PROTEIN
Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng
Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H 2 SO 4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa Carbon và hydro tham gia tạo thành CO 2 và H 2 O Còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH 3 sẽ kết hợp với H 2 SO 4 tạo thành (NH 4 ) 2 SO 4 tan trong dung dịch Đuổi
NH 3 khỏi dung dịch bằng dung dịch NaOH, đồng thời cất và thu NH 3 bằng một lượng dư
H 2 SO 4 0.1N Định lượng H 2 SO 4 0.1N dư bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó ta tính được lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu cần phân tích.
Quá trình này được tiến hành hoàn toàn trong tủ Hotte.Mẫu được cho vào bình Kjeldahl.Tùy loại nguyên liệu nhiều hay ít chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g, mẫu lỏng lấy từ 2 đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL) Thêm vào từ từ 10mL
H 2 SO 4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh quá trình vơ cơ hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm chất xúc tác Có thể dùng Se kim loại (0.05g) hoặc dùng 0.5g hỗn hợpCuSO 4 :K 2 SO 4 (1:3) Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốc quá trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác là acid perchloric HClO 4 , giải phóng oxy cho phản ứng oxy hóa.Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch Lưu ý: nếu quá trình vô cơ hóa được thực hiện đơn giản bằng cách đun trực tiếp bình Kjendahl trên bếp điện thì trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng.
Hướng dẫn sử dụng bộ vô cơ hóa mẫu
- Bật công tắc (1) và gia nhiệt trước khoảng 5 phút.
- Mang găng tay bảo hộ và nhẹ nhàng lắp bộ giữ (2) chứa các bình vô cơ hóa mẫu (4) vào.
- Cho dung dịch mẫu và chất oxy hóa (H 2 SO 4 ) vào bình vô cơ hóa mẫu.
- Đóng chặt hệ thống bằng bộ Gaskets.
- Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun.
Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, dung dịch trở nên trong suốt.Cần làm nguội trước khi lắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit 4
Chuẩn bị máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến khi màn hình hiện lên thì máy đã sẵn sàng làm việc Lấy vào erlen 10ml dung dịch H 2 SO 4 , lắp vào máy. Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sục hơi: 50%, thể tích NaOH 40%: 5 – 10mL, thời gian cất: 15 – 30 phút).
Tiến hành: Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjeldahl vào bình định mức 100, thêm nước cho đến vạch định mức Lưu ý acid H 2 SO 4 đậm đặc rất háo nước và tỏa nhiệt mạnh khi tiếp xúc với nước nên có thể làm bay hơi một phần.Vì vậy, cần làm nguội và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ ra erlen.
Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống, chú ý không lắp lệch, khí sẽ thoát ra ngoài, mất mẫu.
Tiến hành cất đạm trên máy cho đến khi NH 3 được giải phóng hoàn toàn khỏi bình
Lấy erlen ra khỏi máy sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên ống.Cho 10 giọt phenolphtalein vào bình và định phân bằng NaOH 0.1N.
Xác định hệ số hiệu chỉnh K: Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. Thủ tục hiệu chỉnh như sau:
- Gọi K là tỷ số giữa nồng độ thực tế (Ct) và nồng độ cần pha (Cp) của NaOH.
- Lấy 10mL H 2 SO 4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân bằng V (mL) NaOH 0.1N đã pha sẵn.Thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy ra được Ct và K.
Hàm lượng phần trăm Nitơ tổng có trong mẫu:
N – hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng a – số mL dung dịch chuẩn H 2 SO 4 0.1N đem hấp thụ NH 3 b – số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ m – khối lượng mẫu đem vô cơ hóa, g
V – tổng thể tích định mức dung dịch vô cơ hóa (100mL) v – thể tích dung dịch vô cơ hóa dùng chưng cất (10 mL) 0.0014 – lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H 2 SO 4 0.1N
K – hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
% Protein = % Nitrogen × 6,25(Phần lớp Protein chứa 16% N => hệ số 6,25
(100/16=6,25)) Ưu điểm của phương pháp
• Ứng dụng cho tất cả các loại thực phẩm
• Đơn giản, chi phí thấp
• Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thô (AOAC 945.01)
Nhược điểm của phương pháp
• Không phải tất cả N là protein, ngoài ra có thể xác định cả: Purine, Pyrimidine DNA, RNA, Urea, Nhiều tế bào thực vật có > 50% N phi protein, Melamine (6N/phân tử).
• Chỉ xác định được hàm lượng N tổng, không xác định được chính xác hàm lượng N protein
• Sử dụng hóa chất độc hại, thời gian tiến hành tương đối lâu.
