THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7606 : 2007 ISO 21571 : 2005 THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction Lời nói đầu TCVN 7606 : 2007 hoàn toàn tương đương với ISO 21571 : 2005; TCVN 7606 : 2007 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Việc nghiên cứu thành phần gốc biến đổi gen thực phương pháp với bước liên tục (hoặc đồng thời) Sau thu thập mẫu, axit nucleic protein chiết khỏi phần mẫu thử Các mẫu phân tích chiết phải làm tiếp, đồng thời với việc chiết sau chiết Sau đó, axit nucleic định lượng (nếu cần), pha lỗng (nếu cần) phân tích (theo PCR) Các bước mô tả chi tiết tiêu chuẩn tiêu chuẩn Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen: ISO 21568, Foodstuffs - Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling (Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Lấy mẫu) TCVN 7605 : 2007 (ISO 21569 : 2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa định tính axit nucleic ISO 21570 : 2005, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods (Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa định tính axit nucleic Thơng tin u cầu chung định nghĩa kể bước nói nêu trong: TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen dựa vào axit nucleic - Yêu cầu chung định nghĩa Tổ chức ISO lưu ý rằng, việc sử dụng tiêu chuẩn kèm theo việc sử dụng sáng chế liên quan đến phương pháp tách chiết dựa silica (No.EP 0389063/USP 5,234,809) nêu A.4 ISO không liên quan đến chứng, tính hiệu lực phạm vi quyền sáng chế Người giữ quyền cam đoan với ISO họ mong muốn thương lượng giấy phép cách hợp lý, không phân biệt đổi xử điều kiện với người sử dụng khắp giới Về khía cạnh này, tuyên bố người giữ quyền đăng ký với ISO Thơng tin có từ: Jean Deleforge, BioMérieux Chemin de I’Orme, 69280 Marcy-I’E’toile, France Chú ý khả số sở tài liệu phải chịu quyền khác với điều nói ISO khơng có trách nhiệm việc nhận biết tất quyền THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - TÁCH CHIẾT AXIT NUCLEIC LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa yêu cầu chung phương pháp đặc trưng để tách chiết/tinh định lượng ADN Các phương pháp mô tả Phụ lục A Phụ lục B Tiêu chuẩn thiết lập nhằm dùng cho loại chất thực phẩm, áp dụng cho loại chất khác loại hạt thức ăn chăn nuôi Tiêu chuẩn phần phương pháp phân tích dựa vào axit nucleic, cụ thể TCVN 7605 : 2007 (ISO 21569 : 2005) phương pháp phân tích định tính ISO 21570 phương pháp phân tích định lượng Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006)1) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung định nghĩa ISO 21568, Foodstuffs - Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling (Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Lấy mẫu) Nguyên tắc 3.1 Khái quát Mục đích phương pháp tách chiết axit nucleic thu axit nucleic thích hợp để dùng cho phân tích [xem TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006)] Chú thích: “Chất lượng” ADN phụ thuộc vào độ dài trung bình đoạn ADN tách chiết được, độ tinh khiết mặt hóa học tình trạng ngun vẹn trình tự ADN chuỗi xoắn kép (ví dụ: liên kết sợi, liên kết nội sợi base ADN, khoảng trống sợi đơn, liên kết chéo với polyol, haemin…) Tuy nhiên, biến đổi thường chuỗi đặc thù khơng phân bố ngẫu nhiên tồn hệ gen (xem [1], [2], [3] [4]) Người sử dụng tiêu chuẩn cần ý số phương pháp bảo hộ quyền, (ví dụ: tất phương pháp dựa silica) 3.2 Tách chiết ADN Nguyên tắc việc tách chiết ADN bao gồm việc giải phóng ADN có mặt chất sau tinh ADN khỏi chất ức chế phản ứng (PCR) Các phương pháp tách chiết/tinh mô tả Phụ lục A Việc chọn phương pháp lựa chọn theo kinh nghiệm người sử dụng, sở xem xét đến mục tiêu loại chất dùng phương pháp Các quy trình khác thích hợp với điều kiện phương pháp chứng minh có hiệu lực chất nghiên cứu 3.3 Định lượng ADN Việc định lượng ADN tách chiết giúp ích cho việc phân tích PCR Việc định lượng thực bằng: phương pháp vật lý (ví dụ: đo độ hấp thụ bước sóng cụ thể), phương pháp lý-hóa (ví dụ: sử dụng thuốc thử xen kết hợp để phát xạ huỳnh quang), phương pháp emzym (ví dụ: phát phát quang sinh học), phương pháp PCR định lượng Phương pháp PCR định lượng đặc biệt thích hợp mẫu có hàm lượng ADN thấp có ADN bị phân hủy Có vài phương pháp thích hợp để định lượng ADN có mặt dung dịch, mô tả Phụ lục B Điều giúp cho người sử dụng lựa chọn phương pháp thích hợp để áp dụng, tùy thuộc vào lượng chất lượng ADN cần phân tích đồng thời phụ thuộc vào loại mẫu mà từ ADN tách ) Tại thời điểm ban hành ISO 21569 : 2005 này, tiêu chuẩn ISO 24276 chưa ban hành Đến tiêu chuẩn ISO 24276 ban hành LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn chiết Các quy trình khác thích hợp với điều kiện phương pháp chứng minh có hiệu lực chất nghiên cứu Yêu cầu chung phòng thử nghiệm Bụi phân tán sol khí nhiễm bẩn ngẫu nhiên vào ADN Vì thế, tổ chức khu vực làm việc phòng thử nghiệm phải được: - phân khu cách có hệ thống bước phương pháp có liên quan việc tạo kết - thực ngun tắc “dịng chảy xi” để xử lý mẫu Nguyên tắc đảm bảo cho ADN cần phân tích ADN khuếch đại PCR tách rời tự nhiên Chi tiết hơn, xem TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006) Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị phần mẫu thử 5.1.1 Khái quát Các biến động mẫu thử (ví dụ độ ẩm ) q trình chế biến ảnh hưởng đến số lượng chất lượng ADN tách chiết Do đó, thao tác phương pháp tách chiết ADN nêu phụ thuộc vào chất Cần có biện pháp thích hợp để đảm bảo phần mẫu thử đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm Phần mẫu thử phải có đủ cỡ mẫu phải có đủ số lượng mẫu nhỏ để đại diện cho mẫu phịng thử nghiệm (ví dụ: 000 mẫu nhỏ LOD 0,1 %) phép đưa kết luận có sở thống kê (xem ISO 21568) Vì lý thực tế/kỹ thuật, khuyến cáo không nên sử dụng cỡ mẫu g Mọi hạn chế phát sinh từ độ lớn mẫu thử làm chúng khơng có tính đại diện phải ghi lại cân nhắc phần giải thích kết Các phương pháp tách chiết ADN Phụ lục A mô tả phần mẫu thử từ 200 mg đến 500 mg, thường đủ nguyên liệu thô giàu ADN (ví dụ: bột hạt ngũ cốc nghiền nhỏ, bột) Tuy nhiên, loại chất cụ thể có chứa lượng nhỏ ADN ADN bị phân hủy lượng ADN chiết khơng đủ để phân tích Trong trường hợp cần tăng lượng mẫu thử Tiến hành tách chiết ADN hai phần mẫu thử Bảo quản chất chuẩn, mẫu phần mẫu thử theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006) phải bố trí cho bảo vệ thơng số sinh hóa cần phân tích [về chi tiết, xem TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/IEC 17025 : 1999) 5.1.2 Mẫu Tất thao tác chuẩn bị mẫu thử (ví dụ: nghiền, đồng hóa, chia, sấy khơ) phải thực phù hợp với quy trình mơ tả TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006), tránh nhiễm bẩn mẫu thay đổi thành phần mẫu Mẫu phòng thử nghiệm phải đồng trước giảm cỡ mẫu lấy phần mẫu thử Lắc kỹ bình chứa mẫu dạng lỏng để đồng hóa sản phẩm Trong trường hợp sản phẩm khơng đồng dầu thơ, kiểm tra loại bỏ hết lượng cặn khỏi bình chứa mẫu Đối với loại chất dạng rắn mà khó hịa tan nghiền để giảm cỡ hạt và/hoặc thuận tiện cho việc tách chiết ADN Trong trường hợp này, cần ý đến cỡ hạt Phần mẫu thử cần tách chiết phải có lượng hạt tối thiểu quy định ISO 21568 Các thiết bị xay/nghiền phải tinh kỹ chọn để thu số lượng hạt phân bố cỡ hạt phần mẫu thử mong muốn theo quy định ISO 21568 Nếu thành phần mẫu phòng thử nghiệm loại bỏ trước tách chiết, quy trình phải ghi lại Các loại thực phẩm dạng rắn nhão có chứa hàm lượng lipit cao thường khó nghiền đến cỡ hạt mong muốn lần Do đó, cần bổ sung vài quy trình, dùng hexan để loại bỏ lipit sau nghiền, làm đông lạnh đông khô trước nghiền Để thuận tiện cho việc xay nghiền sản phẩm dạng nhão sánh, sử dụng phương pháp xử lý sau loại mẫu cụ thể: LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - làm nóng đến nhiệt độ tối đa 40 0C; - hòa tan dung dịch lỏng thích hợp nước; - làm đơng lạnh nhiệt độ thấp -20 0C Đồng hóa tồn mẫu phịng thử nghiệm Lấy hai phần mẫu thử, có tính đến khả pha lỗng nồng độ chúng Trong suốt trình xay/nghiền, tránh làm nóng mẫu nhiệt độ tăng ảnh hưởng xấu đến chất lượng ADN tách chiết Các kỹ thuật xay/nghiền có nguy nhiễm bẩn chéo cao nên cần tránh nhiều tốt (như sử dụng kết hợp nitơ lỏng cối xay) Theo quy tắc thực hành tốt, trình phân tích phải tránh bước có sinh bụi Nếu mẫu có chứa muối, gia vị, đường bột và/hoặc chất khác mà có khả cản trở việc tách chiết cản trở việc phân tích, cần xem xét bước tinh thích hợp theo phương pháp chọn (xem Phụ lục A) Ví dụ: mẫu từ chất phức hợp, chất đích (ví dụ, lớp bột phủ cá tẩm bột) cần tách riêng để tách chiết ADN 5.2 Tách chiết/tinh ADN 5.2.1 Khái quát Cần xem xét vấn đề sau để thiết kế phương pháp tách chiết Chất lượng số lượng axit nucleic chất tách chiết phương pháp định cần có khả lặp lại