PHỤ LỤC B
B.1.7.2 Đo dung dịch ADN thử nghiệm có nồng độ chưa biết
Đối với dung dịch mẫu trắng, trộn dung dịch đệm (B.1.5.7) và dung dịch natri hydroxit (B.5.1.1.5.13), sao cho nồng độ chất của NaOH cuối cùng là 0,2 mol/l. Hỗn hợp này được sử dụng để đổ đầy bình đo.
11) Các sản phẩm này có sẵn từ hãng Sigma tương ứng là D-7290 và D-1501. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương tự.
Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn
Trộn dung dịch ADN thử nghiệm với dung dịch natri hydroxit và nếu cần thì trộn với dung dịch đệm để thu được nồng độ chất của NaOH cuối cùng là 0,2 mol/l. Hỗn hợp này được sử dụng để đổ đầy bình đo.
Đo độ hấp thụ đối với dung dịch mẫu trắng và cả dung dịch chuẩn ADN gốc ở bước sóng 260 nm và bước sóng 320 nm sau khi ủ 1 phút. Đọc kết quả ổn định sau ít nhất 1 h.
VÍ DỤ 1: Đối với dung dịch mẫu trắng, trộn 90 l dung dịch đệm và 10 l dung dịch natri hydroxit và chuyển sang bình đo 100 l.
VÍ DỤ 2: Đối với dung dịch ADN thử nghiệm, trộn 80 l dung dịch đệm hoặc nước, 10 l dung dịch natri hydroxit và 10 l dung dịch ADN chưa biết nồng độ rồi chuyển sang bình đo 100 l.
B.1.8. Đánh giá
Độ hấp thụ đã được hiệu chỉnh ở 260 nm thu được bằng cách lấy độ hấp thụ ở 260 nm trừ đi độ hấp thụ (OD) ở 320 nm (nền).
Nếu độ hấp thụ đã chỉnh ở 260 nm bằng 1, thì nồng độ ADN được ước tính tương ứng là 50 g/ml đối với ADN xoắn kép hoặc 37 g/ml đối với ADN xoắn đơn (tức là bị biến tính bởi natri hydroxit).
Các phép đo tin cậy đòi hỏi các giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm phải lớn hơn 0,05.
Cuối cùng, tính nồng độ khối lượng, , của dung dịch ADN xoắn kép thử nghiệm, có tính đến sự biến tính và hệ số pha loãng được áp dụng theo công thức (1):
AND = F x (OD260 - OD320) x 37 (1) trong đó:
F là hệ số pha loãng;
OD260 là độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm; OD320 là độ hấp thụ ở bước sóng 320 nm;
37 là hệ số chuyển đổi, tính bằng miligam trên mililit.
VÍ DỤ: Đối với hệ số pha loãng là 10 và độ hấp thụ OD260 là 0,658 và OD320 là 0,040:
ADN = 10 x (0,658 - 0,040) x 37 g/ml = 229 g/ml.