt mục đích quy định 3.1.22 khoảng áp dụng (applicability range) dải định lượng/độ tuyến tính/dải biến động (range of quantitation/linearity/dynamic range) khoảng số lượng qui trình phân tích chứng minh thử nghiệm cộng tác hay phê chuẩn phù hợp khác để có mức thích hợp độ chụm độ xác CHÚ THÍCH Xem [2] thử nghiệm cộng tác [3] xác nhận hiệu lực 3.1.23 độ không đảm bảo đo (measurement uncertainty) thông số gắn với kết phép đo, đặc trưng cho phân tán giá trị mà thuộc tính chất phân tích 3.1.24 phương pháp sàng lọc (screening method) phương pháp loại trừ (sàng lọc) nhanh đáng tin cậy, lượng lớn mẫu thử dươung tính (hoặc âm tính) hạn chế số mẫu thử nghiệm cần áp dụng phương pháp nghiêm ngặt CHÚ THÍCH Xem [4] CHÚ THÍCH Trong tiêu chuẩn này, phương pháp sàng lọc phương pháp phát sản phẩm gen (chẳng hạn protein) và/hoặc yếu tố di truyền thông thường số sinh vật biến đổi gen (chẳng hạn gen khởi động, gen kết thúc số yếu tố di truyền quan tâm khác) 3.1.25 phương pháp xác định cấu trúc đặc thù (construct-specific method) phương pháp phát tổ hợp trình tự ADN đưa vào mà tìm thấy dịng có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen 3.1.26 phương pháp phân tích dịng đặc hiệu (event-specific method) phương pháp phát trình tự đặc trưng vốn có dịng CHÚ THÍCH Trường hợp thường phát vùng biên tiếp giáp 3.2 Thuật ngữ liên quan đến tách chiết tinh ADN 3.2.1 tách chiết ADN (DNA extraction) việc tách ADN khỏi thành phần khác mẫu thử 3.2.2 tinh ADN (DNA purification) phương pháp tạo ADN CHÚ THÍCH Trong trường hợp này, độ giảm bớt ảnh hưởng quan sát thấy đo chất ức chế phản ứng PCR 3.2.3 ADN có chất lượng cho phản ứng PCR (PCR quality DNA) ADN làm khn có độ dài phù hợp, mặt hóa học nguyên vẹn cấu trúc nhân lên PCR 3.3 Thuật ngữ liên quan đến khuyếch đại ADN VÀ PCR 3.3.1 nhận dạng trình tự axit nucleic (identification of nucleic acid sequences) nhận dạng trình tự axit nucleic phép so sánh với đoạn axit nucleic chuẩn CHÚ THÍCH Ví dụ, lai tạo đặc hiệu với mẫu dò lai cụ thể, cắt enzym giới hạn tương ứng trình tự axit nucleic 3.3.2 vùng nối liền (junction region) trình tự ADN phủ hai phần tử trình tự kế tiếp, chẳng hạn gen khởi động vùng mã hóa gen 3.3.3 vùng tiếp giáp (integration-border region) vùng nối liền mà phần tử bắt nguồn từ sinh vật chủ, phần tử khác bắt nguồn từ ADN đưa vào trình biến nạp 3.3.4 trình tự đích đặc hiệu taxon [taxon-specific (endogenous) target sequence] trình tự biết đặc trưng cho taxon đích CHÚ THÍCH Đó có mặt taxon đích khơng có mặt taxon khác CHÚ THÍCH Có hai loại trình tự đích đặc hiệu taxon - số biến đổi trình tự đa sử dụng, ví dụ: để đánh giá có mặt axit nucleic từ taxon đích; - số thấp trình tự đơn sử dụng, ví dụ: chuỗi chuẩn để thiết lập mẫu đoạn tương đương hệ gen taxon đích phân tích định lượng 3.3.5 dịng chảy xi (forward flow) nguyên tắc xử lý nguyên liệu/mẫu áp dụng nhằm đảm bảo mẫu phòng thử nghiệm, mẫu thử phần mẫu thử nghiệm xử lý (bao gồm ADN khuyếch đại) phải tách biệt suốt trình tiến hành 3.4 Định nghĩa liên quan đến ADN PCR đối chứng CHÚ THÍCH Việc đối chứng áp