khả tái lập phân tích, với điều kiện có đủ lượng axit nucleic chất để tách chiết Để thu ADN chất lượng tốt, tốt loại bỏ chất sau đây, thích hợp: - polysacarit (pectin, xenlulo, hemi-xenlulo, tinh bột, chất làm dày…) sử dụng enzym thích hợp để xử lý (ví dụ, pectinaza, xenlulaza, hemi-xenlulaza, -amylaza) chiết xuất hữu (ví dụ, CTAB/clorofom); - RNA và/hoặc protein sử dụng phương pháp xử lý thích hợp, xử lý enzym RNaza proteinaza, tương ứng; - cấu phần lipit sử dụng, ví dụ phương pháp xử lý enzym, dung mơi (ví dụ, n-hexan); - muối (ví dụ, từ dung dịch chiết xuất/dung dịch đệm phân giải, từ bước kết tủa) gây cản trở bước phân tích Đặc biệt mẫu dạng rắn khơ, thể tích dung dịch đệm chiết/phân giải cần phải phù hợp để đảm bảo ADN hịa tan CHÚ THÍCH 1: Việc tinh ADN tiến hành nhiều cách kết tủa phân đoạn, sử dụng dung môi phenol, clorofom, etanol, isopropanol, và/hoặc cách hấp thụ lên chất dạng rắn (resin trao đổi ion, silica gel gel thủy tinh, diatomat, màng…) Một vài nguyên tắc tinh ADN dùng kết hợp Nếu thích hợp, việc tách chiết tinh thực bước Cần sử dụng chất cộng kết ADN glycogen, PEG t-RNA để tăng độ thu hồi ADN suốt giai đoạn kết tủa, khơng chứa hoạt tính nucleaza chất ức chế/cạnh tranh PCR mức phát được, khơng chứa chuỗi đồng dạng với PCR nghiên cứu Đối với thực vật biến đổi gen, chất mang ADN sử dụng (ví dụ, ADN tinh dịch cá hồi cá trích) Khi sử dụng thiết bị sấy đông khô chân không để sấy khô viên ADN thu sau giai đoạn kết tủa, cần ý tránh nguy nhiễm bẩn chéo Hòa lại ADN nước dung dịch đệm cho tránh làm giảm chất lượng ADN Khi thiết lập cách chiết ADN mới, áp dụng phương pháp mô tả Phụ lục A cho loại chất mới, cần tính đến chất lượng tính nguyên vẹn ADN tách chiết sử dụng phương thức chọn phương pháp sau Một lượng biết ADN đánh dấu bổ sung vào dung dịch đệm phân giải cộng với mẫu dùng để chiết ADN Khi ADN đánh dấu chọn lượng ADN định trước đại diện cho số lượng định phiên chuỗi ADN cụ thể trộn vào chất bắt đầu chiết ADN, đảm bảo việc khơng có mặt LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn trình tự ADN tương đồng ADN đánh dấu ADN cần phân tích CHÚ THÍCH 2: Việc sử dụng ADN đánh dấu đánh giá gần vị trí thực ADN chất nền, trường hợp ADN kết hợp với thành phần khác (ví dụ, protein) Phương pháp sử dụng để đánh giá có mặt chất ức chế PCR tác động trans hịa tan có ADN tách chiết [xem TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006), TCVN 7605 : 2007 (ISO 21569 : 2005) ISO 21570] Tuy nhiên, ADN đánh dấu gây hiểu nhầm độ thu hồi, ADN đánh dấu dễ dàng tách khỏi chất so với ADN đích 5.2.2 Các phép kiểm chứng Các phép kiểm chứng đưa Bảng TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006) Các phép kiểm chứng yêu cầu tối thiểu, bao gồm kiểm chứng trắng quy trình tách chiết kiểm chứng tách chiết dương tính, bao gồm kiểm chứng môi trường 5.2.3 Kiểm chứng độ ADN: kiểm chứng nội PCR Khi thiết lập kiểu tách chiết mới, có mặt chất ức chế phản ứng PCR ADN chiết được ước tính sử dụng mẫu biết trước ADN (DNA spikes) [xem TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006), TCVN 7605 : 2007 (ISO 21569 : 2005) ISO 21570] Lượng ADN bổ sung vào không vượt mức tối đa mà PCR cung cấp phải chứa lượng xác định phiên chuỗi cần xác định Số lượng cần xác định riêng rẽ chuỗi cần xác định rõ bội số giới hạn phát Tốt nhất, nồng độ đích PCR kiểm chứng dương tính phải tương ứng với độ nhạy cần thiết phép phân tích Cần thận trọng sử dụng ADN đích nhân có nồng độ cao Khi có thể, phép kiểm chứng dương tính phải tuân thủ điều kiện mẫu thử chứa axit nucleic 5.3 Định lượng ADN tách chiết 5.3.1 Khái quát Chất lượng, số lượng tính ngun vẹn mẫu axit nucleic có ảnh hưởng đến tính phương pháp phân tích, ảnh hưởng đến kết thu Giới hạn phát phương pháp cụ thể phụ thuộc vào lượng axit nucleic sử dụng Việc định lượng ADN giúp cho việc - so sánh hiệu quy trình tách chiết ADN khác loại chất định (tính lặp lại), - đo nồng độ axit nucleic trước phân tích 5.3.2 Phạm vi áp dụng Mỗi phương pháp định lượng phải áp dụng khoảng động học, đồng thời xem xét đến độ chụm 5.3.3 Chuẩn định lượng Độ xác phương pháp định lượng phụ thuộc vào chuẩn axit nucleic dùng để hiệu chuẩn phương pháp Nếu sử dụng phương pháp nhạy với cỡ và/hoặc chất lượng phân đoạn axit nuleic, cần sử dụng chuẩn axit nucleic phù hợp với cỡ và/hoặc chất lượng axit nucleic cần phân tích Mẫu chuẩn sử dụng cần đảm bảo khả truy nguyên chất chuẩn định, thông thường chất chuẩn quốc tế chuẩn quốc gia thông qua chuỗi so sánh liên tục [xem ISO guide 30] Khi phương pháp có dùng chất xen kẽ, ADN chuẩn có khối lượng phân tử cao cần sử dụng định lượng ADN khối lượng phân tử cao ADN có khối lượng phân tử thấp cần sử dụng định lượng ADN khối lượng phân tử thấp Axit nucleic có khối lượng phân tử cao thường chứa lượng định đoạn khối lượng phân tử thấp Điều có nghĩa nhiều phương pháp định lượng ADN có độ khơng xác định cần tính đến CHÚ THÍCH: Ngồi ra, tùy thuộc vào loại chất phương pháp tách chiết, mà phần định ADN tách chiết tồn dạng sợi đơn ADN (có khả xen kẽ hơn), dẫn đến việc đánh giá mức hàm lượng ADN tổng số Trái lại, ADN sợi đơn phát tương tự phương pháp vật lý Có ba điểm (tốt lặp lại) yêu cầu để dựng đường chuẩn tốt Lượng ADN LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn chuẩn sử dụng cho điểm hiệu chuẩn phụ thuộc vào độ nhạy khoảng động học phương pháp 5.4 Tính ổn định ADN tách chiết Bảo quản ADN tách chiết điều kiện đảm bảo tính ổn định để thực phép phân tích Tránh lặp lại việc cấp đông rã đông dung dịch ADN Diễn giải Phương pháp tách chiết ADN áp dụng phải thích hợp để thu chất lượng số lượng axit nucleic theo yêu cầu để phân tích Chất lượng axit nucleic tách chiết cần đánh giá phương pháp phân tích chịu ảnh hưởng thông số chất lượng tương tự phép phân tích tiến hành axit nucleic chiết (ví dụ, phép phân tích thực PCR, bước PCR cần thực để đánh giá chất lượng ADN tách chiết được) Các thơng số tính tương thích phương pháp, xem TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006), TCVN 7605 : 2007 (ISO 21569 : 2005) ISO 21570 Báo cáo thử nghiệm Khi đưa báo cáo thử nghiệm cuối theo TCVN 7608 : 2007 (ISO 24276 : 2006), cần bao gồm thông tin bổ sung sau vào tài liệu hoạt động phòng thử nghiệm: - báo cáo mô tả sai lệch phần mẫu thử xử lý mẫu trước tách chiết axit nucleic; - cỡ mẫu thử sử dụng để tách chiết axit nucleic; - phương pháp tách chiết axit nucleic sử dụng; - quan sát đặc biệt suốt trình thử nghiệm; - thao tác không quy định tiêu chuẩn coi tùy ý mà có ảnh hưởng đến kết quả; - diễn giải kết quả; - tên người làm thực nghiệm Xử lý bảo quản số liệu đưa TCVN ISO/IEC 17025 : 2001 (ISO/IEC 17025 : 1999) sơ đồ đảm bảo chất lượng có liên quan Cần đảm bảo tính quán PHỤ LỤC A (Tham khảo) Phương pháp tách chiết ADN A.1 Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR phương pháp tách chiết ADN có sử dụng phenol/clorofom A.1 Phương pháp dựa phenol/clorofom A.1.1.1 Khái quát Phương pháp thông dụng (xem [5]) thích hợp để chiết ADN khỏi nhiều loại chất khác (xem A.1.1.8) Phenol thường thích hợp việc phá huỷ nucleaza làm biến tính protein Khi nghiên cứu loại thảo mộc (ví dụ, rau diếp, cỏ linh lăng khơ), nhiều chất ức chế phản ứng PCR đồng thời kết tủa với ADN Do đó, khả thu nhận ADN khuếch đại PCR gặp khó khăn Do tính độc hại ăn mòn phenol mà cần sử dụng phương pháp tách chiết ADN dựa CTAB và/hoặc PVP và/hoặc hấp thụ silica A.1.1.2 Tình trạng hiệu lực Phương pháp áp dụng rộng rãi tất lĩnh vực sinh học, nông học y tế suốt 40 năm qua, chưa đánh giá nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn phát sinh vật biến đổi gen thực phẩm A.1.1.3 Nguyên tắc Phương pháp bao gồm bước phân huỷ (phân huỷ nhiệt có mặt natri dodecyl sunfat hàm lượng EDTA cao) cách loại bỏ tạp chất (như phân tử ưa mỡ, chất polysacarit protein) nucleaza từ pha lỏng chứa ADN sử dụng phenol clorofom Kết tủa ADN cuối etanol, làm cô đặc ADN loại trừ muối clorofom dư Bước định phương pháp bước phân giải [5] A.1.1.4 Các yêu cầu an toàn Cần có tủ hút để xử lý chất hữu A.1.1.5 Thuốc thử A.1.1.5.1 Etanol, (C2H5OH) = 96 % phần thể tích Bảo quản sử dụng dung dịch -20 0C A.1.1.5.2 Axit axetic băng (CH3COOH) A.1.1.5.3 Kali axetat (C2H3O2K) A.1.1.5.4 Axit clohydric, (HCl) = 37 % A.1.1.5.5 Isoamyl ancol [(CH3)2CHCH2CH2OH] A.1.1.5.6 Phenol (C6H5OH) A.1.1.5.7 Clorofom (CHCl3) A.1.1.5.8 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3) A.1.1.5.9 Muối dikali axit etylendiamintetraaxetic (K2EDTA) (C10H14N2O8K2) A.1.1.5.10 Kali hydroxit (KOH) A.1.1.5.11 Kali clorua (KCl) A.1.1.5.12 Natri dodexyl sunfat (SDS) (C12H25O4SNa) A.1.1.5.13 Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat A.1.1.5.14 RNaza-A, khơng chứa DNaza từ tuyến tuỵ bị, khoảng 50 đơn vị/mg