Quy định định mức kinh tế kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi genbằng phương pháp phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribo Nucleic

BỘ TÀI NGUN VÀ MƠI TRƯỜNG Số: CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc /2012/TT-BTNMT Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Dự thảo THÔNG TƯ Quy định định mức kinh tế kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribo Nucleic BỘ TRƯỞNG BỘ TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG Căn Nghị định số 69/2010/NĐ-CP ngày 21 tháng 06 năm 2010 an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền sản phẩm sinh vật biến đổi gen; Căn Nghị định số 25/2008/NĐ-CP ngày 04 tháng năm 2008 Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn cấu tổ chức Bộ Tài nguyên Môi trường; Xét đề nghị Vụ trưởng Vụ: Kế hoạch, Tài chính, Pháp chế Tổng cục trưởng Tổng cục Môi trường, QUY ĐỊNH: Điều Ban hành kèm theo Thông tư Định mức kinh tế kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng axit deoxyribo nucleic Điều Thơng tư có hiệu lực thi hành kể từ ngày tháng năm 2012 Điều Bộ trưởng, Thủ trưởng quan ngang Bộ, quan thuộc Chính phủ, Chủ tịch Ủy ban nhân dân tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương, Tổng cục trưởng Tổng cục Môi trường , Thủ trưởng đơn vị trực thuộc Bộ Tài nguyên Môi trường, Giám đốc Sở Tài nguyên Môi trường tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương tổ chức, cá nhân có liên quan chịu trách nhiệm thi hành Thơng tư này./ Nơi nhận: - Văn phòng Quốc hội; - Văn phịng Chủ tịch nước; - Văn phịng Chính phủ; - Văn phòng Trung ương Ban Đảng; - Tòa án nhân dân tối cao; - Viện Kiểm sát nhân dân tối cao; - Các Bộ, quan ngang Bộ, quan thuộc Chính phủ; - Kiểm tốn Nhà nước; - Ủy ban Trung ương Mặt trận Tổ quốc Việt Nam; - Cơ quan Trung ương đoàn thể; - HĐND, UBND tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương; - Cục kiểm tra văn QPPL (Bộ Tư pháp); - Các Thứ trưởng Bộ TN&MT; - Các đơn vị trực thuộc Bộ TN&MT, Website Bộ; - Cơng báo, Cổng Thơng tin điện tử Chính phủ; - Lưu: VT, PC, TCMT BỘ TRƯỞNG Nguyễn Minh Quang BỘ TÀI NGUN VÀ MƠI TRƯỜNG CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT DEOXYRIBO NUCLEIC (Ban hành kèm theo Thông tư số /2012/TT-BTNMT ngày tháng năm 2012 Bộ Tài nguyên Môi trường) Phần QUY ĐỊNH CHUNG Phạm vi điều chỉnh: định mức kinh tế - kỹ thuật xác định mức hao phí cần thiết lao động, vật tư, dụng cụ máy móc thiết bị để hồn thành quy trình phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng DNA Đối tượng áp dụng: định mức phục vụ cho việc lập, giao kế hoạch tính đơn giá sản phẩm phục vụ lập dự tốn, tốn cơng trình, dự án, nhiệm vụ liên quan đến xác định sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng DNA quan, tổ chức cá nhân thực ngân sách nhà nước Cơ sở xây dựng định mức - Nghị định 204/2004/NĐ-CP ngày 14 tháng 12 năm 2004 chế độ tiền lương cán công chức, viên chức lực lượng vũ trang; - Quyết định số 32/2008/QĐ-BTC ngày 29/5/2008 Bộ tài ban hành chế độ quản lý, tính hao mịn tài sản cố định quan nhà nước, đơn vị nghiệp công lập tổ chức sử dụng ngân sách nhà nước; - Công văn số 1607/BTNMT-KHTC ngày 18 tháng năm 2006 Bộ TN&MT Hướng dẫn xây dựng định mức kinh tế – kỹ thuật; - Tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005): Thực phẩm – phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – phương pháp dựa định tính axít nucleic; - Tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005): Thực phẩm – phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Tách chiết axít nucleic; - Tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007): Thực phẩm – phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Yêu