dụng với phương pháp dựa vào protein TCVN 7607(ISO 21572) Các định nghĩa sau áp dụng phương pháp dựa vào ADN 3.4.1 ADN đích đối chứng dương (positive DNA target control) ADN chuẩn ADN tách chiết từ vật liệu chuẩn chứng nhận, đại diện mẫu dương tính biết trình tự hay sinh vật nghiên cứu CHÚ THÍCH Việc đối chứng sử dụng để chứng minh thuốc thử PCR hoạt động dự định 3.4.2 ADN đích đối chứng âm (negative DNA target control) ADN chuẩn ADN tách chiết từ vật liệu chuẩn chứng nhận hay mẫu âm tính biết khơng chứa trình tự nghiên cứu CHÚ THÍCH Việc đối chứng chứng minh kết phân tích mẫu thử khơng chứa trình tự đích âm tính 3.4.3 kiểm chứng chất ức chế PCR (PCR inhibition control) hỗn hợp phản ứng cho phép kiểm tra có mặt chất ức chế phản ứng PCR với mẫu cụ thể CHÚ THÍCH việc kiểm tra để xác định có mặt chất ức chế PCR hịa tan, cần thiết trường hợp khuyếch đại ADN âm tính trường hợp định lượng PCR CHÚ THÍCH Thơng thường, lượng ADN đích biết cho thêm vào phản ứng để kiểm tra Đây đích nguồn mẫu biết trước, chẳng hạn đích cải biên chất plasmid cạnh tranh 3.4.4 kiểm chứng thuốc thử phản ứng PCR (PCR reagent control) việc kiểm chứng bao gồm tất hóa chất dùng để khuyếch đại gen, ngoại trừ ADN khuôn mẫu thử tách chiết CHÚ THÍCH Việc kiểm chứng sử dụng để chứng minh thuốc thử không chứa axit nucleic Thay cho ADN làm khn, ví dụ, cho vào phản ứng lượng tương đương nước không chứa axit nucleic 3.4.5 kiểm chứng trắng qui trình tách chiết (extraction blank control) việc kiểm chứng thực tất bước qui trình tách chiết, bỏ qua mẫu thử CHÚ THÍCH Ví dụ, việc kiểm chứng dùng nước thay cho phần mẫu thử CHÚ THÍCH Việc kiểm chứng sử dụng để chứng minh khơng có nhiễm axit nucleic tách chiết 3.4.6 kiểm chứng dương tính qui trình tách chiết (positive extraction control) việc kiểm chứng dùng để chứng minh qui trình tách chiết ADN thực theo cách mà sử dụng để tách chiết ADN đích CHÚ THÍCH Ví dụ, dùng mẫu biết có chứa ADN đích 3.4.7 kiểm chứng mơi trường (environment control) việc kiểm chứng dùng để chứng minh khơng có nhiễm axit nucleic, ví dụ từ khơng khí phịng thử nghiệm CHÚ THÍCH Việc kiểm chứng dùng ống nghiệm có chứa lượng nước định không chứa axit nucleic để hở khơng khí suốt tồn q trình xử lý 3.5 Thuật ngữ liên quan đến mẫu chuẩn 3.5.1 mẫu chuẩn (reference meterial) vật liệu chất có hay nhiều giá trị tính chất xác định đủ đồng tốt để hiệu chuẩn thiết bị, đánh giá phương pháp đo để ấn định giá trị vật liệu [ISO Guide 30] 3.5.2 mẫu chuẩn chứng nhận (certified reference material) mẫu chuẩn có kèm theo giấy chứng nhận, hay nhiều giá trị tính chất chứng nhận theo thủ tục có hiệu lực, xác nhận giấy chứng nhận tài liệu khác quan chứng nhận cấp [ISO Guide 30] 3.6 Thuật ngữ liên quan đến định lượng CHÚ THÍCH Việc kiểm chứng áp dụng cho phương pháp dựa vào protein TCVN 7607 (ISO 21572) Các định nghĩa sau áp dụng cho phương pháp dựa vào ADN 3.6.1 trình tự ADN nội sinh (endogenous DNA sequence) trình tự ADN chuẩn xác định có nguồn gốc tự nhiên taxon tương ứng CHÚ THÍCH Trình tự ADN nội sinh dùng để xác định số lượng đương lượng