lyophilisat A.1.1.5.15 Phenol cân bằng, pH> 7,8 Sử dụng phenol cân dựa vào dung dịch đệm chiết (A.1.1.5.18) khơng có SDS, chuẩn bị theo [5], theo khuyến cáo nhà sản xuất A.1.1.5.16 Clorofom-isoamyl ancol Trộn 24 phần thể tích clorofom (A.1.1.5.7) với phần thể tích isoamyl ancol (A.1.1.5.5) A.1.1.5.17 Phenol-clorofom-isoamyl ancol Trộn phần thể tích phenol cân (A.1.1.5.15) với phần thể tích dung dịch clorofom-isoamyl ancol (A.1.1.5.16) A.1.1.5.18 Dung dịch đệm chiết/phân giải, nồng độ chất c(Tris) = 0,050 mol/l, c(K2EDTA) = 0,050 mol/l, nồng độ khối lượng (SDS) = 30 g/l Dùng HCl KOH để chỉnh pH đến 8,0 A.1.1.5.19 Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(K2EDTA) = 0,001 mol/l Dùng HCl KOH để chỉnh pH đến 8,0 A.1.1.5.20 Dung dịch proteinaza,  = 20 mg/ml, hòa tan nước vô trùng Không hấp áp lực Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.1.1.5.21 Dung dịch RNaza-A,  = 10 mg/ml lyophylisat Bảo quản - 20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.1.1.5.22 Dung dịch etanol, (C2H5OH) = 70 % Bảo quản - 20 0C LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn A.1.1.5.23 Dung dịch kali axetat, c(C2H3O2K) = mol/l Dùng axit axetic băng để chỉnh pH đến 5,2 Không hấp áp lực Lọc qua lọc cỡ lỗ 0,22 m, cần A.1.1.6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường loại sau: A.1.1.6.1 Máy ly tâm, đạt lực ly tâm tối thiểu 10 000 g Trong số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh A.1.1.6.2 Nồi cách thủy tủ ấm, làm việc dải nhiệt độ từ 60 0C đến 70 0C A.1.1.6.3 Máy sấy chân không, tùy chọn A.1.1.6.4 Máy sấy đông khô, tùy chọn A.1.1.6.5 Máy trộn, ví dụ Vortex 2) A.1.1.6.6 Bình phản ứng, bền với việc cấp đông nitơ lỏng A.1.1.7 Cách tiến hành A.1.1.7.1 Khái quát Khi phần mẫu thử chuẩn bị tiến hành quy trình tách chiết/tinh ADN Cần điều chỉnh cho thích hợp khối lượng thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu chọn A.1.1.7.2 Quy trình tách chiết Cân 0,25 g mẫu thử cho vào ống nghiệm nhỏ Cho thêm 1,6 ml dung dịch đệm chiết (A.1.1.5.18) cần cho thêm (ví dụ loại chất giàu protein), 50 l dung dịch K proteinaza (A.1.1.5.20) Ủ 60 0C đến 70 0C, thơng thường vịng 30 đến h (cũng ủ ấm qua đêm) Bổ sung RNaza A (A.1.1.5.21) đạt nồng độ cuối 0,1 g/ml Ly tâm 000 g 30 lấy phần phía cho vào ống nghiệm Cho thể tích phenol cân (A.1.1.5.15) vào phần phía trộn kỹ cách nhẹ nhàng Cho ly tâm 000 g 15 thu lấy phần phía cho vào ống nghiệm Thêm thể tích phenol-clorofom-isoamyl ancol (A.1.1.5.17) vào phần phía trộn kỹ cách nhẹ nhàng Cho ly tâm tiếp 000 g 15 thu lấy pha lỏng vào ống nghiệm Lặp lại bước nhiều lần (tùy thuộc vào loại chất nền) có lớp ngăn cách rõ ràng pha Cho thể tích clorofom/isoamyl ancol (A.1.1.5.16) vào phần phía trộn kỹ cách nhẹ nhàng Cho ly tâm tiếp 000 g 10 thu lấy pha lỏng vào ống nghiệm Lặp lại bước này, cần, có lớp ngăn cách rõ ràng pha Trộn kỹ phần phía với 0,1 thể tích dung dịch kali axetat (A.1.1.5.23) 2,5 thể tích etanol 96 % (A.1.1.5.1), trộn kỹ cách lật lên lật xuống ống nghiệm Ủ phút nitơ lỏng, h - 80 0C, để qua đêm -20 0C Ly tâm 10 000 g (hoặc đến 13 000 g) 0C 15 min, cẩn thận loại bỏ phần phía Rửa cẩn thận kết tủa ADN thể tích dung dịch etanol 70 % (A.1.1.5.22) Ly tâm 10 000 g đến 13 000 g 0C 15 min, sau cẩn thận loại bỏ phần phía Bước cần thiết để loại bỏ muối kết tủa mà làm cản trở bước phân tích (ví dụ: PCR) Sấy khơ kết tủa hịa tan lại 100 l nước dung dịch đệm thích hợp, ví dụ, dung dịch đệm TE (A.1.1.5.19) Đây dung dịch gốc ADN Thêm RNaza-A (A.1.1.5.21) đến nồng độ cuối 0,1 g/ml A.1.1.8 Danh mục ví dụ Phương pháp áp dụng thành cơng để chiết ADN 3) khỏi loại chất sau: 3) Hạt đậu tương axit hóa , cỏ linh lăng khô, bánh dùng cho trẻ nhỏ 3), sữa dành cho trẻ nhỏ 3), vi 2) Máy Vortex ví dụ sản phẩm thích hợp có bán sẵn thị trường Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm Các sản phẩm tương tự sử dụng cho kết tương tự ) Độ lặp lại phụ thuộc vào mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng Trong số trường hợp, ADN khơng tìm thấy bị biến chất làm cho kết PCR mức giới hạn phát phương pháp, mỗi/quy trình PCR sử dụng Điều nguyên nhân độ tái lập thấp phòng thử nghiệm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn khuẩn bào tử nó, hạt lúa mạch, pate thịt bò/thịt lợn 3), thịt bò 3), phomat xanh, bánh socola hạnh nhân3), ngơ đóng hộp, hạt carot, ngũ cốc đóng thành thỏi 3), phomát, gà, rau diếp, củ cải, bánh socola3), socola nhão 3), bánh quế, mứt quả, bánh ngô 3), gạo xay, váng sữa 3), hạt đậu Hàlan khô, bánh qui ngô 3), bánh khô dầu ngô, bột ngô, thức ăn gluten ngô, ngô hạt, hạt bột sắn dùng làm thức ăn chăn nuôi, bột sắn hột, thịt tươi nấu chín 3) (bị, lợn, gà, gà tây), thịt dưa, hạt dưa, thịt xay, thành phần điểm tâm 3), điểm tâm 3), giá đỗ 3), hạt yến mạch, củ khoai tây, bánh khô hạt cải dầu, glupacolza, hạt cải dầu, xúc xích (lát mỏng 3) coktail3)(xem A.1.2 phương pháp chiết cải tiến), cơtlet bê, sooie hoi sin3), viên xúp, protein đậu tương chế biến thịt 3), lecxitin đậu tương (nâu thô vàng xác định3)), giá đậu tương3), đồ uống từ đậu tương, hạt đậu tương, váng dữa đậu tương, bánh khô dầu đậu tương, đậu phụ từ đậu tương, nước sốt spaghetti 3), hạt lúa mì spenta, củ cải đường (phần thịt sấy khơ), cải đường (củ tươi), hạt củ cải đường, hạt hoa hướng dương, đậu phụ, cà chua tươi, cà chua nghiền 3), hạt cà chua, hamburger thực vật, bánh kem xốp (có3) khơng có socola3)), cám lúa mì, bột mì, thức ăn gluten lúa mì, hạt lúa mì, semolina lúa mì, sữa chua 3) (xem A.1.3 phương pháp chiết cải tiến) A.1.2 Phương pháp phenol/clorofom: Quy trình cấy khởi động xúc xích lên men A.1.2.1 Khái quát Phương pháp dùng để tách ADN tổng số, bao gồm ADN hệ gen vi khuẩn từ xúc xích Khả áp dụng phương pháp để thu ADN có chất lượng cao thích hợp cho việc phát ADN tái tổ hợp PCR chứng minh cho xúc xích lên men [6] giống xúc xích lên men xử lý nhiệt, cịn gọi xúc xích mùa hè [7] Ngồi ra, phương pháp tách chiết cịn thích hợp để tách ADN tổng số khỏi váng sữa để phát Staphylococcus aureus đặc thù chất thực phẩm [8] (Phương pháp thích hợp loại chất nêu A.1.2.8) A.1.2.2 Tình trạng hiệu lực Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm phần mẫu thử 0,4 g thực để đánh giá hiệu lực phương pháp (xem A.1.2.9) A.1.2.3 Nguyên tắc Phương pháp gồm việc thu hồi lại tế bào vi khuẩn từ chất thực phẩm cách đồng hóa mẫu xúc xích, sau cho ly tâm Phần lắng chứa khơng tế bào vi khuẩn mà hạt thịt Để phân huỷ riêng tế bào vi khuẩn, cần phá vỡ thành tế bào cách bổ sung lysozym Để tăng độ phân huỷ thành tế bào lactobacili thịt, bổ sung mutanolysin Việc phân huỷ hoàn toàn tế bào thực cách bổ sung chất làm SDS (natri dodexyl sunfat) proteinaza-K, cách chiết vài lần pha lỏng phenol và/hoặc clorofom Bước chiết phenol và/hoặc clorofom cần thiết để loại bỏ hoạt tính nucleaza chất ức chế phản ứng PCR kể chất phát sinh từ chất thực phẩm (ví dụ, haematin) Cuối thực kết tủa ADN etanol A.1.2.4 Yêu cầu an tồn Cần có tủ hút để xử lý chất hữu A.1.2.5 Thuốc thử A.1.2.5.1 Isopropanol [CH3CH(OH)CH3] A.1.2.5.2 Etanol, (C2H5OH) = 96 % Bảo quản sử dụng - 20 0C A.1.2.5.3 Axit axetic băng, (CH3COOH) A.1.2.5.4 Axit clohydric, (HCl) = 37 % A.1.2.5.5 Natri hydroxit (NaOH) A.1.2.5.6 Isoamyl ancol [(CH3)2CHCH2CH2OH] A.1.2.5.7 Phenol (C6H5OH) A.1.2.5.8 Clorofom (CHCl3) A.1.2.5.9 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3) A.1.2.5.10 Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na2EDTA)(C10H14N2O8Na2) A.1.2.5.11 Natri dodexyl sunfat (SDS)(C12H25O4SNa) A.1.2.5.12 Lysozym LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 50 000 U/mg protein (1 U tạo ΔA450 0,001/phút pH 6,24 25 0C, sử dụng huyền phù Micrococcus lysodeikticus làm chất, 2,6 ml hỗn hợp phản ứng sử dụng cm đường quang) A.1.2.5.13 Sacaroza (C12H22O11) A.1.2.5.14 Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat A.1.2.5.15 Natri axetat (C2H3O2Na) A.1.2.5.16 Phenol đG cân bằng, bão hòa với dung dịch đệm Tris/HCl (pH>7,8), chuẩn bị theo [5], theo khuyến cáo nhà sản xuất A.1.2.5.17 Clorofom-isoamyl ancol Trộn 24 phần thể tích clorofom (A.1.2.5.8) với phần thể tích isoamyl ancol (A.1.2.5.6) A.1.2.5.18 Phenol-clorofom-isoamyl ancol Chuẩn bị cách trộn 25 phần thể tích phenol cân (A.1.2.5.16) với 24 phần thể tích clorofom (A.1.2.5.8) phần thể tích isoamyl ancol (A.1.2.5.6) A.1.2.5.19 Dung dịch mutanolysin, chứa 500 U/ml 000 U/ml mutanolysin, hòa tan nước vô trùng Không hấp áp lực Bảo quản - 20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.1.2.5.20 Dung dịch lysozym, chứa 10 mg/ml, hịa tan nước vơ trùng Khơng hấp áp lực Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.1.2.5.21 Dung dịch sacaroza, (C12H22O11) = 400 g/l A.1.2.5.22 Dung dịch đệm A, c(Tris) = 0,020 