cầu chung định nghĩa; - Tiêu chuẩn Quốc tế ISO 21570: Thực phẩm – phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Phương pháp định lượng axít nucleic; - Các kết khảo sát thực tế thu thập, tổng hợp, phân tích số liệu thực nhiệm vụ xây dựng định mức kinh tế - kỹ thuật năm 2010 năm 2011 Định mức thành phần Định mức kinh tế - kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng DNA bao gồm định mức thành phần sau : 4.1 Định mức lao động công nghệ Định mức lao động công nghệ (sau gọi định mức lao động) thời gian lao động cần thiết để sản xuất sản phẩm Nội dung định mức lao động công nghệ bao gồm: a) Thành phần công việc: nêu thao tác thực bước công việc cho hoạt động phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng DNA b) Định biên: xác định cụ thể số lượng cấp bậc kỹ thuật bước công việc c) Định mức: quy định thời gian lao động để sản xuất sản phẩm Đơn vị tính cơng nhóm/đơn vị sản phẩm; ngày cơng tính làm việc 4.2 Định mức vật tư thiết bị Định mức vật tư thiết bị gồm định mức dụng cụ, định mức thiết bị định mức vật liệu: a) Định mức dụng cụ: thời gian sử dụng dụng cụ cần thiết để sản xuất sản phẩm Thời hạn dụng cụ: xác định phương pháp thống kê, kinh nghiệm; đơn vị tháng Mức sử dụng dụng cụ nhỏ, phụ tính 5% mức sử dụng dụng cụ tính định mức b) Định mức thiết bị: thời gian sử dụng thiết bị cần thiết để sản xuất sản phẩm Thời hạn (niên hạn tính khấu hao) thiết bị theo quy định Bộ Tài c) Định mức vật liệu: số lượng vật liệu cần thiết để sản xuất sản phẩm Mức vật liệu phụ, vụn vặt hao hụt tính 8% mức vật liệu tính định mức Định mức không quy định các công việc khảo sát, thu thập mẫu Qui định chữ viết tắt TT Chữ viết tắt Nội dung viết tắt Định mức KT-KT Định mức kinh tế - kỹ thuật BHLĐ Bảo hộ lao động TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam ĐVT Đơn vị tính KS1 Kỹ sư bậc KS4 Kỹ sư bậc DNA Axit deoxyribonucleic CTAB Cetyltrimethylammonium bromide PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction) 10 Real-time PCR Phản ứng PCR tức thời Áp dụng định mức: Trong trình áp dụng Định mức kinh tế - kỹ thuật này, có vướng mắc phát bất hợp lý, đề nghị phản ánh Bộ Tài nguyên Môi trường để tổng hợp, điều chỉnh kịp thời Phần ĐỊNH MỨC KINH TẾ - KỸ THUẬT TRONG PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG AXIT DEOXYRIBO NUCLEIC Định mức lao động 1.1.Nội dung công việc Phương pháp phân tích dựa vào tính chất cụ thể trình tự DNA đích để xác định có mặt định lượng DNA có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen Q trình phân tích định tính, định lượng DNA sinh vật biến đổi gen bao gồm 04 bước: a) Tách chiết DNA; b) Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA; c) Phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen phương pháp PCR Phương pháp PCR thông thường sử dụng để nhân đoạn gen sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho trình tự gen Trong trường hợp PCR sử dụng để phát nhận dạng sinh vật biến đổi gen hay PCR định tính d) Định lượng DNA sinh vật biến đổi gen phương pháp realtime PCR Trường hợp sử dụng phương pháp real time PCR để định lượng xác hàm lượng vật chất di truyền (DNA) sinh vật biến đổi gen tổng số vật chất di truyền xét nghiệm Phương pháp cần thiết phải có mẫu chuẩn chứng nhận (certifỉed reference materials) để định lượng 1.1.1 Tách chiết DNA (Dựa theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571)) Nguyên tắc việc tách chiết DNA bao gồm việc giải phóng DNA dung dịch hỗn hợp chất tinh DNA khỏi hỗn hợp Có nhiều phương pháp tách chiết DNA tuỳ thuộc vào nguồn gốc loại mẫu phẩm (động vật, thực vật hay vi sinh vật) có phương pháp tách chiết phù hợp Các bước để tách chiết DNA bao gồm:  Chuẩn bị dụng cụ hoá chất  Nghiền