hệ gen taxon đích trình tự có mặt số ổn định khơng có biến đổi alen số giống taxon đích 3.7 Thuật ngữ liên quan đến sinh vật biến đổi gen 3.7.1 hàm lượng sinh vật biến đổi gen (GMO content) việc nhận dạng định lượng sinh vật biến đổi gen vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen sản phẩm CHÚ THÍCH Thơng thường, hàm lượng sinh vật biến đổi gen ước tính phát chất cần phân tích (nhận dạng định lượng) Áp dụng tiêu chuẩn liên quan 4.1 Khái quát Các phương pháp bao gồm Phụ lục TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), ISO 21570, TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) đánh giá có hiệu lực thử nghiệm cơng tác [2], [8] đánh giá hiệu lực thích hợp khác [6] Các kết đánh giá hiệu lực đặc trưng thực mô tả phương pháp Các tiêu chuẩn bao gồm phương pháp cụ thể thích hợp để phát thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào phù hợp mục đích chi tiết cụ thể, người sử dụng tiêu chuẩn cần tham khảo phạm vi Phụ lục Trong phần giới hiệu có nêu tiêu chuẩn phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen Mối liên quan tiêu chuẩn nêu sơ đồ (Hình 1) CHÚ THÍCH ISO/TS 21098 đưa yêu cầu phương pháp nêu phụ lục TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), ISO 21570 TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) Hình - Sơ đồ mối quan hệ tiêu chuẩn 4.2 Hướng dẫn người sử dụng lựa chọn phương pháp 4.2.1 Khái quát Đặc trưng cho chất cần phân tích phương pháp phát thay đổi Vì điều quan trọng phải chọn phương pháp thích hợp có tính đặc trưng cho đối tượng Nên theo hướng dẫn đưa 4.2.2 4.2.3 4.2.2 Phương pháp sử dụng protein đích phân tích Protein phát cách ứng dụng kháng thể đặc thù Trong trường hợp này, kháng thể đặc thù thường tạo để phát protein Mức độ lực kháng thể protein phụ thuộc vào cấu hình protein sau tách chiết Tính đặc trưng kháng thể sử dụng cần chứng minh (ví dụ: khơng có khả phản ứng chéo) Việc phát sinh vật biến đổi gen qua phân tích dịng đặc hiệu định lượng protein khơng thể thực xác có nhiều sinh vật biến đổi gen có biểu protein Các phương pháp sàng lọc có lợi cho việc đánh giá sản phẩm có chứa hay khơng chứa vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen dựa có mặt protein biểu Các ví dụ phương pháp sàng lọc dạng mẫu que thử ELISA định tính Việc định lượng sinh vật biến đổi gen loại chất định thực phương pháp dựa vào protein, chẳng hạn phương pháp dùng ELISA Phương pháp phù hợp với chất cần phân tích chất chuẩn sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn để từ tính hàm lượng protein mẫu thử nghiệm 4.2.3 Phương pháp sử dụng ADN đích Đặc trưng phương pháp phân tích sử dụng ADN đích để xác định có mặt vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào tính chất cụ thể trình tự ADN đích Ứng dụng phân loại khác tính đặc hiệu sau: a) Phương pháp dựa vào taxon đích: Tìm thấy trình tự ADN taxon đích, thường lồi cấp phân loại nhỏ cao Các phương pháp dựa vào taxon đích dùng để đánh giá có mặt, chất lượng số lượng ADN có nguồn gốc từ taxon đơi sử dụng điểm chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen Tính đặc hiệu cần xây dựng số liệu thực nghiệm b) Phương pháp sàng lọc tìm thấy: trình tự ADN đích vài lồi khơng thiết tồn dịng biến nạp Các trình tự tìm thấy nguyên liệu không biến đổi gen, chẳng hạn có mặt virus vi khuẩn tự nhiên Các phương pháp sàng lọc giúp cho việc đánh giá có mặt hay khơng có mặt sản phẩm có chứa ngun liệu có nguồn gốc biến đổi gen Ví dụ, phương pháp sàng lọc định tính PCR để phát đoạn khởi động 35S-CaMV c) Phương pháp dựa vào cấu trúc đặc hiệu tìm thấy: trình tự ADN đích vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, tức có tổ hợp trình tự ADN nhờ kỹ thuật di truyền Việc phát cấu trúc gen đủ để nhận biết biến nạp mà ADN xuất phát từ đó, cấu trúc gen giống sử dụng nhiều dòng biến nạp Số cấu trúc gen hoàn chỉnh cấu trúc gen bị biến đổi hệ gen đơn bội khác dịng biến nạp d) Phương pháp dựa vào dịng đặc hiệu tìm thấy: trình tự ADN đích vật liệu có nguồn gốc từ dịng biến nạp, thơng thường trình tự ADN nằm vùng tiếp giáp ADN chèn vào hệ gen vật chủ (vùng giáp ranh) Số trình tự ADN dịng đặc hiệu ln hệ gen đơn bội biến đổi gen Phương pháp dòng đặc hiệu phù hợp cho việc nhận dạng dòng cụ thể sử dụng phương pháp PCR tức thời (realtime PCR) xác nhận hiệu lực, xác định hàm lượng ADN có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen cụ thể 4.3 Đặc trưng thực 4.3.1 Khái quát Đặc trưng thực mức phương pháp đưa phụ lục tiêu chuẩn có liên quan 4.3.2 Giới hạn phát (LOD) Các giá trị LOD phương pháp phân tích qui định Phụ lục TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), ISO 21570 TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) dựa số liệu từ việc đánh giá có hiệu lực thử nghiệm cộng tác và/hoặc khẳng định người xây dựng phương pháp đưa với mục đích thơng tin Các giá trị LOD báo cáo từ số liệu thử nghiệm cộng tác thường liên quan đến mức thấp chất cần phân tích quan sát có tỷ lệ âm tính giả nhỏ 5% với độ lệch chuẩn tương đối độ tái lập nhỏ 33% Tuy nhiên, vài mức cao thấp giá trị có độ lệch chuẩn tương đối tái lập lớn 33 %; chi tiết xem phụ lục tương ứng Đối với phương pháp định tính, LOD tương đương với mức độ thấp chất nền, độ lệch chuẩn tương đối độ tái lập nhỏ 33 % [2] LOD thực tế số lượng tương đối nhỏ ADN đích phát được, đưa số hệ gen taxon đích biết Để tính lượng phải dựa khối lượng phân tử hệ gen lồi tương ứng, kích thước hệ gen nêu [7] LOD thực tế liên quan đến phần mẫu tử, chất lượng/số lượng ADN khuôn mẫu LOD tuyệt đối phương pháp Đối với chất khơng có phương pháp phù hợp LOD liên quan có, phịng thử nghiệm phải ghi lại LOD thực tế dựa thực nghiệm nội nói rõ chưa có loại chất tham khảo LOD đánh giá loại chất cụ thể 4.3.3 Giới hạn định lượng (LOQ) Các giá trị LOQ phương pháp phân tích quy định phụ lục TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), ISO 217570 TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) dựa số liệu thử nghiệm cộng tác việc khẳng định người xây dựng phương pháp, đưa với mục đích thơng tin Giá trị LOQ ghi lại từ số liệu thử nghiệm cộng tác với mức thấp chất cần phân tích quan sát được, có