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,020 mol/l, c(NaCl) = 0,1 mol/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 A.1.2.5.23 Dung dịch đệm tách chiết/phân giải, chứa phần thể tích dung dịch đệm A (A.1.2.5.22) phần dung dịch sacaroza (A.1.2.5.21) A.1.2.5.24 Dung dịch SDS, (SDS) = 250 g/l A.1.2.5.25 Dung dịch proteinaza-K, chứa khoảng 20 mg/ml, bảo quản - 20 0C, hòa tan nước vô trùng Không hấp áp lực Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.1.2.5.26 Dung dịch etanol, (C2H5OH) = 70 % Bảo quản sử dụng -20 0C A.1.2.5.27 Natri axetat, c(C2H3O2Na) = mol/l Dùng axit axetic băng để chỉnh pH đến 5,2 A.1.2.5.28 Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,001 mol/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 A.1.2.6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường loại sau: A.1.2.6.1 Dụng cụ và/hoặc vật liệu để làm nhỏ mơ (ví dụ, dao thái) A.1.2.6.2 Máy ly tâm, lực ly tâm 12 000 g Trong số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh A.1.2.6.3 Nồi cách thủy tủ ấm A.1.2.6.4 Máy sấy chân không (tùy chọn) A.1.2.6.5 Máy trộn, ví dụ: Vortex 2) A.1.2.7 Cách tiến hành A.1.2.7.1 Khái quát Khi phần mẫu thử chuẩn bị tiến hành quy trình tách chiết/tinh ADN Cần điều chỉnh cho thích hợp khối lượng thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu chọn LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn đến 000 đơn vị/mg protein A.3.1.5.2 Clorofom (CHCl3) A.3.1.5.3 Etanol, (C2H5OH) = 96 % A.3.1.5.4 Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na2EDTA)(C10H14N2O8Na2) A.3.1.5.5 Hexadexyl-trimetyl-amoni-bromua (CTAB)(C19H42BrN) A.3.1.5.6 Axit clohydric, (HCl) = 37 % A.3.1.5.7.Isopropanol [CH3CH(OH)CH3] A.3.1.5.8 Proteinaza-K (tùy chọn), khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat A.3.1.5.9 RNaza-A, khơng chứa DNaza từ tuyến tuỵ bị, khoảng 50 đơn vị/mg lyophilisat A.3.1.5.10 Natri clorua (NaCl) A.3.1.5.11 Natri hydroxit (NaOH) A.3.1.5.12 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3) A.3.1.5.13 Dung dịch -Amylaza (tùy chọn), c(-Amylaza) = 10 mg/ml Không hấp áp lực Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.3.1.5.14 Dung dịch đệm chiết CTAB, (CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 mol/l, c(Tris) = 0,1 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,02 mol/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 A.3.1.5.15 Dung dịch đệm kết tủa CTAB, (CTAB) = g/l, c(NaCl) = 0,04 mol/l A.3.1.5.16 Dung dịch natri clorua, c(NaCl) = 1,2 mol/l A.3.1.5.17 Dung dịch etanol,  (C2H5OH) = 70 % A.3.1.5.18 Dung dịch proteinaza-K (tùy chọn),  = 20 mg/ml, hòa tan nước vô trùng Không hấp áp lực Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.3.1.5.19 Dung dịch RNaza-A (tùy chọn), (RNaza-A) = 10 mg/ml Bảo quản dung dịch lỏng -20 0C A.3.1.5.20 Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,01 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,001 mol/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 A.3.1.6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường loại sau: A.3.1.6.1 Tủ sấy tủ ấm, tốt có máy lắc A.3.1.6.2 Máy ly tâm, có khả tạo lực ly tâm 12 000 g Trong số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh A.3.1.6.3 Máy trộn, ví dụ Vortex 2) A.3.1.6.4 Máy sấy chân không (tùy chọn) A.3.1.7 Cách tiến hành A.3.1.7.1 Khái quát Khi phần mẫu thử chuẩn bị tiến hành quy trình tách chiết/tinh ADN Cần điều chỉnh cho thích hợp khối lượng thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu chọn A.3.1.7.2 Chiết mẫu Cân từ 200 mg đến 300 mg mẫu thử cho vào ống nghiệm Thêm 1,5 ml dung dịch đệm chiết CTAB (A.3.1.5.14) ủ trước (65 0C) trộn (Trong số trường hợp cần lượng dung dịch đệm lớn để hòa tan chất nền) Thêm 10 l dung dịch - amylaza (A.3.1.5.13, tùy chọn), 10 l dung dịch RNaza-A (A.3.1.5.19, tùy chọn) trộn nhẹ nhàng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Ủ 30 nhiệt độ 65 0C, lắc trộn Thêm 10 l dung dịch proteinaza-K (A.3.1.5.18, tùy chọn), lắc trộn nhẹ nhàng ống nghiệm để 30 65 0C, lắc trộn (tùy chọn) Ly tâm 10 khoảng 12 000 g Chuyển phần phía sang ống nghiệm mới, thêm 0,7 thể tích đến thể tích clorofom (A.3.1.5.2) trộn kỹ Ly tâm 15 phút khoảng 12 000 g Chuyển pha phía (pha lỏng) sang ống nghiệm A.3.1.7.3 Kết tủa CTAB Cho thêm thể tích dung dịch đệm kết tủa (A.3.1.5.15) Để yên 60 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 15 khoảng 12 000 g Gạn bỏ phần phía Hịa tan ADN kết tủa cách thêm 350 l dung dịch NaCl (A.3.1.5.16) Thêm 350 l dung dịch clorofom (A.3.1.5.2) trộn kỹ Ly tâm 10 phút khoảng 12 000 g Chuyển pha lỏng sang ống nghiệm CHÚ THÍCH: Việc kết tủa CTAB không cần thiết tất loại chất nền, dùng loại chất giàu protein giàu polysacarit Việc tinh pha rắn ADN (ví dụ, cách sử dụng cột quay) có khả cho kết tương đương A.3.1.7.4 Kết tủa ADN Cho thêm 0,6 thể tích isopropanol (A.3.1.5.7), trộn kỹ cách đảo chiều ống nghiệm giữ 20 nhiệt độ phòng Ly tâm 15 12 000 g Gạn bỏ phần phía Cho thêm 500 l dung dịch etanol (A.3.1.5.17) vào ống nghiệm đảo chiều ống nghiệm vài lần Đây bước định để đảm bảo loại bỏ hết CTAB Ly tâm 10 khoảng 12 000 g Gạn bỏ phần phía Làm khơ kết tủa ADN hịa tan lại vào 100 l nước dung dịch đệm thích hợp, ví dụ, dung dịch đệm TE (A.3.1.5.20) Đây ADN gốc A.3.1.8 Danh mục ví dụ Phương pháp áp dụng thành công để tách chiết ADN 7) từ chất sau: Thức ăn dành cho trẻ nhỏ (dạng bột), thức ăn cho trẻ nhỏ, hỗn hợp làm bánh, bánh qui, viên canh thịt 7) , kẹo kẹo chanh, ngô hộp, váng sữa caramel 7), thức ăn cho gia súc, hạt ngũ cốc (gạo, lúa mì, yến mạch, lúa mạch đen, kiều mạch, kê), socola 7), kem socola 7), bánh qui socola 7), bánh qui, bia ngô 7), bánh bột ngô, váng kem làm tráng miệng, dextrosa 7), chất độn kẹo hạt dẻ, bánh pastries, cá7), thỏi cá 7), bánh từ đậu tương, cá rán kiểu Pháp, nước thịt 7), giăm bơng nấu chín, mật ong 7), đồ ăn liền, râu ngô, bột ngô, phôi ngô, thức ăn từ gluten ngô, bánh ngô, ngô, tinh bột ngô7), dầu ngô (nguyên chất) 7), protein ngô 7), hạt ngô/ngũ cốc, lõi hạt ngô, margarin 7), thịt tươi, sữa bột, sữa, thức ăn chăn ni hỗn hợp, điểm tâm 7), hạt đậu, mù tạc, bỏng ngô, khoai tây chiên, tinh bột khoai tây (nguyên chất), củ khoai tây, cải dầu, bánh từ cải dầu, dầu cải dầu (thô/ nguyên chất) 7), hạt cải dầu, lexithin đậu tương thơ 7), ăn nhanh, salami (hàm lượng chất béo cao), snack mặn (ngơ), xúc xích, chất điều vị 7), tinh bột biến tính (một số loại) 7), váng sữa chua với hành 7), bột đậu tương, phôi đỗ tương (đã bảo quản, đông lạnh), protein đỗ tương 7), đồ uống từ đậu tương 7), hạt đậu tương/ngũ cốc, đậu phụ từ đậu tương, hạt đậu tương (đã axit hoá) 7), củ cải đường, hạt củ cải đường, hạt hướng dương, surimi đậu tương 7), ngô ngọt, taco shells, tarama (trứng cá nhão), thuốc lá, tương cà chua 7), cà chua cô đặc 7), cà chua (quả), bánh ngô chiên 7), hambơgơ thực vật, bánh quế 7), tinh bột mỳ (nguyên chất), sữa chua 7) A.3.1.9 Xác nhận tính hợp lệ Các số liệu có hiệu lực Bảng A.5 xây dựng nghiên cứu cộng tác nhóm cơng tác “Xây dựng phương pháp để nhận biết thực phẩm chế biến kỹ thuật công nghệ gen” Ủy ban German Federal Health Board ứng dụng phương pháp theo Điều khoản 35 Luật Thực phẩm Đức (xem [25], [26], [27]) Các loại chất thử nghiệm khoai tây, đậu tương cà chua Các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm thực mẫu thử 100 mg Bước kết tủa CTAB cần thiết để phân tích hạt đậu tương bột đậu tương Trong nghiên cứu không thực bước có tham gia enzym Đối với nghiên cứu cộng tác hạt đậu tương, hai phòng thử nghiệm tham gia sử dụng quy trình cải biến nhiều phịng thử nghiệm thử nghiệm năm mẫu không liên tục Như 22 số 25 phòng thử nghiệm tham gia nhận dạng tất 110 mẫu Đối với nghiên cứu cộng tác khoai tây, ba mẫu nhận dạng âm tính giả mẫu dương tính giả Ba mẫu khơng đánh giá kết khơng rõ ràng hai lần lặp 7) Độ lặp lại phụ thuộc vào mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng Trong số trường hợp, ADN khơng tìm thấy bị biến chất làm cho kết PCR mức giới hạn phát phương pháp, mỗi/quá trình PCR sử dụng Điều nguyên nhân độ tái lập thấp phòng thử nghiệm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn lại Bảng A.5 - Số liệu có hiệu lực Chất Số lượng phòng Số lượng mẫu/một Số lượng mẫu thử nghiệm tham phòng thử nghiệm tổng số gia Số lượng mẫu nhận dạng Hạt đậu tương [25] 25 125 110 Khoai tây [26] 18 10 180 173 Cà chua [27] 18 90 90 A.4 Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho phản ứng PCR sử dụng phương pháp tách chiết ADN dựa silica A.4.1 Phương pháp tách chiết dựa silica A.4.1.1 Khái quát Phương pháp thích hợp để chiết ADN từ loại chất có phạm vi rộng (xem ví dụ A.4.1.8) Phương pháp dùng bước tinh ADN thu sau AND tách chiết phương pháp khác Phương pháp điều chỉnh cho thích hợp