mẫu  Tiến hành tách chiết DNA  Tinh DNA Định mức trình bày nguyên tắc bước phương pháp tách chiết DNA với động vật, thực vật vi sinh vật sử dụng phổ biến a) Phương pháp chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Phương pháp sử dụng để chiết DNA từ thực vật loại chất có nguồn gốc từ thực vật, có khả loại bỏ hợp chất polysacarit polyphenol vốn có ảnh hưởng đến chất lượng DNA Phương pháp dùng cho loại chất khác Các bước tiến hành bản:  Nghiền mẫu thử thành dạng bột mịn cối chày sứ nitơ lỏng  Phân giải mẫu nhiệt với có mặt CTAB, tuỳ thuộc vài loại chất cần bổ sung thêm enzyme khác vào đệm chiết alpha amylaza để thuỷ phân tinh bột, enzyme proteinaza-K để loại trừ protein enzyme Rnaza để phân giải RNA  Loại bỏ tạp chất polysacarit protein cloroform  Kết tủa DNA isopropanol rửa ethanol b) Phương pháp chiết DNA từ mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/cloroform Phương pháp dùng để chiết DNA khỏi loại chất khác Phenol thường thích hợp để biến tính protein phá huỷ enzyme nucleaza Các bước tiến hành bản:  Nghiền mẫu thử thành dạng bột mịn cồi chày sứ nitơ lỏng;  Phân huỷ mẫu có mặt natri dodecyl sulfat hàm lượng EDTA cao; tuỳ thuộc vài loại chất cần bổ sung thêm enzyme proteinaza-K để loại trừ protein enzyme Rnaza để phân giải RNA;  Loại bỏ tạp chất phân tử ưa mỡ, chất polysacarit, protein nuleaza phenol cloroform  Kết tủa DNA cuối isopropanol rửa ethanol loại trừ muối cloroform dư c) Phương pháp chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật dựa phenol/cloroform Phương pháp mơ tả qui trình chiết tinh DNA đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR từ nấm men nấm sợi, quần thể vi khuẩn phân lập Phương pháp thích hợp việc truy nguyên DNA từ sinh vật biến đổi gen loại chất phức hợp cao Việc phân lập vi khuẩn khỏi chất nền, nuôi cấy vi khuẩn tăng thu sinh khối tế bào, sau tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn phân lập cho kết tin cậy Các bước tiến hành bản:  Các vi khuẩn, nấm men nấm sợi bị phá vỡ DNA tách chiết đồng thời cách nghiền hỗn hợp Tris-phenolcloroform-EDTA-SDS với tốc độ cao có mặt hạt thuỷ tinh  Đối với phản ứng PCR định lượng cần ủ mẫu với Rnaza để phân giải RNA  Kết tủa DNA ethanol 1.1.2 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA (Dựa theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571)) Chất lượng, số lượng tính nguyên vẹn mẫu DNA ảnh hưởng lớn đến kết phương pháp phân tích Các bước đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA bao gồm: - Chuẩn bị dụng cụ hoá chất - Điện di DNA gel agarose - Xác định hàm lượng DNA máy quang phổ - Phân tích xử lý kết Có phương pháp thông dụng để xác định nồng độ DNA dung dịch:  Phương pháp điện di DNA phân tách phương pháp điện di khuôn gel agarosse dựa điện tích phân tử lượng Sau điện di lấy nhẹ nhuộm gel dung dịch Ethidium bromide (EtBr), EtBr liên kết vào phân tử DNA kích thích ánh sáng UV phát huỳnh quang da cam Do lượng huỳnh quang tỉ lệ với lượng DNA tổng số, nên số lượng DNA có mẫu ước tính cách so sánh huỳnh quang tạo mẫu chưa biết với dãy định lượng chuẩn  Đo hàm lượng DNA quang phổ Các acid nucleic dung dịch hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại 260 nm Vì DNA RNA nucleotide có độ hấp thụ cực đại 260 nm, nên DNA xác định máy đo quang phổ vùng cực tím dung dịch bị nhiễm nucleotide RNA Do RNA cần loại bỏ phương pháp thuỷ phân với enzyme RNase Các nucleotide oligonucleotide thu từ thuỷ phân RNA cần loại bỏ, không loại bỏ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng DNA mẫu thử Ngoài DNA xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV DNA xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ tính tốn nồng độ Việc chuẩn máy đo