độ lệch chuẩn tương đối độ tái lập nhỏ 25% Tuy nhiên, mức cao chất phân tích thấp giá trị có độ lệch chuẩn tương đối tái lập lớn 25%, chi tiết xem phụ lục tương ứng, [2] [6] LOQ thực tế số lượng tương đối nhỏ ADN đích mà định lượng được, cho biết số hệ gen taxon đích biết Để tính lượng phải dựa khối lượng phân tử hệ gen loài tương ứng, kích thước hệ gen nêu [7] LOQ thực tế liên quan đến phần mẫu thử, chất lượng/số lượng ADN làm khuôn LOQ tuyệt đối phương pháp Đối với chất khơng có phương pháp phù hợp LOQ liên quan có, phòng thử nghiệm phải ghi lại LOQ thực tế dựa thực nghiệm nội bộ, nêu rõ điều loại chất tham khảo LOQ đánh giá có hiệu lực loại chất cụ thể Yêu cầu chung phòng thử nghiệm cách tiến hành 5.1 Khái quát Qui trình bao gồm bước tiến hành sau đây: - thu mẫu đại diện; - đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm; - giảm mẫu phòng thử nghiệm mẫu thử; - chuẩn bị mẫu nghiền mẫu; - tách chiết chất phân tích; - thử nghiệm, diễn giải báo cáo kết Các hướng dẫn qui trình cụ thể có phụ lục TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), ISO 21570, TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) 5.2 Sử dụng phép kiểm chứng Các bước kiểm chứng sử dụng đưa Bảng Bảng áp dụng cho phương pháp dựa vào ADN Các bước kiểm chứng áp dụng cho phương pháp dựa vào protein mô tả TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) Bảng - Biểu đồ thể giao bước tiến hành bước kiểm chứng Bước kiểm chứng Đồng hóa Kiểm chứng mơi trườngb Kiểm chứng mẫu trắng tách chiếtc Kiểm chứng tách chiết dương tínhd Kiểm chứng ADN dương tính đíche Kiểm chứng ADN âm tính đíchf Ki t Khuyến cáo tách chiết axit nucleic ↓a một/dãy thử bắt buộc khoảng định kỳ Đánh giá chất lượng axit nucleic ↓ ↓ ↓ Khuyếch đại axit nucleic ↓ ↓ ↓ bắt buộc khuyến cáo Đánh giá kết khuyếch đại axit nucleic ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Diễn giải ↓ ↓ ↓ ↓ Báo thử nghiệm ↓ ↓ ↓ ↓ a Các mũi tên cho thấy việc kiểm chứng áp dụng bước phân tích b Sử dụng việc kiểm chứng mơi trường giúp cho phịng thử nghiệm nhận biết nguồn nhiễm bẩn giai đoạ sử dụng để nhận biết khu vực làm việc có nhiễm bẩn c Ít kiểm chứng tách chiết mẫu trắng phải thực cho lần tách chiết ADN từ hay nhiều mẫ cuối dãy Ví dụ, thích hợp đặt ống chiết mẫu trắng giá gồm ống vi đĩa 96 giếng động d Thường xuyên thực kiểm chứng tách chiết dương tính có mẻ thuốc thử chiết dùng Việc kiểm c sót thuốc thử sai sót q trình chiết e Kiểm chứng ADN dương tính đích để chứng minh khả qui trình khuyếch đại ADN axit nucleic để phá sinh vật biến đổi gen taxon đích Việc thực nhờ kiểm chứng tách chiết dương tính th f Kiểm chứng ADN âm tính đích để chứng minh khả qui trình khuyếch đại axit nucleic để tránh việc khuyếc có mặt axit nucleic sinh vật biến đổi gen taxon đích g Kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN để chứng minh khơng có nhiễm axit nucleic mẻ thuốc thử P thuốc thử khuyếch đại ADN bỏ qua kiểm chứng tách chiết mẫu trắng h Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR sử dụng để chứng minh khơng có mặt chất ức chế h chứng minh