từ quy trình cơng bố [28] Phương pháp có số ưu điểm loại chất mà thích hợp, đặc biệt để tránh thuốc thử có độc tính cao Ngồi ra, quy trình thích hợp phép phân tích tay phân tích tự động lượng mẫu đưa vào nhiều, đặc biệt khơng có lớp phân cách khơng bền (như nước- clorofom) cần ly tâm với tốc độ thấp Thông thường không nên dùng phương pháp để chiết ADN khỏi loại chất giàu chất béo A.4.1.2 Tình trạng hiệu lực Phương pháp đánh giá xác nhận phòng thử nghiệm nội sử dụng để chuẩn bị ADN thơng thường nhiều phịng thử nghiệm, cho dù chưa đánh giá nghiên cứu liên phịng thử nghiệm thức Ngun tắc phương pháp ứng dụng loại kit khác nhau, thử nghiệm thành công (xem [29], [30] [31]) A.4.1.3 Nguyên tắc Phương pháp bao gồm bước phân giải (phân giả nhiệt với có mặt natri dodexyl sunfat dung dịch đệm), bước làm resin silica có mặt thuốc thử guanidin hydroclorua Nguyên tắc phương pháp việc liên kết axit nucleic với silica điều kiện hoạt độ nước thấp hiệu ứng entropi [32] Các tạp chất rửa khỏi resin isopropanol, ADN giữ lại Bước phân giải cuối dung dịch đệm muối thấp cho phép thu hồi ADN Người sử dụng tiêu chuẩn cần biết phương pháp dựa silica chịu luật quyền [33] A.4.1.4 Yêu cầu an tồn Cần có tủ hút để xử lý chất hữu A.4.1.5 Thuốc thử A.4.1.5.1 Natri clorua (NaCl) A.4.1.5.2 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3) A.4.1.5.3 Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na2EDTA)(C10H14N2O8Na2) A.4.1.5.4 Axit clohydric, (HCl) = 37 % A.4.1.5.5 Natri hydroxit (NaOH) A.4.1.5.6 Natri dodexyl sunfat (SDS)(C12H25O4SNa) A.4.1.5.7 Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat A.4.1.5.8 Guanidin hydroclorua (CH5N3-HCl) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn A.4.1.5.9 Kali clorua (KCl) A.4.1.5.10 Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) A.4.1.5.11 Kali dihydro phosphat (KH2PO4) A.4.1.5.12 Isopropanol [CH3CH(OH)CH3] A.4.1.5.13 Silica (SiO2), silicon dioxit có phân bố cỡ hạt từ 0,5 m đến 10 m (80 % từ m đến m)8) A.4.1.5.14 RNaza-A, không chứa DNaza, khoảng 100 đơn vị/mg lyophilisat A.4.1.5.15 Dung dịch proteinaza-K,  = 20 mg/ml Hịa tan enzym nước vơ trùng dung dịch đệm thích hợp mơ tả [34] Không hấp áp lực dung dịch Bảo quản - 20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.4.1.5.16 Dung dịch guanidin hydroclorua I, c(CH5N3-HCl) = mol/l Hấp áp lực tối đa 15 121 0C A.4.1.5.17 Dung dịch guanidin hydroclorua II, c(CH5N3-HCl) = mol/l Hấp áp lực tối đa 15 121 0C A.4.1.5.18 Dung dịch đệm PBS, c(NaCl) = 0,157 mol/l, c(KCl) = 0,0027 mol/l, c(Na2HPO4) = 0,010 mol/l, c(KH2PO4) = 0,0018 mol/l Chỉnh pH đến 7,5 HCl A.4.1.5.19 Huyền phù silica Cân g silica (A.4.1.5.13) cho vào ống nghiệm 50 ml thêm 50 ml dung dịch đệm PBS (A.4.1.5.18) Trộn kỹ để yên Loại bỏ phần phía cách dùng pipet để hút Thêm tiếp 50 ml dung dịch đệm PBS, trộn kỹ để yên h Hút để loại bỏ phần phía Ly tâm phút 000 g Loại bỏ phần phía lại Hòa lại cặn dung dịch guanidin-HCl II (A.4.1.5.17) đến 50 ml Sử dụng dung dịch vòng từ tháng đến tháng Lắc kỹ trước sử dụng A.4.1.5.20 Dung dịch đệm chiết TNE-SDS, c(NaCl) = 0,150 mol/l, c(Tris) = 0,002 mol/l, c(Na2 EDTA) = 0,002 mol/l, (SDS) = 10 g/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 hấp áp lực trước bổ sung SDS A.4.1.5.21 Isopropanol [CH3CH(OH)CH3] = 80 % A.4.1.5.22 Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,010 mol/l c(Na2EDTA) = 0,001 mol/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 A.4.1.5.23 Dung dịch RNaza-A, (RNaza) = 10 mg/ml Bảo quản dung dịch lỏng -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.4.1.6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường loại sau: A.4.1.6.1 Máy ly tâm, tạo lực ly tâm nhỏ 000 g Trong số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh A.4.1.6.2 Tủ sấy tủ ấm, có nhiệt độ làm việc 60 0C A.4.1.6.3 Máy lắc, đặt vào tủ sấy/tủ ấm A.4.1.6.4 Máy trộn, ví dụ: Vortex 2) A.4.1.6.5 Lọ ly tâm, 50 ml để chuẩn bị huyền phù silica A.4.1.7 Cách tiến hành A.4.1.7.1 Khái quát 8) SIGMA S-5631 ví dụ sản phẩm thích hợp có bán sẵn thị trường Thơng tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm Các sản phẩm tương tự sử dụng cho kết tương tự LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Khi phần mẫu thử chuẩn bị tiến hành quy trình tách chiết/tinh ADN Cần điều chỉnh cho thích hợp khối lượng thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu chọn A.4.1.7.2 Quy trình chiết Cân từ 200 mg đến 500 mg mẫu nghiền xay nhỏ cho vào lọ Thêm ml dung dịch đệm chiết (A.4.1.5.20) 20 l dung dịch proteinaza-K (A.4.1.5.15) Để h đến h tủ sấy 60 0C Trong suốt thời gian ủ, mẫu lắc mạnh (khoảng 250 lần/min) Ly tâm 15 000 g Chuyển 550 l phần phía vào ống nghiệm Xử lý phần vừa chuyển sang ống nghiệm l dung dịch RNaza (A.4.1.5.23) 37 0C (bước thủy phân ARN nên thực trước liên kết silica, mặt khác ARN phân giải nuleotit tạo thành gây cản trở phép đo phổ UV tiếp theo) Bổ sung thêm 55 l dung dịch guanidin-HCl I (A.4.1.5.16) 100 l huyền phù silica (A.4.1.5.19) Trộn thật kỹ vài lần Để yên ống bàn khoảng Ly tâm ống phút khoảng 800 g Gạn bỏ phần phía thêm 500 l dung dịch isopropanol (A.4.1.5.21) Đậy nắp ống trộn, dùng máy lắc (A.4.1.6.4), để hịa hồn tồn cặn Ly tâm ống khoảng 500 g Gạn bỏ phần phía làm khơ kết tủa Thêm 100 l dung dịch đệm TE (A.4.1.5.22) Trộn thật cẩn thận để hòa tan kết tủa Ủ mẫu 60 0C Ly tâm 000 g Chuyển 80 % phần phía sang ống nghiệm Chú ý không chuyển hạt silica chúng gây ức chế hoạt tính enzym (ví dụ, ADN polymeraza, enzym endonucleaza) Xử lý phần vừa chuyển sang ống nghiệm l dung dịch RNaza (A.4.1.5.23) h 37 0C, để qua đêm nhiệt độ phòng Đây dung dịch ADN gốc A.4.1.8 Danh mục ví dụ Phương pháp áp dụng thành công để tách chiết ADN 9) 9) từ loại chất sau: 9) Phôi ngô , bột ngô, thức ăn gluten ngô , ngô, tinh bột ngô biến tính 9), tinh bột ngơ ngun chất 9), hạt ngơ, lõi ngô, protein từ hạt đậu tương 9), hạt đậu tương, đậu tương, củ cải đường (củ tươi) củ cải đường (phần ruột đông lạnh), củ cải đường A.5 Chuẩn bị ADN đạt chất lượng dùng cho PCR sử dụng phương pháp tách chiết ADN dựa guanidi-clorofom A.5.1 Phương pháp dựa guanidi-clorofom A.5.1.1 Khái quát Phương pháp thích hợp để tách chiết ADN khỏi nhiều loại chất thực phẩm thức ăn chăn ni khác (xem A.5.1.8) Có thể cần đến bước tinh phụ thuộc vào mẫu A.5.1.2 Tình trạng hiệu lực Phương pháp đánh giá xác nhận phòng thử nghiệm A.5.1.3 Nguyên tắc Phương pháp bao gồm bước phân giải nhiệt phân giải enzym với có mặt natri dodecyl sunfat dung dịch đệm guanidi gây biến tính, đơi thực tiếp bước tinh sạch, điều phụ thuộc vào loại chất Các tạp chất lipit protein loại trừ cách chiết clorofom sau phân huỷ, AND kết tủa isopropanol trước tinh A.5.1.4 Các u cầu an tồn Cần có tủ hút để xử lý chất hữu A.5.1.5 Thuốc thử A.5.1.5.1 -Amylaza (tùy chọn), kiểu loại lla từ loài Bacillus, từ 500 đơn vị/mg lyophilisat đến 000 đơn vị/mg lyophilisat ) Độ lặp lại phụ thuộc vào mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng Trong số trường hợp, ADN khơng tìm thấy bị biến chất mà kết PCR thấp giới hạn phát phương pháp, quy trình/ái lực PCR sử dụng Điều nguyên nhân độ tái lập thấp phòng thử nghiệm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn A.5.1.5.2 Axit axetic băng (CH3COOH) A.5.1.5.3 Clorofom (CHCl3) A.5.1.5.4 Etanol, (C2H5OH) = 96 % A.5.1.5.5 Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na2EDTA) (C10H14N2O8Na2) A.5.1.5.6 Guanidin hydroclorua (CH5N3-HCl) A.5.1.5.7 Axit clohydric, (HCl) = 37 % A.5.1.5.8 Isopropanol [CH3CH(OH)CH3] A.5.1.5.9 Proteinaza-K, khoảng 20 đơn vị/mg lyophilisat A.5.1.5.10 RNaza-A, không chứa DNaza từ tuyến tuỵ bò, khoảng 50 đơn vị/mg lyophilisat A.5.1.5.11 Natri clorua (NaCl) A.5.1.5.12 Natri dodexyl sunfat (SDS) (C12H25O4SNa) A.5.1.5.13 Natri hydroxit, (NaOH) A.5.1.5.14 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3) A.5.1.5.15 Dung dịch -Amylaza,  = 10 mg/ml, hòa tan nước vô trùng Không hấp áp lực Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.5.1.5.16 Dung dịch etanol, (C2H5OH) = 70 % A.5.1.5.17 Dung dịch đệm chiết, c(Tris) = 0,1 mol/l, c(NaCl) = 0,15 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,05 mol/l, (SDS) = 10 g/l Dùng HCl KOH để chỉnh pH đến 8,0 A.5.1.5.18 Dung dịch guanidin hydroclorua, c(CH5N3-HCl) = mol/l Hấp áp lực sau chuẩn bị (tối đa 15 121 0C) A.5.1.5.19 Dung dịch proteinaza-K,  = 20 mg/ml, hịa tan nước vơ trùng Khơng dùng nồi hấp Bảo quản -20 0C, tránh lặp lại việc cấp đông rã đông A.5.1.5.20 Dung dịch RNaza-A,  = 10 mg/ml Bảo quản -20 0C A.5.1.5.21 Dung dịch đệm TE, c(Tris) = 0,01 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,001 mol/l Dùng HCl NaOH để chỉnh pH đến 8,0 A.5.1.6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường loại sau: A.5.1.6.1 Máy ly tâm, tạo lực ly tâm 000 g Trong số giai đoạn cần đến ly tâm lạnh A.5.1.6.2 Tủ sấy tủ ấm, tốt có trang bị máy lắc A.5.1.6.3 Máy trộn, ví dụ Vortex 2) A.5.1.7 Cách tiến hành A.5.1.7.1 Khái quát Khi phần mẫu thử chuẩn bị tiến hành quy trình tách chiết/tinh ADN Cần điều chỉnh cho thích hợp khối lượng thể tích dung dịch đệm tùy theo cỡ mẫu chọn A.5.1.7.2 Quy trình tách chiết Cân từ 200 mg đến 500 mg mẫu nghiền xay nhỏ cho vào ống nghiệm micro Thêm 1,6 ml dung dịch đệm chiết (A.5.1.5.17) ủ trước (60 0C) Thêm 10 l dung dịch RNaza-A (A.5.1.5.20) 10 l dung dịch -amylaza (A.5.1.5.15), trộn nhẹ cách lật đảo chiều ống nghiệm Để 50 60 0C lắc nhẹ Thêm 1/10 thể tích dung dịch guanidin-HCl (A.5.1.5.18) trộn máy trộn (A.5.1.6.3) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Thêm 20 l dung dịch proteinaza-K (A.5.1.5.19), trộn kỹ cách đảo chiều ống nghiệm ủ h 60 0C ủ lắc trộn nhẹ Để ống nghiệm giá đỡ 15 ly tâm 15 lực ly tâm tối thiểu 000 g Chuyển phần phía vào ống nghiệm Thêm thể tích clorofom (A.5.1.5.3) trộn máy trộn (A.5.1.6.3) Ly tâm 15 tối thiểu 000 g Chuyển phần phía vào ống nghiệm Thêm 0,6 thể tích isopropanol (A.5.1.5.8), đảo chiều ống để trộn cắm ống nghiệm vào nước đá 50 Ly tâm 20 tối thiểu 000 g Rửa chất kết tủa ml dung dịch etanol (A.5.1.5.16) ly tâm 10 tối thiểu 000 g Bước cần thiết để loại bỏ hết muối vốn gây cản trở cho việc phân tích (ví dụ, PCR) Gạn bỏ phần phía Làm khơ kết tủa hòa lại vào 100 l nước dung dịch đệm thích hợp, ví dụ: dung dịch đệm TE (A.5.1.5.21) Đây dung dịch ADN gốc Nếu cần phải có bước tinh phải tiến hành ADN gốc A.5.1.8 Danh mục ví dụ Phương pháp áp dụng thành công để chiết ADN 10) khỏi các loại chất sau: Đậu tương axit hố, ngơ hộp, thức ăn cho gia súc, sôcola 10), sôcola thanh10), váng sữa làm điểm tâm10), bánh từ đậu tương, râu ngô, bột ngô, phôi ngô10), thức ăn từ gluten ngơ10), hạt ngơ, tinh bột ngơ biến tính10), protein ngô10), hạt ngô, lõi ngô, tinh bột ngô nguyên chất 10), hạt cải dầu, xúc xích10), bột đậu tương, đậu phụ từ đậu tương, lexitin đậu tương (màu nâu thô 10) màu vàng xác định10)), protein đậu tương, hạt đậu tương, tonyu đậu tương, bánh chip ngô 10) Phương pháp không áp dụng thành công cỡ mẫu thử g dầu, maltodextrin, D-glucoza, maltitol, mannitol xylitol PHỤ LỤC B (Tham khảo) Phương pháp định lượng ADN đà tách chiết B.1 Phương pháp đo quang vùng cực tím B.1.1 Khái quát Phụ lục mô tả phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN dung dịch B.1.2 Tình trạng hiệu lực Phương pháp thử nghiệm cách rộng rãi kết công bố [35] Ví dụ phương pháp áp dụng thành cơng liên phịng thử nghiệm việc phát sinh vật biến đổi gen, Federal Office of Public Health, Bern Cantonal Laboratories of Basel and Zurich, Switzerland tổ chức B.1.3 Nguyên tắc Các axit nucleic dung dịch hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại 260 nm Vì ADN, ARN nucleotit có độ hấp thụ cực đại 260 nm, nên ADN xác định máy đo quang vùng cực tím (UV) dung dịch bị nhiễm ARN nucleotit Với lý này, nên ARN cần loại phương pháp enzym trình chiết ADN trước xác định ADN Cũng tương tự, oligonucleotit nucleotit thu từ thủy phân ARN cần loại bỏ (ví dụ, xử lý silica, A.4.1.7.2) Các oligonucleotit nucleotit sinh xử lý RNaza, khơng loại bỏ (ví dụ xử lý silica) dẫn đến việc đánh giá thừa hàm lượng ADN mẫu thử Ngoài ra, ADN xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV so với ADN xoắn đơn Vì tỷ lệ ADN xoắn đơn có dung dịch chưa biết, nên để tránh đánh giá thừa hàm lượng ADN, tất ADN có mẫu thử cần chuyển dạng xoắn đơn cách sử dụng natri hydroxit Do axit nucleic không hấp thụ bước sóng 320 nm, nên việc đọc 320 nm thông tin để xác định việc hấp thụ mẫu phân tán ánh sáng hợp chất hoạt hóa UV 10) Độ lặp lại phụ thuộc vào mẻ mẫu và/hoặc công nghệ sản xuất chúng Trong số trường hợp, ADN khơng tìm thấy bị biến chất làm cho kết PCR mức giới hạn phát phương pháp, mỗi/quy trình PCR sử dụng Điều nguyên nhân độ tái lập thấp phòng thử nghiệm LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Không cần thiết phải xây dựng đường chuẩn, hệ số tắt phân tử chọn hàm số loại axit nucleic nghiên cứu và/hoặc tình trạng nguyên vẹn chúng Tuy nhiên, việc hiệu chuẩn quang phổ kế cần kiểm tra định kỳ cách đo nồng độ dung dịch ADN đối chứng B.1.4 Phạm vi áp dụng Phương pháp áp dụng cho ADN với nồng độ từ g/ml đến 50 g/ml Trước định lượng, cần pha loãng dung dịch ADN chiết được, để đảm bảo nằm dải tuyến tính phép đo quang phổ (mật độ quang từ 0,05 đến 1) CHÚ THÍCH: Đơi hợp chất cịn dƯ (ví dụ, CTAB từ quy trình chiết ADN) gây cản trở cho việc phát sắc phổ UV 260 nm, chúng hấp thụ bước sóng B.1.5 Thuốc thử B.1.5.1 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris)(C4H11NO3) B.1.5.2 Natri hydroxit (NaOH) B.1.5.3 Axit clohydric, (HCl) = 37 % B.1.5.4 Chất mang ADN, ví dụ, Herring Sperm ADN 11) Calf Thymus ADN 11) B.1.5.5 Dung dịch chuẩn ADN Chuẩn bị 10 mg/ml dung dịch gốc ADN cách hòa tan 100 mg chất mang ADN (B.1.5.4) 10 ml dung dịch đệm (B.1.5.7) ADN hòa tan nồng độ chậm tạo thành dung dịch sánh Sau pha loãng dung dịch ADN chuẩn gốc với dung dịch đệm đến nồng độ mong muốn (ví dụ: 25 g/ml) B.1.5.6 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = mol/l B.1.5.7 Dung dịch đệm, c(Tris) = 0,01 mol/l Dùng HCl để chỉnh pH đến 9,0 B.1.6 Thiết bị, dụng cụ B.1.6.1 Máy đo phổ UV, chùm đơn, hai chùm tia mảng photo diot thích hợp B.1.6.2 Máy trộn/máy lắc,ví dụ Vortex2) B.1.6.3 Bình đo, ví dụ: cuvet/ngăn nhỏ thạch anh chất dẻo thích hợp cho việc phát UV bước sóng 260 nm Cỡ bình đo dùng xác định thể tích đo: half-micro cuvet (1 000 l), micro cuvet (400 l), ultra- micro cuvet (100 l) ống mao dẫn (3 l đến l) Đường quang cuvet chuẩn thường cm B.1.7 Cách tiến hành B.1.7.1 Đo dung dịch chuẩn ADN Việc hiệu chuẩn xác máy quang phổ kiểm chứng cách sử dụng dung dịch ADN đối chứng, sau: - để đo mẫu trắng, sử dụng dung dịch đệm (B.1.5.7) để đổ đầy bình đo; - bình đo đổ đầy dung dịch chuẩn ADN (B.1.5.5) Đo độ hấp thụ dung dịch mẫu trắng dung dịch chuẩn ADN bước sóng 260 nm bước sóng 320 nm B.1.7.2 Đo dung dịch ADN thử nghiệm có nồng độ chưa biết Đối với dung dịch mẫu trắng, trộn dung dịch đệm (B.1.5.7) dung dịch natri hydroxit (B.5.1.1.5.13), cho nồng độ chất NaOH cuối 0,2 mol/l Hỗn hợp sử dụng để đổ đầy bình đo 11) Các sản phẩm có sẵn từ hãng Sigma tương ứng D-7290 D-1501 Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm Các sản phẩm tương tự sử dụng cho kết tương tự LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Trộn dung dịch ADN thử nghiệm với dung dịch natri hydroxit cần trộn với dung dịch đệm để thu nồng độ chất NaOH cuối 0,2 mol/l Hỗn hợp sử dụng để đổ đầy bình đo Đo độ hấp thụ dung dịch mẫu trắng dung dịch chuẩn ADN gốc bước sóng 260 nm bước sóng 320 nm sau ủ phút Đọc kết ổn định sau h VÍ DỤ 1: Đối với dung dịch mẫu trắng, trộn 90 l dung dịch đệm 10 l dung dịch natri hydroxit chuyển sang bình đo 100 l VÍ DỤ 2: Đối với dung dịch ADN thử nghiệm, trộn 80 l dung dịch đệm nước, 10 l dung dịch natri hydroxit 10 l dung dịch ADN chưa biết nồng độ chuyển sang bình đo 100 l B.1.8 Đánh giá Độ hấp thụ hiệu chỉnh 260 nm thu cách lấy độ hấp thụ 260 nm trừ độ hấp thụ (OD) 320 nm (nền) Nếu độ hấp thụ chỉnh 260 nm 1, nồng độ ADN ước tính tương ứng 50 g/ml ADN xoắn kép 37 g/ml ADN xoắn đơn (tức bị biến tính natri hydroxit) Các phép đo tin cậy đòi hỏi giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm phải lớn 0,05 Cuối cùng, tính nồng độ khối lượng, , dung dịch ADN xoắn kép thử nghiệm, có tính đến biến tính hệ số pha lỗng áp dụng theo cơng thức (1): AND = F x (OD260 - OD320) x 37 (1) đó: F hệ số pha lỗng; OD260 độ hấp thụ bước sóng 260 nm; OD320 độ hấp thụ bước sóng 320 nm; 37 hệ số chuyển đổi, tính miligam mililit VÍ DỤ: Đối với hệ số pha lỗng 10 độ hấp thụ OD 260 0,658 OD320 0,040: ADN = 10 x (0,658 - 0,040) x 37 g/ml = 229 g/ml B.2 Phương pháp nhuộm ethidi bromua điện di gel agaroza B.2.1 Khái quát Phụ lục mô tả phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN dung dịch Điện di gel agaroza ADN nhuộm màu ethidi bromua (EtBr) đưa cách ước tính số lượng ADN phân tích thời điểm trạng thái tự nhiên chúng (ví dụ: độ phân huỷ, có mặt ARN dư số tạp chất) Phương pháp áp dụng lượng ADN sẵn có khơng đủ để phát đo phổ, ADN chưa đủ cịn chứa chất hấp thụ tia UV [36] Điện di gel thường không khuyến cáo để định lượng ADN bị biến tính Trong trường hợp này, áp dụng phương pháp khác B.2.2 Tình trạng hiệu lực Phương pháp áp dụng rộng rãi nhiều năm qua, chưa đánh giá nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để phát sinh vật biến đổi gen thực phẩm B.2.3 Nguyên tắc ADN tách điện di, sở điện tích phân tử lượng nó, nạp lên rây phân tử (gel agaroza) chịu tác động điện trường có mặt