quang phổ cần thực định kỳ cách đo nồng độ dung dịch DNA đối chứng 1.1.3 Phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen (định tính) thơng qua phản ứng chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR) (TCVN 7605:2007 (ISO 21569)) Các bước phát nhận dạng sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR bao gồm: - Chuẩn bị dụng cụ hoá chất - Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen - Tiến hành phản ứng PCR - Phân tích xử lý kết điện di gel agarose Nguyên tắc chung Phương pháp PCR dựa nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu đoạn DNA có trình tự bổ sung phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuyếch đại theo hàm mũ đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần PCR xem dịch đơn giản hố q trình mã DNA mà trình xuất suốt thời kì phân chia tế bào PCR bao gồm bước chính: biến tính đoạn DNA, gắn mồi oligonucleotide tổng hợp, kéo dài mồi DNA polymerase Chu kì gồm bước lặp lặp lại nhiều lần, lần làm tăng gấp đôi số luợng sản phẩm ban đầu Sự khuếch đại tính theo cơng thức x(1+E)n với x số lượng mẫu ban đầu, E hiệu suất trình khuếch đại, n chu kì phản ứng PCR Sau vài chu kì, sản phẩm tạo thành tính kích thước đầu cuối 5’ hai đoạn mồi Các phương pháp phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR bao gồm phương pháp sau: Phương pháp đặc hiệu taxon - đích Đây phương pháp thơng thường để phát trình tự DNA taxon đích, thường lồi cấp phân loại nhỏ cao Các phương pháp dựa vào taxon đích để đánh giá có mặt, chất lượng số lượng DNA có nguồn gốc từ taxon đơi cịn sử dụng đơn vị chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen Ví dụ trình tự nucleotide gen lectin Le1 đậu tương thu từ Ngân hàng liệu gen sử dụng làm gen đơn đặc hiệu xác định đặc hiệu taxon đích để phát thành phần từ đậu tương Phương pháp sàng lọc PCR để phát DNA sinh vật biến đổi gen Phương pháp sàng lọc PCR phương pháp phát yếu tố di truyền thông thường số sinh vật biến đổi gen (chẳng hạn gen khởi động, gen kết thúc số yếu tố di truyền quan tâm khác) Phương pháp sàng lọc nhanh đáng tin cậy số lượng lớn mẫu thử Phát sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR chủ yếu dựa vào cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter terminator Hầu hết trình tự DNA chuyển vào hệ gen thực vật điều khiển CaMV 35S promoter, có vài trường hợp sử dụng promoter biểu đặc hiệu phần chuyên hoá rễ, thân, hạt… hay promoter cảm ứng Hiện nhiều trồng biến đổi gen cấp phép trồng mang 35S promoter T-Nos terminator (phân lập từ gen tổng hợp nopaline Agrobacterium tumefaciens) Một gen khác sử dụng phổ biến gen chọn lọc kanamycin nptII phân lập từ Escherichia coli transposon Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens virus khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus) nằm danh mục loài gây hại cho thực vật đặc biệt virus khảm súp lơ ngồi gây bệnh cho súp lơ cịn gây bệnh cho thành viên khác thuộc họ Brassicceae (Cruciferae) họ Resedaceae Solanaceae Vì thế, kết dương tính từ mẫu Brassicaceae, Resedceae Solanaceae cần xử lý cẩn thận Để phân biệt nhiễm virus vật liệu biến đổi gen cần có phương pháp phát virus Đối với động vật biến đổi gen, thường promoter sử dụng có nguồn gốc từ động vật methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2 từ virus động vật Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV) Tuy nhiên promoter có nguồn gốc từ động vật dễ gây nhầm lẫn với promoter nội sinh vật chủ, nên promoter có nguồn gốc từ virus động vật sử dụng để sàng lọc có mặt DNA có nguồn gốc động vật Phương pháp nhận dạng cấu trúc đặc thù (event specific) để phát trình tự đích sản phẩm biến đổi gen Phương pháp sử dụng nhằm phát tổ hợp trình tự DNA đưa