qua dãy dung dịch pha lỗng axit nucleic làm khn Tuy nhiên, số đánh giá ảnh hưởng chấ phân tích mẫu cần phải tiến hành l Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR bắt buộc, tất phép thử PCR mẫu thử âm tính đối v có ADN khuyếch đại 5.3 Tổ chức phòng thử nghiệm 5.3.1 Khái quát Tuân thủ yêu cầu quy định an toàn khuyến nghị an toàn nhà sản xuất cần tuân theo hướng dẫn đưa TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/IEC 17025:1999) 5.3.2 Thiết kế phòng thử nghiệm Sự nhiễm ADN cách ngẫu nhiên bắt nguồn từ bụi bẩn sol khí Chính vậy, việc tổ chức khu vực làm việc phòng thử nghiệm phải dựa vào: - phân khu cách hệ thống bước có liên quan đến việc tạo kết - theo ngun tắc “dịng chảy xi: việc xử lý mẫu Đối với phương pháp dựa vào ADN, thiết kế phòng thử nghiệm áp dụng sau: Tối thiểu có bốn khu làm việc tách biệt với trang thiết bị chuyên dùng cho phòng sau: a) khu vực nghiền đồng hóa mẫu; b) khu vực tách chiết axit nucleic từ vật liệu thử nghiệm; c) khu vực dành riêng cho thiết bị PCR/các phản ứng khuyếch đại ADN; d) khu vực dành cho trình tiếp theo, bao gồm phân tích đặc tính hóa trình tự ADN khuyếch đại, Nếu sử dụng kỹ thuật nghiền mẫu sinh hạt bụi công việc cần thực khu phụ Việc phân chia khu vực làm việc thông qua việc sử dụng phòng khác hiệu cách tốt đảm bảo khu vực làm việc riêng biệt, sử dụng phương pháp khác để tránh nhiễm bẩn miễn chúng có hiệu tương tự 5.3.3 Nhân viên Ở khu việc làm khác nhau, nhân viên mặc quần áo khoác khác ví dụ khu vực nghiền khu vực sau PCR Nhân viên phải mang găng tay dùng lần Nếu có thể, nên tránh dùng găng tay có phủ bột phấn làm việc với phản ứng trước PCR, bột phấn gây ứng chế phản ứng PCR gây nhiễm mà bột làm từ tinh bột ngơ Găng tay quần áo khốc phải thay đổi thường xuyên Tất bước tiến hành PCR thực điều kiện không gây nhiễm mức Tất nhân viên thực qui trình thử nghiệm cần đào tạo kỹ thuật thích hợp 5.3.4 Thiết bị, dụng cụ Phòng thử nghiệm cần sử dụng trang thiết bị bảo dưỡng cách hợp lý, phù hợp với phương pháp sử dụng Ngoài trang thiết bị phòng thử nghiệm chuẩn, trang thiết bị phụ mô tả phụ lục tiêu chuẩn cụ thể Dụng cụ thiết bị phải bảo dưỡng theo dẫn nhà sản xuất 5.3.5 Vật liệu thuốc thử Đối với việc phân tích, sử dụng loại thuốc thử phân tích phù hợp với sinh học phân tử, không chứa ADN ADNaza, trừ có qui định khác Các thuốc thử dung dịch bảo quản nhiệt độ phịng, trừ có quy định khác Thuốc thử PCR bảo quản với lượng nhỏ để giảm thiểu nguy nhiễm bẩn Nước sử dụng nước cất hai lần có chất lượng phù hợp Các dung dịch chuẩn bị cách hòa tan thuốc thử phù hợp nước hấp áp lực, trừ có qui định khác Có thể sử dụng thiết bị lọc khử trùng (có cỡ lỗ 0,22 µm) khơng thể hấp áp lực Để tránh nhiễm, kỹ thuật vô trùng cần thực khu vực để chuẩn bị PCR, cụ thể găng tay khơng có bột, dụng cụ nhựa tiệt trùng, hóa chất hấp tiệt trùng, dụng cụ nhựa vô trùng sử dụng lần, đầu hút pipet bảo vệ khỏi mơi trường khơng khí Vật liệu tất hộp chứa dụng cụ đựng thuốc thử dùng lần cần bảo quản khỏi tác nhân nhiễm bẩn (ví dụ bụi bẩn) Sử dụng thuốc thử phải tuân theo