dung dịch đệm [37] EtBr đan xen vào ADN kích thích ánh sáng UV phát huỳnh quang da cam Do lượng huỳnh quang tỷ lệ với khối lượng ADN tổng số, nên số lượng ADN có mẫu ước tính cách so sánh huỳnh quang tạo mẫu chưa biết với dãy định lượng chuẩn Khối lượng phân tử chất chuẩn cần phải giống với khối lượng phân tử ADN cần định lượng, EtBr nhuộm màu ADN xoắn đơn ARN Để định lượng xác hàm lượng ADN, ARN phải loại bỏ phương pháp enzym B.2.4 Dải áp dụng Phương pháp áp dụng cho nồng độ ADN khoảng từ ng đến 500 ng sử dụng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn hệ thống thu nhận ảnh Các hệ thống sử dụng CCD để ghi hình nhạy B.2.5 Các yêu cầu an toàn EtBr chất gây đột biến mạnh chất gây ung thư phải xử lý thận trọng Sử dụng găng tay bắt buộc Tất dung dịch gel chứa EtBr phải khử nhiễm trước loại bỏ, xem [36] Ánh sáng UV (UV-C) nguy hiểm, đặc biệt võng mạc mắt Luôn phải đeo dụng cụ bảo vệ UV (mặt nạ) sử dụng B.2.6 Thuốc thử Điện di gel agaroza thực theo dung dịch đệm điện di TAE theo dung dịch đệm điện di TBE Thông thường, mức sinh học phân tử khơng cần loại thuốc thử mơ tả phương pháp Các dung dịch mô tả phương pháp lúc cần phải khử trùng hấp áp lực B.2.6.1 Agaroza, thích hợp cho việc điện di ADN cho việc tách cỡ phân tử ADN B.2.6.2 Axit boric (H3BO3), dùng cho hệ thống dung dịch đệm TBE B.2.6.3 Xanh bromophenol (C19H9Br4O5SNa) và/hoặc xylen xyanol FF (C25H27N2O6S2Na) B.2.6.4 Chất chuẩn định lượng ADN, có phân tử lượng thích hợp (ví dụ, linearized Lambda Phage ADN ADN phân tử lượng cao Lambda Phage ADN phân giải giới hạn ADN phân tử lượng thấp) B.2.6.5 Axit axetic băng (CH3COOH), dùng cho hệ thống dung dịch đệm TAE B.2.6.7 Muối dinatri axit etylendiamintetraaxetic (Na2-EDTA) (C10H14N2O8Na2) B.2.6.8 Ethidi bromua (EtBr) (C21H20N3Br) B.2.6.9 Glyxerol (C3H8O3) B.2.6.10 Natri axetat (C2H3O2Na), dùng cho hệ thống dung dịch đệm TAE B.2.6.11 Axit clohydric, (HCl) = 37 % B.2.6.12 Natri hydroxit (NaOH) B.2.6.13 Tris(hydroxymetyl)-aminometan (Tris) (C4H11NO3) B.2.6.14 Dung dịch đệm TAE (1x), c(Tris) = 0,050 mol/l, c(C2H3O2Na) = 20 mmol/l, c(Na2EDTA)= 0,001 mol/l Dùng NaOH axit axetic băng để chỉnh pH đến 8,0 Tốt chuẩn bị dung dịch đệm TAE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa gấp 50 lần) Nếu thấy có kết tủa loại bỏ Ngay trước sử dụng, pha lỗng dung dịch đệm điện di đậm đặc nước khử ion nước chưng cất lần, chưa khử trùng B.2.6.15 Dung dịch đệm Tris/borat (TBE) (0,5x), c(Tris) = 0,055 mol/l, c(axit boric) = 0,055 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,001 mol/l, Dùng NaOH HCl để chỉnh pH đến 8,0 Tốt chuẩn bị dung dịch đệm TBE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa gấp 10 lần) Nếu thấy có kết tủa loại bỏ Ngay trước sử dụng, pha lỗng dung dịch đệm điện di đậm đặc nước khử ion nước chưng cất lần, chưa khử trùng B.2.6.16 Dung dịch đệm nạp mẫu (5x), (glyxerol) = 50 %, (xanh bromophenol) = 2,5 g/l và/hoặc (xylen xyanol) = 2,5 g/l, hòa tan dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 B.2.6.15) B.2.6.17 Dung dịch ethidi bromua, c(EtBr) = 0,5 mg/l Tốt bảo quản dung dịch ethidi bromua dạng đậm đặc (ví dụ, 10 mg/ml) 0C nơi tối (EtBr nhạy với ánh sáng) Cũng không nên cân EtBr Dung dịch gốc cần chuẩn bị cách hịa lượng nước thích hợp vào bình chứa sẵn bột EtBr, chứa số viên EtBr cân trước Khi hòa tan EtBr cần phải tránh ánh sáng, khuấy, nhiệt độ phòng Chuẩn bị dung dịch thường khoảng h B.2.7 Thiết bị, dụng cụ B.2.7.1 Lị vi sóng nồi cách thủy LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn B.2.7.2 Dụng cụ để điện di gel agaroza, kèm theo phụ tùng nguồn lượng B.2.7.3 Đèn chiếu UV, thích hợp với bước sóng 312 nm Cách khác, sử dụng thiết bị sắc ký cột axit nucleic tùy theo hệ thống phát hệ thống thích hợp tương tự B.2.7.4 Dụng cụ đọc, ví dụ: hệ thống chụp ảnh có phim 000 ASA lọc UV đủ cho huỳnh quang phát EtBr Cách khác, sử dụng hệ thống máy quay video có camera CCD, có lọc UV (tùy chọn) phần mềm phân tích định lượng B.2.8 Cách tiến hành B.2.8.1 Khái quát Điện di gel agaroza thực theo dung dịch đệm điện di TAE theo dung dịch đệm điện di TBE Sử dụng loại dung dịch đệm để hòa tan agaroza để đổ vào bể điện di B.2.8.2 Chuẩn bị gel agaroza Gel không dày cm Nồng độ chất lượng agaroza xác định khả phân giải gel Để định lượng ADN phân tử lượng cao, sử dụng nồng độ agaroza từ g/l đến 10 g/l Để định lượng ADN phân tử lượng thấp (ví dụ, bị phân giải cắt enzym giới hạn), sử dụng nồng độ agaroza cao (đến 40 g/l) [38] Cân lượng agaroza thích hợp (B.2.6.1) cho vào dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 B.2.6.15) Đun sơi lị vi sóng nồi cách thủy (B.2.7.1), agaroza hòa tan hồn tồn Bù vào lượng thất bay lượng nước tương đương, trộn cách khuấy (khơng để lẫn bọt khí), làm nguội dung dịch đến 60 0C giữ nhiệt độ sử dụng Chuẩn bị khay đổ gel (đĩa gel) với “lược mẫu” thích hợp đặt vị trí Rót dung dịch agaroza lên khay gel đơng đặc lại nhiệt độ phịng (nên để h) B.2.8.3 Chuẩn bị mẫu ADN Trộn dung dịch mẫu ADN (ví dụ, l đến 10 l) với khoảng 20 % (đối với thể tích mẫu cuối cùng) dung dịch đệm (B.2.6.16) (ví dụ, cho 2,5 l dung dịch đệm vào 10 l mẫu ADN), trộn dùng micro pipet đưa hỗn hợp vào giếng Nếu nghi ngờ mẫu đậm đặc, nên cho thêm số dung dịch mẫu pha loãng vào gel điện di Để xác định kích thước đoạn ADN chiết được, cho dung dịch đệm mẫu (B.2.6.16) theo tỷ lệ (20 % thể tích mẫu) vào lượng thích hợp chất chuẩn khối lượng phân tử ADN (B.2.6.5) tiến hành điện di song song Để ước tính nồng độ mẫu chưa biết, cho chạy song song với mẫu chuẩn ADN Các mẫu có chứa lượng biết ADN chuẩn (B.2.6.4) (nằm dải áp dụng phương pháp: từ ng đến 500 ng) hòa tan nước dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 B.2.6.15) Khuyến cáo sử dụng chất chuẩn định lượng chứa điểm hiệu chuẩn (nghĩa lượng ADN khác nhau) B.2.8.4 Điện di mẫu Cẩn thận lấy “lược” khỏi gel Chuyển gel (cùng với đĩa gel) vào bể điện di, cho giếng nằm gần với cực âm Đổ dung dịch đệm điện di (B.2.6.14 B.2.6.15) vào đầy bể Phủ lớp dày khoảng mm loại dung dịch đệm lên lớp gel dùng micro pipet để nạp mẫu vào giếng Tiến hành điện di nhiệt độ phòng điện áp cường độ thích hợp (thơng thường nên dùng điện áp ổn định tối đa V/cm khoảng cách điện cực) Dưới điều kiện mơ tả, ADN tích điện âm di chuyển từ cực âm sang cực dương Thời gian điện di phụ thuộc vào khoảng cách di chuyển cần thiết, dòng điện cung cấp, dung dịch đệm sử dụng, thẩm thấu điện nồng độ agaroza gel B.2.8.5 Nhuộm Sau kết thúc điện di, nhuộm gel từ 15 đến 50 dung dịch ethidi bromua (B.2.6.17) nhiệt độ phòng, nên để nơi tối (và/hoặc để bể thép khơng gỉ có nắp đậy kín) lắc nhẹ Nếu cần, giảm bớt việc nhuộm màu cách khử màu gel nước từ 10 đến 30 Cách khác, để nhuộm màu sau điện di, bổ sung EtBr vào gel trước rót Trong trường hợp LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn này, EtBr bổ sung vào gel đến nồng độ cuối gel làm nguội đến 60 0C 0,01 mg/ml Nếu gel đúc với ethidi bromua, nạp mẫu chưa biết chất chuẩn ADN (B.2.6.4) vào giếng riêng biệt tạo “lược” loại gel Mặt khác, lượng ethidi bromua khác nhau, sinh kết định lượng sai Để giảm thiểu đề di chuyển EtBr gel, bổ sung số EtBr vào dung dịch đệm điện di (bể điện di) Sau điện di, thường phải rửa gel B.2.8.6 Ghi lại gel Chuyển gel lên bề mặt đèn UV ghi lại huỳnh quang ADN chụp ảnh quay video B.2.9 Đánh giá/diễn giải Hàm lượng ADN mẫu ước tính cách so sánh mẫu chưa biết với mẫu chuẩn AND đưa vào điện di song song Việc đánh giá thực trực giác tốt có hỗ trợ phần mềm định lượng để dựng đường chuẩn B.3 Phương pháp PCR tức thời (real time PCR) định lượng ADN Khi chất chiết ADN, khơng phải định lượng ADN phương pháp vật lý (ví dụ, phương pháp mơ tả Phụ lục này), độ nhạy chúng khơng đủ Trong trường hợp cần định lượng nên sử dụng phương pháp PCR tức thời (real time PCR) Phương pháp cung cấp thông tin khuếch đại PCR phân tử ADN tách mà phép đo nồng độ ADN vật lý cung cấp Về chi tiết, xem ISO 21570 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] AUSUBEL, F.M., BRENT, R., KINGSTON, R.E., MOORE, D.D., SEIDMAN, JG., SMITH, JA., STRUHL, K.: CufTent Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons (1988) (ISBN 0-471-50338X) [2] SAMBROOK, J., RUSSEL D "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (2001) (ISBN 0-87969-576-5) [3] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) ISBN 0-87969-309-6 [4] PROKISCH, J ZELENY, R., TRAPMANN, S., LE GUERN, L., SCHIMMEL, H., KRAMER, G.N, PAUWELS, J Estimation of the minimum uncertainty of DNA concentration in a genetically modified maize sample candidate certified reference material Fresenuis J Analy Chem (2001) 370(7) pp 9359 [5] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed Vol 3, Appendix E.3, Purification of nucleic