vào hệ gen vật chủ, cấu trúc tìm thấy dịng có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen Trường hợp để phát ngô T25/"LibertyLink" kháng lại thuốc diệt cỏ nhờ biến đổi gen nguyên liệu thô cách khuếch đại vùng nối trình tự DNA có nguồn gốc từ promoter 35S-CaMV gen pat (gen kháng thuốc trừ cỏ) Phương pháp không phân biệt giống ngô mà sử dụng để phát có mặt đoạn gen chuyển hạt ngơ Kích thước đoạn gen đích sau khuếch đại phản ứng PCR xác định kích thước sản phẩm PCR tương ứng với kích thước đoạn DNA đích dự kiến Các sản phẩm PCR phân tích xử lý phương pháp điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide Gel agarose 1,5 % thích hợp để phân tích sản phẩm PCR từ 150-1000 bp Thang DNA chuẩn có kích thước khoảng 0,1-10kb để phân biệt độ lớn đoạn nucleotide khác 1.1.4 Định lượng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật real time PCR (Dựa theo ISO 21570) Các bước định lượng sản phẩm biến đổi gen kỹ thuật Real time PCR bao gồm: - Chuẩn bị dụng cụ hoá chất - Xây dựng đường chuẩn DNA cho gen chuẩn (gen nội sinh) gen đích - Tiến hành phản ứng Real time PCR - Phân tích xử lý kết mẫu (S1-S6) mang số gen đơn bội khác sau: S1:183486; S2:61162; S3: 20387; S4: 6796; S5: 2265; S6:755 (được biết gen đơn bội ngơ có khối lượng 2,725 pg) Đảm bảo chất lượng diễn giải kết Bằng cách sử dụng mẫu pha loãng với nồng độ biết để tạo đường chuẩn cho gen chuẩn gen đích Đường chuẩn thể mối quan hệ tuyến tính giá trị Ct nồng độ DNA ban đầu, vào xác định nồng độ DNA cuả mẫu nghiên cứu vào giá trị C t mẫu Để định lượng hàm lượng biến đổi gen mẫu cần thiết phải xác định giá trị số gen đích số gen chuẩn Muốn phải xây dựng đường chuẩn, đường chuẩn cho gen chuẩn đường chuẩn cho gen đích Trong hai trường hợp, số gen cho gen đơn bội ước tính Hàm lượng biến đổi gen (GM) mẫu tỉ lệ phần trăm vật liệu biến đổi gen tổng số vật liệu di truyền sinh vật Phần trăm hàm lượng biến đổi gen tính cơng thức sau: % GM = GM gen đích/gen chuẩn × 100 1.2 Định biên: nhóm lao động gồm KS1 KS4 1.3 Định mức: công nhóm/mẫu Bảng số TT Cơng việc Mức Tách chiết DNA 0,50 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA 0,25 Phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR 0,60 Định lượng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật real time PCR 0,60 Định mức vật tư thiết bị 2.1 Định mức dụng cụ: ca/mẫu 2.1.1.Tách chiết DNA 2.1.1.1.Tách chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Bảng số 10 TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) Áo BHLĐ 0,80 Giá để dụng cụ, hóa chất 60 0,20 Đồng hồ treo tường 48 0,20 Đồng hồ hẹn 24 0,07 Kính bảo hộ 0,80 Ống đong (loại 50, 100, 250 ml) ống 12 0,06 Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí hộp 24 0,40 Khay đựng mẫu 45 vị trí 24 0,40 Hộp đựng đầu tip 10 µl tiệt trùng hộp 24 0,40 10 Hộp đụng đầu tip 200 µl tiệt trùng hộp 24 0,40 11 Máy trộn mẫu (vortex) 60 0,02 12 Phích đá giữ mẫu 24 0,40 13 PIPETman loại l 36 0,10 14 PIPETman loại 10 l 36 0,10 15 PIPETman loại 100 l 36 0,10 16 PIPETman loại 1000 l 36 0,10 17 Bút viết 0,02 18 Bút viết kính 0,02 19 Sổ hướng dẫn thí nghiệm 24 0,02 20 Chày, cối sứ 12 0,02 21 Đèn neon 40W 48 0,80 22 Máy hút ẩm kW 36 0,05 23 Máy hút bụi 1,5 kW 36 0,01 24 Quạt thông gió 40W 12 0,13 25 Quạt trần 100W 60 0,13 26 Điện kW 11 1,39 2.1.1.2 Tách chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/cloroform Áp dụng theo quy định mục 2.1.1.1 2.1.1.3 Phương pháp chiết DNA nấm men và/hoặc nấm sợi thu từ thực phẩm dựa phenol/cloroform Bảng số TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) Áo BHLĐ 0,80 Giá để dụng cụ, hóa chất 60 0,40 Đồng hồ treo tường 48 0,40 Đồng hồ hẹn 24 0,03 Kính bảo hộ 0,40 Ống đong (loại 50, 100, 