Phương pháp nhuộm ethidi bromua và điện di gel agaroza 1 Khái quát

PHỤ LỤC B

B.2.Phương pháp nhuộm ethidi bromua và điện di gel agaroza 1 Khái quát

B.2.1. Khái quát

Phụ lục này mô tả phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN trong các dung dịch. Điện di gel agaroza của ADN và nhuộm màu ethidi bromua (EtBr) đưa ra cách ước tính số lượng ADN và phân tích tại cùng một thời điểm trạng thái tự nhiên của chúng (ví dụ: độ phân huỷ, sự có mặt của ARN còn dư và một số tạp chất). Phương pháp này cũng có thể áp dụng nếu lượng ADN sẵn có không đủ để phát hiện bằng đo phổ, hoặc ADN chưa đủ sạch và có thể còn chứa các chất hấp thụ tia UV [36]. Điện di gel thường không được khuyến cáo để định lượng ADN nếu nó đã bị biến tính. Trong trường hợp này, có thể áp dụng các phương pháp khác.

B.2.2. Tình trạng hiệu lực

Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trong nhiều năm qua, nhưng chưa bao giờ được đánh giá trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để phát hiện sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm.

B.2.3. Nguyên tắc

ADN tách bằng điện di, trên cơ sở điện tích và phân tử lượng của nó, khi nạp lên rây phân tử (gel agaroza) và chịu tác động của điện trường trong sự có mặt của dung dịch đệm [37].

EtBr đan xen vào ADN và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ phát huỳnh quang da cam. Do lượng huỳnh quang tỷ lệ với khối lượng ADN tổng số, nên số lượng ADN có trong mẫu có thể được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng chuẩn. Khối lượng phân tử của các chất chuẩn cần phải giống với khối lượng phân tử của ADN cần định lượng, vì EtBr cũng nhuộm màu ADN xoắn đơn và ARN. Để định lượng chính xác hơn về hàm lượng ADN, thì ARN phải được loại bỏ bằng phương pháp enzym.