Phương pháp biuret
Biuret và peptide phản ứng với Cu 2+ tạo thành một phức hợp có màu tím hấp thụ ánh sáng bước sóng 540nm.(Biuret là một hợp chất ngưng tụ của urea sau khi bị đốt nóng). Cường độ màu hấp thu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu.
Cách pha thuốc thử Biuret
Thuốc thử biuret được pha từ 3 dung dịch thuốc thử là dung dịch A, B và C Các dung dịch này được chuẩn bị như sau:
- Dung dịch A: 05g CuSO 4 5H 2 O hòa tan trong 495 mL nước ( dung dịch
- Dung dịch B: 10g NaKC 4 H 4 O 6 4 H 2 O hòa tan trong 490 mL nước ( dung dịch NaKC 4 H 4 O 6 4 H 2 O 2%)
- Dung dịch C: 20,5g Na 2 CO 3 và 4g NaOH hòa tan và định mức thành 1 lít dung dịch (dung dịch Na 2 CO 3 2% trong NaOH 0,1N).
Thuốc thử biuret = 1 mL dung dịch A + 1 mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C
Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH 3
Amino acid đơn và dipeptide không phản ứng
Vùng nồng độ tuyến tính là 1-5 mg/ml
Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin).
Pha 5 dung dịch protein chuẩn từ huyết thanh bò ứng với 5 nồng độ khác nhau 2, 4, 6,
8 và 10 (mg protein/ mL).Lấy 1 mL từng dung dịch protein chuẩn và 5 mL thuốc thử biuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp được lắc đều trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp sau đó được đem đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm.
Vẽ đường chuẩn: trục hoành là nồng độ protein, trục tung là độ hấp thu.
Hình 2: Phương trình đường chuẩn Xác định độ hấp thu mẫu thực phẩm
- Trích ly protein (nếu mẫu là mẫu rắn) Sau đó, ta tiến hành pha loãng mẫu sao cho nồng độ protein trong mẫu nằm trong khoảng 0 – 10 mg/mL.
- Lấy 1 mL dịch trích và 5 ml thuốc thử biuret cho vào ống nghiệm và lắc đảo trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, hỗn hợp được đem đi xác định độ hấp thu ở bước sóng
- Giá trị nồng độ protein trong mẫu được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn. Ưu điểm
• Nhanh (khoảng 30 phút), đơn giản, màu sắc ít biến đổi hơn so với các phương pháp Lowry, UV, có ít hợp chất phi protein gây ảnh hưởng nên phản ứng Biuret, không phát hiện N từ nguồn không phải peptide hoặc protein.
• Không sử dụng hó chất độc hại.
• Không nhạy bằng phương pháp Lowry.
• Cần 2 – 4 mg protein cho một lần đo.
• Các muối ammoni nồng độ cao có thể gây ảnh hưởng.
Phương pháp lowry
Cu 2+ trong môi trường kiềm sẽ tạo phức hợp với protein.Cu 2+ xúc tác oxy hóa nhóm phenol trong tyrosine và tryptophan bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic- phosphotungstic acid) => tạo ra hỗn hợp có màu.
Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry
Pha loãng mẫu (20 – 100 microgam protein)
Cho mẫu phản ứng với KNa tartate- Na 2 CO 3 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Phản ứng với CuSO 4 - KNa tartate-NaOH 10 ở nhiệt độ phòng.
Tiếp đó cho phản ứng với Folin 10 phút ở 50 0 C. Đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm. Ưu điểm:
• Tính chuyên biệt cao, nhanh và đơn giản (~1.5 giờ).
• Rất nhạy: 20-100 àg.– 50-100 x so với Biuret, 10-20 x so với UV 280 nm
• Rất nhạy cảm với thay đổi pH.
• Màu dễ bị biến đổi bởi các loại protein khác nhau (nhiều hơn so với Biuret).
• Có nhiều hợp chất gây ảnh hưởng: sucrose, lipid, đường khử, hexoamine, amino sulfate…
Phương pháp Dumas
Mẫu được đem đốt cháy ở 700- 1000 0 C sau đó được phản ứng với đồng ở 600 0 C, xác định hàm lượng protein bằng phương pháp sắc kí khí.
Mẫu đem cân cho vào thiết bị rồi đốt cháy bằng Oxy tinh khiết (toàn bộ Nito trong mẫu chuyển thành N 2 và N x O y ) rồi dẫn qua ống có chứa Cu N x O y phản ứng với Cu tạo ra
N 2 Khí sinh ra chỉ còn N 2 Dẫn vào cột sắc ki khí để xác định hàm lượng Nito. Ưu điểm:
• Không sử dụng hóa chất độc hại.