250 ml) ống 12 0,06 Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí hộp 24 0,40 Khay đựng mẫu 45 vị trí 24 0,40 Hộp đựng đầu tip 10 µl tiệt trùng hộp 24 0,40 10 Hộp đụng đầu tip 200 µl tiệt trùng hộp 24 0,40 11 Máy trộn mẫu (vortex) 60 0,02 12 Phích đá giữ mẫu 24 0,40 13 PIPETman loại l 36 0,10 14 PIPETman loại 10 l 36 0,10 15 PIPETman loại 100 l 36 0,10 16 PIPETman loại 1000 l 36 0,10 17 Bút viết 0,02 18 Bút viết kính 0,02 19 Sổ hướng dẫn thí nghiệm 24 0,02 20 Đèn neon 40W 48 0,80 21 Máy hút ẩm kW 36 0,05 22 Máy hút bụi 1,5 kW 36 0,01 23 Quạt thơng gió 40W 12 0,13 24 Quạt trần 100W 60 0,13 12 TT 25 Danh mục dụng cụ ĐVT Điện Thời hạn (tháng) kW Mức (ca/mẫu ) 1,39 2.1.2 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA sinh vật biến đổi gen Bảng số TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) Áo BHLĐ 0,40 Bàn máy vi tính 72 0,15 Ghế máy vi tính 72 0,15 Chuột máy tính 0,15 Ổn áp (chung) 10A 48 0,04 Giá để dụng cụ, hóa chất 48 0,20 Đồng hồ treo tường 48 0,20 Kính bảo hộ 12 0,40 Khay đựng mẫu 45 vị trí 24 0,20 10 Hộp đựng đầu tip 10 µl tiệt trùng hộp 24 0,20 11 Hộp đụng đầu tip 200 µl tiệt trùng hộp 24 0,20 12 Máy trộn mẫu (vortex) 60 0,02 13 PIPETman loại l 36 0,05 14 PIPETman loại 10 l 36 0,05 15 PIPETman loại 100 l 36 0,05 16 PIPETman loại 1000 l 36 0,05 17 Bút viết 0,02 18 Bút viết kính 0,02 19 Sổ hướng dẫn thí nghiệm 24 0,02 20 Lị vi sóng 0,5 kW 36 0,02 21 Đèn neon 40W 48 0,40 22 Máy hút ẩm kW 36 0,02 13 TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) 23 Máy hút bụi 1,5 kW 36 0,01 24 Quạt thơng gió 40W 12 0,06 25 Quạt trần 100W 60 0,06 26 Điện kW 0,75 2.1.3 Phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR Bảng số TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) Áo BHLĐ 0,96 Dép phịng đơi 0,96 Bàn máy vi tính 72 0,09 Ghế máy vi tính 72 0,09 Chuột máy tính 0,09 Ổn áp (chung) 10A 48 0,02 Giá để dụng cụ, hóa chất 60 0,24 Kính bảo hộ 0,96 Hộp bảo quản mẫu 81 vị trí hộp 24 0,48 10 Hộp đựng đầu tip 10 µl hộp 24 0,48 11 Hộp đụng đầu tip 200 µl hộp 24 0,48 12 Máy tính tay 24 0,03 13 Phích đá giữ mẫu 24 0,48 14 PIPETman loại l 36 0,20 15 PIPETman loại 10 l 36 0,12 16 PIPETman loại 100 l 36 0,12 17 PIPETman loại 1000 l 36 0,12 18 Bút viết 0,03 19 Bút viết kính 0,03 14 TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) 48 0,03 20 Sổ thí nghiệm 21 Máy trộn mẫu (vortex) 0,1kW 60 0,03 22 Đèn neon 40W 48 0,96 23 Máy hút ẩm kW 36 0,06 24 Máy hút bụi 1,5 kW 36 0,01 25 Quạt thơng gió 40W 12 0,16 26 Quạt trần 100W 60 0,16 27 Điện kW 1,67 2.1.4 Định lượng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật real time PCR Bảng số TT Danh mục dụng cụ ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) Áo BHLĐ 0,96 Dép phịng đơi 0,96 Bàn máy vi tính 72 0,18 Ghế máy vi tính 72 0,18 Chuột máy tính 0,18 Ổn áp (chung) 10A 48 0,05 Đồng hồ treo tường 48 0,24 Hộp bảo quản mẫu hộp 24 0,48 Ống đỡ mao quản để ly tâm hộp 36 0,10 10 Hộp đựng tip 10 µl tiệt trùng hộp 24 0,48 11 Hộp đựng tip 200 µl tiệt trùng hộp 24 0,48 12 Máy trộn mẫu (vortex) 0,1 kW 72 0,03 13 PIPETman loại l 36 0,12 14 PIPETman loại 10 l 36 0,12 15 PIPETman loại 100 l 36 0,12 15 ĐVT Thời hạn (tháng) Mức (ca/mẫu ) TT Danh mục dụng cụ 16 PIPETman loại 1000 l 36 0,12 17 Bút viết 0,03 18 Bút viết kính 0,03 19 Sổ thí nghiệm 48 0,03 20 Đèn neon 40W 48 0,96 21 Máy hút ẩm kW 36 0,06 22 Máy hút bụi 1,5 kW 36 0,01 23 Quạt thơng gió 40W 12 0,16 24 Quạt trần 100W 60 0,16 25 Điện kW 1,67 2.2 Định mức thiết bị: ca/mẫu 2.2.1 Tách chiết DNA Bảng số TT Danh mục thiết bị ĐVT Công suất Mức (ca/mẫu) a Tách chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Điều hòa nhiệt độ 2,20 0,13 Nồi hấp dụng cụ 2,00 0,02 Tủ hút độc 1,00 0,40 