acids (1987) (ISBN 0-87969-309-6) [6] Detection of a genetic modification of Lactobacillus curvatus in uncooked-meat sausage by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe L 08.00-44 In: Collection of official methods under article 35 of the Gennan Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods Federal Health Office, September 1998, revised version: state OS/2001; Berlin, Koln, Beuth Verlag GmbH [7] STRAUB, J A., HERTEL, C and HAMMES, W.P The fate of recombinant DNA in thermally treated fermented sausages Eur Food Res Technol (1999) 210, pp 62-67 [8] STRAUB, J A., HERTEL, C and HAMMES, W P A 23S rDNA-targeted polymerase chain reactionbased system for detection of Staphyloccus aureus in meat starter cultures and dairy products J Food Protect (1999) 62, pp 1150-1156 [9] LICK, S., KELLER, M., BOCKELMANN, W., HELLER, K.J Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt Milk Sci Int (1998) 51, pp 183-186 [10] LICK, S., HELLER, K.J Quantitation by PCR of yoghurt starters in a model yoghurt produced with a genetically modified Streptococcus thermophilus Milk Sci Int (1998) 53, pp 671-675 [11] Detection of a genetic modification of Streptococcus thermophilus in yoghurt by amplification of the modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe L 02.02-4 In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods Federal Health Office, September 1998, revised version: state OS/2001; Berlin, LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Koln, Beuth Verlag GmbH [12] LICK, S., KELLER, M., KRUSCH, U., HELLER, K.J Identification of starter cultures in thermally treated plain yoghurt using geneprobes and PCR J Dairy Res (1998) 63, pp 607-613 [13] VAN VAERENBERGH, B., GROOTAERT, B., MOENS, W Validation of a method for the preparation of fungal genomic DNA for Polymerase chain reaction (PCR) and Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) J Mycol Med (1995) 5, pp 133-139 [14] HAYNES, K.A., WESTERNENG, T.J., FELL J.W., MOENS, W Rapid detection and identification of pathogenic fungi by polymerase chain amplification of large subunit ribosomal DNA J Med.& Vet Mycology (1995) 33, pp 319-325 [15] GUILLAUME, G.: VERBRUGGE, D., CHASSEUR-LIBOnE, M-L., MOENS, W., COLLARD, J-M.: PCR typing of tetracycline determinants (Tet A-E) in Salmonella enterica Hadar and in the microbial community of activated sludges from hospital and urban wastewater treatment facilities in Belgium In: FEMS Microbiology Ecology, 2000, 32, pp 77-85 [16] PEDERSEN, LH., SKOUBOE, P., BOYSEN, M., SOULE, J., ROSSEN, L: Detection of Penicillium species in complex food samples using the polymerase chain reaction Int J Food Microbiol, 1997, 35(2), pp.169-77 [17] MOENS, W., Methodology for the fast design of fungal DNA probes and PCR primers In: A.Vassaroti and U Kircheim (Ed.) Biotechnology Research for Innovation, Development and Growth in Europe, ECSC-EC-EAEC Brussels, 1992, pp 421-426 [18] HAUGLAND, R.A., HECKMAN, J.L., WYMER, L.J Evaluation of differents methods for the extraction of fungal conidia by quantitative competitive PCR analysis In: J.Microbiol Methods, 1999, 37(2), pp 165-176 [19] KIM, C.S., LEE, C H., SHIN, J.S., CHUNG, Y.S., and HYUNG, N.I A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP Nucleic Acids Research, 1997, 25, No.5, pp 1085-1086 [20] BERTHELET, M., WHYTE, L.G., and GREER, C W.: Rapid, direct extraction of DNA from soils for PCR analysis using polyvinylpolypyrrolidone spin columns FEMS Microbiology Letters, 1996, 138, pp 17-22 [21] PETIT, F., CRAQUELlN, S., GUESPIN-MICHEL, J., and BUFFET-JANVRESSE, C Nucleic acid extraction from polluted estuarine water for detection of viruses and bacteria by PCR and RT -PCR analysis Res Microbiol., 1999, 150, pp 143-151 [22] WATSON, R.J., and BLACKWELL, B.: Purification and characterization of a common soil component which inhibits the polymerase chain reaction Can J Microbiol., 2000, 46, pp 633-642 [23] GRIFFITHS, R J., WHITELEY, A.S., O'DONNELL, A.G., and BAILEY, M.J.: Rapid Method for Coextraction of DNA and RNA from Natural Environments for Analysis of Ribosomal DNA- and rRNABased Microbial Community Composition Appl Environ Microbiol., 2000, 66, No 12, pp 5488-5491 [24] ROGERS, S.O and BENDICH, A.J Extraction of DNA from plant tissues Plant Molecular Biology Manual A6 (1988) pp 1-10 [25] Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of soya beans by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridisation of the PCR product with a DNA probe L 23.01.22-1, March 1998 In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Đ 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstandenl BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgVV) March 1998 Bd 1999-03 Vol 1) Berlin, K61n: Beuth Verlag GmbH [26] Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of potatoes by amplification of the modified DNA sequence using the polymerase chain reaction (PCR) and hybridization of the PCR product with a DNA probe L 24.01-01, February 1996, revised in January 1997 In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Đ 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstandenl BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgW) Jan 1997 Bd (1997-01 Vol 1) Berlin, K61n: Beuth Verlag GmbH [27] Analysis of foodstuffs: Detection of a genetic modification of tomatoes bean by amplification of the LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn modified DNA sequence by means of the polymerase chain reaction (PCR) and hybridisation of the PCR product with a DNA probe L 25.03.01-1, November 1999 In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach Đ 35 LMBG; Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstandenl BgVV (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgW) Nov 1999 Bd (1999-11 Vol 1) Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH [28] BOYLE, J.S., and LEW, A.M An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification, Trends in Genetics, Vol 11(1), p 8, 1995 [29] BRODMANN, P., EUGSTER, A., HUBNER, Ph., MEYER, R., PAULI, U., V6GELI, U and LUTHY, J Nachweis gentechnisch veranderter Roundup ReadyTM Sojabohnen mittels der Polymerase Kettenreaktion (PCR) Methodenvorpriifung im Rahmen der Subkommission 29a des Schweizerischen Lebensmittelbuches Mitt Gebiete Lebensm Hyg 1997,88, pp 722-731 [30] HUBNER, P., STUDER, E., and LUTHY, J Quantitative Competitive PCR for the Detection of Genetically Modified in Food Food Control, 1999,10, pp 353-358 [31] HUBNER, P., STUDER, E., and LuTHY, J Quantitation of genetically modified organisms in food Nat Biotechnol 1999,17, pp 1137-1138 [32] MELZAK, K.A., SHERWOOD, C.S., TURNER, R.F.B and HAYNES, C.A Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions J Colloid and Interface Science, 1996, 181, pp 635-644 [33] Patents: EP 0389063, USP5,234,809 [34] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F, and MANIATIS, T In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed, Vol 5, Appendix B 16,1989 Proteinase-K (ISBN 0-87969-509-6) [35] Swiss Food Manual, Chapter 52B, Section to 5.(2000) Eidgenossische Drucksachen und Materialzentrale, CH-5005 Bern, available on CD [36] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Vol 5, Appendix 5, (1989) Quantitation of DNA and RNA (ISBN 0-88989-509-8) [37] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T In: Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Vol 1, Chapter 6, (1989) Gel electrophoresis of DNA (ISBN 0-88989-509-8,) [38] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F and MANIATIS, T In: "Molecular Cloning: a Laboratory Manuaf' 2nd ed., Vol 1, Section 6.5, table 8.1 (1989) (ISBN 0-88989-509-8) [39] ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories [40] ISO 21569, Foodstuffs -Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Qualitative nucleic acid based methods [41] ISO 21570, Foodstuffs -Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Quantitative nucleic acid based methods [42] ISO Guide 30, Terms and definitions used in connection with reference materials MỤC LỤC Lời giới thiệu Phạm vi áp dụng Tài liệu viện dẫn Nguyên tắc 3.1 Khái quát 3.2 Tách chiết AND 3.3 Định lượng AND Yêu cầu chung phòng thử nghiệm Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị phần mẫu thử 5.2 Tách chiết/tinh AND LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê 5.3 Định lượng ADN tách chiết 5.4 Tính ổn định ADN tách chiết Diễn giải Báo cáo thử nghiệm Phụ lục A Phương pháp tách chiết AND Phụ lục B Phương pháp định lượng ADN đG tách chiết Thư mục tài liệu tham khảo LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 www.luatminhkhue.vn