• Có thể xác định lượng protein trong mẫu trong vòng 3 phút, có thể tiến hành một lúc 150 mẫu.
Phương pháp nhuộm màu
Mẫu protein được trộn với một lượng dư biết trước chất nhuộm.Ở pH thấp, các nhóm bazơ của protein mang điện tích (+) và gắn kết tuyến tính với điện tích (-) của chất nhuộm tạo kết tủa.Phần chất nhuộm thừa sẽ được xác định bằng cách đo màu.
• Trộn protein, chất nhuộm, đệm pH 2
• Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở 470 nm
Mật độ quang của chất nhuộm gắn kết protein ≈ nồng độ chất nhuộm ban đầu – nồng độ chất nhuộm trong dịch lọc.
Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng 470nm
Các yếu tố ảnh hưởng đến nhuộm màu ion âm:
=> Phân tích protein trong sữa, bột mì, sản phẩm từ đậu nành, thịt….
PHÂN TÍCH CACBONHYDRATE
Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand
Trong môi trường kiềm các đường khử (glucoza, fructoza, mantoza ) khử oxit đồng
(2)thành oxit đồng 1 (Cu +2 →Cu +1 ).Để định lượng đường khử dùng thuốc thử Fehling: dung dịch sunfat đồng (Fehling I) và dung dịch muối xecnhet: muối kali-natri tartrate kép (Fehlinh II) hoặc gọi là Fehling A và Fehling B, theo tỉ lệ 1:1 Khi trộn Fehling I và Fehling II, đầu tiên tạo thành Cu(OH) 2 có màu xanh da trời.
Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu + trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới dạng Cu(OH) 2 Muối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu +2 thành Cu + ra kết tủa oxit đồng (Cu 2 O) có màu đỏ. Để định lượng oxit đồng I được tạo thành trước hết oxi hóa nó bằng sunfat sắt 3 hoặc sunfat kép sắt amon trong môi trường axit sunfuric, Cu + sẽ bị oxi hóa trở lại thành Cu +2 , còn Fe +3 bị khử thành Fe +2
Cu 2 O + Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2H 2 SO 4 = 2 CuSO 4 + FeSO 4 + H 2 O
Tiếp đó lượng Fe +2 tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịch KMnO 4 chuẩn độ trong môi trường axit.
10FeSO 4 + 2 KMnO 4 + 8H 2 SO 4 = 5Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + H 2 O
Dựa vào lượng KMnO 4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KMnO 4 1/30N và lượng đường khử (bảng 1) để dễ sử dụng.
+ Fehling II: 200g muối xecnhet + 150g NaOH/ 1 lít
Dung dịch Fe 2 (SO4) 3 trong axit sunfuric: 50g Fe 2 (SO4) 3 + 200ml H 2 SO 4 đậm đặc (d = 1,4)/lit Hoặc dung dịch sunfat kép sắt amoni
86g (NH 4 ) 2 SO 4 Fe 2 (SO4) 3 24H 2 O + 200g (108,7ml) H 4 SO4 d = 1,84/l
KMnO 4 1/30N; 1,06g KMnO 4 /1 lít nước cất đun sôi Nồng độ KMnO 4 được xác định bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha.
Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau: a Trong trường hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin:
Có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước.Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi) Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 –
10 g Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70 - 80°C. Chuyển toàn bộhổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít Đun cách thủy 70 - 80°C trong
35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat [Pb(C 2 H 2 O 2 )
2.3H 2 O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO 3 ) 2 ] 10%.Tránh dùng quá dư chì axetat (dùng 2 - 5ml chìaxetat).Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na 2 SO 4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút.Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô.Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. b Trong trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc
Cần chiết đường bằng rượu 70 - 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí.Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì axetat vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều. c Trường hợp mẫu chứa nhiều protein
Kết tủa protein và các tạp chất dùng dung dịch tricloacetic 10 %, sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 5 % với chỉ thị metyl đỏ (màu đỏ chuyển sang màu vàng).Thêm nước cất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc.Nước qua lọc là dung dịch đường khử cần định lượng. d Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ
Cần chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phân một phần.
Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na 2 CO 3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0.