Tủ lạnh bảo quản mẫu 0,10 0,40 Máy ly tâm 0,30 0,03 Cân phân tích 0,01 0,03 Máy đo pH 0,02 0,03 Bình chứa ni tơ lỏng Máy ủ nhiệt Điện kW 16 0,40 0,10 0,40 6,85 TT Danh mục thiết bị ĐVT Công suất Mức (ca/mẫu) Theo quy định mục a b Tách chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/cloroform c Tách chiết DNA nấm men nấm sợi thu từ thực phẩm dựa phenol/cloroform Điều hòa nhiệt độ 2,20 0,13 Nồi hấp dụng cụ 2,00 0,03 Tủ hút độc 1,00 0,40 Tủ lạnh bảo quản mẫu 0,10 0,40 Máy ly tâm 0,30 0,03 Cân phân tích 0,01 0,03 Máy đo pH 0,02 0,03 Bình chứa ni tơ lỏng Máy ủ nhiệt 0,10 0,40 10 Máy nghiền bi 0,10 0,03 11 Điện kW 0,40 7,05 2.2.2 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA sinh vật biến đổi gen Bảng số TT Danh mục thiết bị ĐVT Công suất Mức (ca/mẫu) Máy điều hoà 2,20 0,06 Tủ lạnh giữ mẫu 0,10 0,20 Máy ly tâm 0,30 0,01 Máy soi gel nối với máy tính 0,03 0,01 Bộ điện di ngang nguồn điện 0,05 0,05 Máy đo pH để bàn 0,05 0,01 Cân phân tích 0,01 0,01 Máy đo quang phổ 0,05 0,08 17 TT Danh mục thiết bị ĐVT Công suất Mức (ca/mẫu) Máy vi tính 0,40 0,08 10 Máy in laser A4 0,40 0,01 12 Điện kW 1,93 2.2.3 Phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật PCR Bảng số TT Danh mục thiết bị ĐVT Công suất Mức (ca/mẫu) Máy điều hoà 2,20 0,16 Máy ly tâm 0,30 0,03 Tủ lạnh giữ mẫu 0,10 0,48 Cân phân tích 0,01 0,03 Máy soi gel nối với máy tính 0,03 0,12 Máy nhân gen (PCR) 0,30 0,06 Bộ điện di ngang nguồn điện 0,05 0,12 Máy vi tính 0,40 0,09 Máy in laser A4 0,40 0,01 11 Điện kW 4,18 2.2.4 Định lượng DNA sinh vật biến đổi gen kỹ thuật real time PCR Bảng số 10 TT Danh mục thiết bị ĐVT Cơng suất Mức (ca/mẫu) Điều hồ nhiệt độ 2,20 0,16 Máy real-time PCR 0,45 0,18 Tủ lạnh bảo quản mẫu 0,10 0,48 Máy ly tâm 0,30 0,03 Tủ giữ mẫu đông lạnh (-20ºC) 0,15 0,48 Máy vi tính 0,40 0,18 18 TT Danh mục thiết bị ĐVT Công suất Mức (ca/mẫu) Máy in laser A4 0,40 0,02 Máy photocopy 1,50 0,05 Điện kW 6,40 2.3 Định mức vật liệu : tính cho mẫu 2.3.1 Tách chiết DNA 2.3.1.1 Tách chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ thực vật dựa CTAB Bảng số 11 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) Nitơ lỏng lít 0,50 CTAB (500 g/lọ) lọ 0,001 RNase (25 mg) lọ 0,02 Na2EDTA (500 g/lọ) lọ 0,002 Tris-Cl (500 g/lọ) lọ 0,0002 Cloroform lít 0,01 2-isopropanol lít 0,0015 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,02 Proteinase K (25 mg) lọ 0,05 10 Alpha amylase (100 mg) lọ 0,005 11 Ethanol lít 0,01 12 NaCl kg 0,0011 13 HCl 37% lít 0,005 14 NaOH kg 0,001 15 Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi) túi 0,20 16 Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi) túi 0,04 17 Khẩu trang dùng lần (50 chiếc/hộp) hộp 0,08 18 Đầu loại 100, 200 µl (1000 cái/túi) túi 0.02 19 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) 19 Đầu loại 1000 µl (500 cái/túi) túi 0,02 20 Eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,03 21 Eppendorf ml (1000 cái/túi) túi 0,005 22 Hoá chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 2.3.1.2 Tách chiết DNA mẫu sinh học có nguồn gốc từ động vật dựa phenol/cloroform Bảng số 12 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) Nitơ lỏng lít 0,50 Natri dodecyl sulfat (SDS) 100 g Lọ 0,025 RNase (12 mg) lọ 0,04 Na2EDTA (500 g/lọ) lọ 0,004 Tris-Cl (500 g/lọ) lọ 0,002 Cloroform lít 0,0216 Phenol lít 0,025 Isoamyl alcohol lít 0,001 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,02 10 Proteinase K (25 mg) lọ 0,16 11 Acid acetic băng lít 0,001 12 Ethanol lít 0,02 13 Kali acetat kg 0,001 14 Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi) túi 0,2 15 Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi) túi 0,04 16 Khẩu trang dùng lần (50 cái/hộp) hộp 