hướng dẫn nhà sản xuất Tiến hành kiểm tra để đánh giá ngun vẹn thuốc thử khơng có ADNaza Cần đảm bảo rứng khơng có mặt hoạt tính enzym khơng mong muốn (ví dụ exonucleaza) vốn gây cản trở phản ứng PCR Dung dịch đệm phản ứng phải phù hợp với loại polymeraza sử dụng Diễn giải biểu thị kết 6.1 Khái quát Đối với phương pháp dịnh lượng, việc tính tốn biểu thị kết đưa ISO 21570 TCVN 7607:2007 (ISO 21572:2004) Khi nghi ngờ khơng biểu thị kết 6.2 Diễn giải phép kiểm chứng Mỗi phép kiểm chứng có giá trị hợp lệ, kết quan sát phép kiểm chứng khác với giá trị hợp lệ phải phân tích lại Kiểm chứng mơi trường dương tính âm tính, cho kết dương tính phải thực biện pháp để loại bỏ ngăn cản nhiễm mơi trường phịng thử ngihệm Nếu kết thu không hợp lệ phép kiểm chứng lặp lại phải thực biện pháp loại bỏ thay nguồn nguyên nhân gây sai lỗi sau phân tích lại Kết phân tích báo cáo tất phép kiểm chứng có kết phù hợp Kết phù hợp phép kiểm chứng sau: - kiểm chứng tách chiết dương tính phải ln dương tính; - kiểm chứng tách chiết mẫu trắng phải ln âm tính; - kiểm chứng ADN dương tính đích phải ln dương tính; - kiểm chứng ADN âm tính đích phải ln âm tính; - kiểm chứng thuốc thử khuyếch đại ADN phải ln âm tính Kiểm chứng chất ức chế phản ứng PCR phải cho thấy ảnh hưởng ức chế không đáng kể lên phản ứng (đối với phép phân tích định tính ảnh hưởng ức chế quan trọng phân tích định lượng) Các kết kiểm chứng phản ứng PCR liệt kê Bảng Các kết sử dụng để diễn giải báo cáo thử nghiệm Bảng - Một số ví dụ kết phản ứng PCR Mẫu thử nghiệm Kiểm chứng tách chiết dương tính Kiểm chứng tách chiết mẫu trắng Kiểm chứng ADN âm tính đích Kiểm chứng ADN dương tính đích +a + - -b + dương tính - + - - + âm tính + + + - + khơng kết luận đượcc - - + - - không kết luận đượcc - - - - - không kết luận đượcc Kết a Sản phẩm PCR phát b Khơng có sản phẩm PCR phát c Qui trình lặp lại bắt đầu bước tách chiết (có khả bị nhiễm bẩn) d Qui trình lặp lại sử dụng phương pháp tách chiết khác bước tinh (có thể có chất ức chế) Ghi lại tất bước thử nghiệm kết thu 6.3 Biểu thị kết âm tính Kết âm tính khơng biểu thị “khơng” “khơng có mặt sinh vật biến đổi gen” Câu sau thường xuất báo cáo thử nghiệm: “Đối với chất cần phân tích X, khơng phát vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen” Ngoài ra, báo cáo thử nghiệm bao gồm thông tin về: - LOD phương pháp phù hợp mẫu cụ thể - LOD thực tế mẫu dựa kinh nghiệm phòng thử nghiệm mẫu phân tích (hoặc nói rõ chưa biết) LOD thực tế cần phải lớn LOD phương pháp đánh giá hiệu lực 6.4 Biểu thị kết dương tính Câu sau thường xuất báo cáo: “Đối với chất cần phân tích X, phát sử có mặt vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen (nêu rõ trình tự đích đặc hiệu)” Có thể nêu nhận dạng sinh vật biến đổi gen, biết 6.5 Biểu thị kết nghi ngờ Các kết tất phần thử nghiệm phải thống Khi phần thử nghiệm cho kết dương tính phần thử nghiệm cho kết âm tính, phải phân tích lại Nếu hai lần lặp lại cách tiến hành (bắt đầu tách chiết axit nucleic) cho kết nghi ngờ, chẳng hạn kết dương tính kết âm tính, báo cáo phải nêu rõ mẫu