0,08 17 Đầu loại 100, 200 µl (1000 cái/túi) túi 0,02 18 Đầu loại 1000 µl (500 cái/túi) túi 0,04 19 Eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,03 20 ĐVT Mức (ca/mẫu) Eppendorf ml (1000 cái/túi) túi 0,015 Hoá chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 TT Danh mục vật liệu 20 21 2.3.1.3 Tách chiết DNA nấm men nấm sợi thu từ thực phẩm dựa phenol/cloroform Bảng số 13 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) RNase (25 mg) Lọ 0,004 Na2EDTA (500 g/lọ) lọ 0,0006 Tris-Cl (500 g/lọ) lọ 0,0002 Cloroform lít 0,0015 Phenol lít 0,0016 Isoamyl alcohol lít 0,0006 Nước cất khử ion vơ trùng lít 0,02 Natri dodecyl sulfat (SDS) 100 g lọ 0,012 Acid acetic glacial lít 0,001 10 Ethanol lít 0,003 11 Kali acetat kg 0,001 12 Ống Falcon 50 ml (25 ống/túi) túi 0,10 13 Ống Falcon 15 ml (50 ống/túi) túi 0,10 14 Khẩu trang dùng lần (50 cái/hộp) hộp 0,08 15 Đầu côn loại 100, 200 µl (1000 cái/túi) túi 0,03 16 Đầu loại 1000 µl (500 cái/túi) túi 0,02 17 Eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,01 18 Eppendorf ml (1000 cái/túi) túi 0,01 19 Hạt thủy tinh 100 g lọ 0,01 20 Hố chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 2.3.2 Đánh giá chất lượng xác định hàm lượng DNA sinh vật biến đổi gen (tính cho mẫu) 21 Bảng số 14 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) Tris-Cl (1000 g/lọ) lọ 0,02 Na2EDTA (500g/lọ) lọ 0,001 H3BO3 (500g/lọ) lọ 0,002 Glycerol (1000 ml/lọ) lọ 0,005 Bromophenol blue (5g/lọ) lọ 0,0005 Nước cất khử ion vơ trùng lít 1,00 Ethidium bromide (10 mg/lọ) lọ 0,05 Thang DNA chuẩn kb (100 µl/ống) ống 0,05 Agarose (100 g/lọ) lọ 0,005 10 Hoá chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,01 11 Găng tay hộp 0,04 12 Parafilm (0,1×38m) cuộn 0,001 13 Đầu loại 10 µl (1000 cái/túi) túi 0,05 14 Đầu loại 100, 200 µl (1000 cái/túi) túi 0,02 15 Đầu loại 1000 µl (500 cái/túi) túi 0,05 16 Cuvett nhựa 5,00 17 Eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,025 2.3.3 Phát nhận dạng DNA sinh vật biến đổi gen: tính cho mẫu – sử dụng cặp mồi Bảng số 15 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) mồi 0,005 Các cặp mồi (Primers) Taq polymerase (100 units/lọ) lọ 0,05 dNTPs 100 mM, 1ml/lọ lọ 0,005 Ethidium bromide (10 mg/lọ) lọ 0,10 Tris Cl (500 g/lọ) lọ 0,08 EDTA (500g/lọ) lọ 0,002 Glycerol (1000 ml/lọ) lọ 0,0005 22 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) Bromophenol blue (5g/lọ) lọ 0,0005 Nước cất khử ion vơ trùng lít 1,50 10 Agarose (100 g/lọ) lọ 0,01 11 Thang DNA chuẩn kb (100 µl/ống) ống 0,1 12 Hố chất sát trùng tiêu chuẩn lít 0,05 13 Găng tay (50 đơi/hộp) hộp 0,08 14 Khẩu trang (50 cái/hộp) hộp 0,08 15 Đầu loại 10 µl (1000 cái/túi) túi 0,05 16 Đầu loại 100 µl, 200 µl (1000 cái/túi) túi 0,04 17 Ống PCR 0,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,05 18 Ống eppendorf 1,5 ml (1000 cái/túi) túi 0,01 2.3.4 Định lượng DNA sinh vật biến đổi gen: tính cho mẫu Bảng số 16 TT Danh mục vật liệu Các cặp mồi Các trình tự nucleotide đặc hiệu chuỗi đánh dấu huỳnh quang Nước cất khử ion vơ trùng LightCycle® Taqman Master CAT.No 04535286001 (bao gồm: FastStart Taq DNA Polymerase, đệm phản ứng, MgCl2 dNTP (dùng dUTP thay dTTP) ĐVT Mức (ca/mẫu) mồi 0,005 trình tự nucleotide 0,005 lít 0,005 kít 0,17 LightCycle® Uracil N-glycosylase (tối ưu) CAT.No 03 539 806 001 kít 0,02 Đầu loại 10 µl (1000 cái/túi) túi 0,02 Đầu côn loại 100, 200 µl (1000 cái/túi) túi 0,02 Ống eppendorf loại 1,5 ml (500 cái/túi) túi 0,02 Ống mao quản cho phản ứng real-time (96 ống/hộp) hộp 0,18 23 TT Danh mục vật liệu ĐVT Mức (ca/mẫu) lít 0,10 10 Hố chất sát trùng tiêu chuẩn 11 Găng tay (dùng lần) hộp 0,06 12 Giấy A4 ram 0,02 13 Mực in A4 hộp 0,004 14 Mực photocopy hộp 0,008 24