âm tính giới hạn phát biểu thị theo TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005) ISO 21570 6.6 Yêu cầu đảm bảo chất lượng Các khía cạnh đảm bảo chất lượng nêu TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/EIC 17025:1999) Khi phương pháp đánh giá có hiệu lực chứng minh phù hợp cho chất cụ thể, phương pháp khơng áp dụng cho chất hay mẫu khác trước thiết lập mức độ phù hợp với mục đích chất Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm bao gồm thông tin sau: a) thông tin cần thiết để nhận dạng mẫu thử; b) thông tin đặc biệt liên quan đến mẫu thử nghiệm (chẳng hạn: kích cỡ khơng phù hợp, trạng thái bị phân giải); c) viện dẫn tiêu chuẩn phụ lục tương ứng; d) ghi ngày phương pháp xử lý mẫu sử dụng; e) ngày nhận mẫu; f) điều kiện bảo quản, có; g) ngày bắt đầu/kết thúc phân tích, có; h) người chịu trách nhiệm phân tích; i) cỡ mẫu phịng thử nghiệm cỡ mẫu thử; j) kết theo yêu cầu phương pháp cụ thể đơn vị sử dụng để báo cáo kết quả, thiết bị hiệu chuẩn phương pháp tính tốn sử dụng; k) quan sát bất thường thử nghiệm; l) sai lệch nào, thêm vào, hay bớt so với quy định thử nghiệm; m) yêu cầu theo quy định báo cáo thử nghiệm TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005) ISO 21570; n) yêu cầu quy định điều Thông tin phải ghi với đơn vị đo Khi có yêu cầu, không chắn mức độ tin cậy phép đo cung cấp cho người sử dụng kết THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Codex Alimentarius Commission, Procedural Manual, Twelfth Edition for Principles for the Establishment of Codex Methods of Analysis, Guidelines on the Application of the Criteria Approach, 2001, p 64 (see CX!MAX 01/4) [2] HORWITZ, W Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies Pure and Applied Chemistry, 67, 1995, pp 331-343 [3] Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling, In House method validation In House validated methods and their role in methods of analysis for Codex purposes Codex Alimentarius Commission (CX!MAS 98/8), 1998, Budapest, Hungary, 23-27 November 1998 [4] INHORN, S.L.Quality Assurance Practices for Health Laboratories APHA, Washington DC, 1978, p 588 [5] httD://www.eurachem.ul.Dt/audies/mval.htm, ISBN 0-948926-12-0 [6] THOMPSON, M., ELLISON, S.L and WOOD, R Harmonised guidelinesf-r single laboratory validation of methods of analysis Pure Appl Chem., 47, No.5, 2002, pp 835-855 [7] ARUMUGANATHAN, K and EARLE, E.D Nuclear content of some important plant species Plant Mol Bioi Rep., 9(3), 1991, pp 208-218 [8] ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method [9] ISO 7002:1986, Agricultural food products-Layout for a standard method of sampling from a lot [10] ISOII EC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories [11] ISO Guide 30:1992, Terms and definitions used in connection with reference materials [12] ISOITS 21098, Foodstuffs - Nucleic acid based methods of analysis of genetically modified organisms and derived products - Information to be supplied and procedure for the addition of methods to ISO 21569, ISO 21570 or ISO 21571