Dung dịch mẫu sau khi đã được chuẩn bị (xem ở trên) được lấy 10 ml (0,8 – 40mg đường) cho vào bình tam giác V 100ml, thêm 5ml Fehling I và 5 ml Fehling II Đun sôi hỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên Sau khi đun sôi dung dịch vẫn giữ màu xanh biếc đặc trưng.Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ lượng Fehling cho vào không đủ.Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm lượng Fehling hoặc giảm lượng mẫu.Để yên, lọc bằng phễu lọc đường (G-4) vào bình lọc chân không benzen.Rửa bình và phễu lọc bằng nước cất nóng 3 – 4 lần Chú ý giữ phần lớn lượng oxit đồng I nằm lại trong bình tam giác và lớp oxit đồng trong bình và trên phễu luôn được phủ một lớp nước nóng để Cu 2 O khỏi bị oxi hóa bởi O 2 của không khí Hòa tan kết tủa của oxit đồng I vào bình bunzen khác bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml) dung dịch sunfat sắt 3 trong môi trường H 2 SO 4 vào bình có chứa kết tủa Cu 2 O và chuyển sang phễu lọc.Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước cất nóng Nước tráng cũng thu vào bình Định phân dung dịch bằng KMnO 4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt không mất đi trong20-30 giây.Biết lượng định phân, tra bảng suy ra lượng đường trong dung dịch thí nghiệm Làm thí nghiệm kiểm chứng song song thay dung dịch đường bằng nước cất.
Hàm lượng đường khửtính theo phần trăm (%):
Trong đó: a: sốmg glucoza tra bảng ứng với sốml KMnO 4 1/30N trừ đi sốml KMnO 4 1/30N của mẫu kiểm chứng;
V: dung tích bình định mức;
V1: lượng dung dịch mẫu thí nghiệm lấy để xác định đường khử (trong ví dụ trên 10ml) m:lượng mẫu (g) nguyên liệu thực phẩm;
1000: hệ số chuyển đổi sang mg
Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich
Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm của đường khử (glucose, fructose, mantose ) có thể khử dễ dàng đồng (II) thành oxit đồng (I) (Cu +2 →Cu +1 ) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO 4 dư (không tham gia phản ứng) tính được lượng đường khử.Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau:
Khi trộn hai dung dịch Fehling I và Fehling II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn: Đầu tiên tạo thành kết tủa đông hidroxit màu xanh da trời:
CuSO 4 +2NaOH = Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4
Sau đó Cu(OH) 2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối hòa tan có dung dịch màu xanh thẫm:
Muối trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling:
Lượng CuSO 4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường
H 2 SO 4 sẽ giải phóng ra iot tự do.
CuSO 4 + 4KI + H 2 SO 4 I 2 + CuI 2 + 2K 2 SO 4
Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng natri thiosunfat (Na 2 S 2 O 3 ) chuẩn, qua đó tính được lượng đường khử có trong dung dịch.
Dung dịch Fehling I: 34,64 g CuSO 4 5H 2 O trong 500ml H 2 O
Dung dịch Fehling II: 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H 2 O
Dung dịch KI 30%, dung dịch H 2 SO 4 25% , dung dịch Na 2 S 2 O 3 0,1N.
Cách thực hiện tương tự phương pháp Bertrand
Bước 1: Cho vào bình nón dung tích 50ml: 1ml dung dịch đường, 2ml nước cất, 1ml dung dịch Fehling I và 1ml dung dịch Fehling II
Bước 2: Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên) Sau khi đun sôi, dung dịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một lớp kết tủa đồng I oxit màu đỏ gạch là được Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào không đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm với dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng dung dịch đường.Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa đồng I oxit thì phải tăng lượng dung dịch đường, giảm nước cất (luôn đảm bảo thể tích là 5ml).
Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1ml H 2 SO 4 25% và 1ml KI 30%, lắc đều và giữ trong 20 phút.
Bước 4: Chuẩn độ I 2 tạo thành bằng Na 2 S 2 O 3 0,1N Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức sau:
Trong đó: a: số ml Na 2 S 2 O 3 0,1N dùng chuẩn độ đối chứng, b: hệ số Na 2 S 2 O 3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm, f:hệ số chỉnh nồng độ của Na 2 S 2 O 3 0,1N
3,3: hệ số chuyển thành đường
V: tổng thể tích dịch chiết từng gam nguyên liệu (ml)
V1: thể tích thí nghiệm (ml)
Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid
Trong nhiều loại rau, củ, quả các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng khá lớn saccarose cùng với đường khử.Saccarose không có tính khử nên không thể trực tiếp xác định bằng phương pháp Bertrand.Để có thể xác định saccarose bằng phương pháp này phải thủy phân saccarose thành đường khử (glucozo và fructozo).
Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử là glucose và fructose.Định lượng đường khử tạo thành cho pháp tính được lượng saccarose có trong mẫu thí nghiệm.
Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na 2 CO 3 bão hòa
Metyl đỏ 0,02% (0,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất Các thuốc thử dùng để xác định đường khử theo phương pháp Bertrand
• Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bỏ protein và chuẩn bị cho xác định đường khử cho vào bình nón 250ml)
• Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%
• Đun cách thủy hỗn hợp có ống làm lạnh bằng không khí trong 30 – 40 phút, làm nguội nhanh.
• Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch Na 2 CO 3 bão hòa đến pH 6,5 – 7,0 với chỉ thị metyl đỏ(3 giọt)
• Thêm từng giọt kiềm cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng
Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand
Chú ý: Khi xác định saccarose là các dịch chiết bằng nước có thểkết quả sẽ bị sai khác, bởi vì có một số polysacarit cao phân tử khác cũng chuyển vào dịch chiết một số phần hay hoàn toàn.Trong quá trình thủy phân những chất này cũng tạo thành các monosacarit.Do đó có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung dịch đạt 75 – 80%.
Hàm lượng saccarose của mẫu thí nghiệm được tính theo công thức:
X: hàm lượng saccarose tính theo % a: hàm lượng đường khử theo glucose của dịch đường sau khi thủy phân bằng axit (%) b:hàm lượng đường khửcủa dung dịch đường (trước khi thủy phân)
(%) 0,95: hệ số chuyển từ glucose sang saccarose.
Phương pháp định lượng saccarose
Làm trong dung dịch trước khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có góc quay cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo Các chất làm trong thường sử dụng là: Axetat chì trung tính Pb(CH 3 COO) 2 3H 2 O và axetat chì kiềm tính 2Pb(CH 3 COO) 2 Pb(OH) 2 ở dạng bột hoặc dung dịch Axetat chì lắng hàng loạt các chất như axit oxalic, oxit axit protein, saponin, các chất màu, các chất pectin, các chất màu melanoidin
Chú ý: không dùng quá lượng axetat chì vì một số kết tủa có khả năng hòa tan khi dư axetat chì như các protein Nitrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợp gồm hai dung dịch Pb(NO 3 ) 2 và NaOH 340 g Pb(NO 3 ) 2 /1 lit; 32g NaOH/1 lit dùng lượng bằng nhau (5-10 ml) Khi sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau.Chú ý: Lượng chì dư trong dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH 2 PO 4 hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc Thước đo độ đường: theo quy định thước đo độ đường trong kế chỉ 100°S khi ta hòa tan 26g đường saccaroza tinh khiết trong 100 ml nước cất và phân cực trong ống 200 mm ở 20°C.
26 g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 200 mm là ống phân cực tiêu chuẩn Khi cân mẫu với lượng cân chuẩn và phân cực kế bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước đo cho ta biết % đường trong mẫu.Trong thực tế phân tích ta có thể lấy bội số hoặc ước số của chúng Ví dụ nếu lấy13g pha trong 100ml phân cực trong ống 200 mm thì thành phần đường sẽ là P×2.
Trong đó: P – số đọc trên máy Hoặc pha 26g trong mẫu 100 ml phân cực bằng ống
100 mm thì thành phần đường cũng bằng P×2.
Dung dịch axetat chì trung tính 250g Pb(CH 3 COO) 2 3H 2 O + 50 ml nước cất, khuấy đều, lọc Nước lọc trung hòa bằng axit yếu.Pha nước cất đến khấc 1 lít Dung dịch axetat chì kiềm tính: 100g oxit chì (PbO)+ 230g axit chì trung tính +50 ml nước cất Đun sôi trong ẵ giờ để thủy phõn oxit Để nguội, lọc, pha bằng nước cất đến 1 lit (54Bx).
Dung dịch nitrat chì: 340 g Pb(NO 3 ) 2 trong 1 lit; 32g NaOH trong 1 lit
HCl 24,85 Bx: 510,57 ml HCl đậm đặc trong 1 lít
Than hoạt tính 5g/100ml, axit axetic đậm đặc, Ete etylic, bột kẽm,
4.2 Tiến hành: Xác định hàm lượng saccaroza trong đường kính
Cân 26 g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã cân trọng lượng cốc) Hòa tan đường trong cốc bằng khoảng 40 – 50 ml nước cất đã đun nóng dùng đũa thủy tinh khuấy cho đường tan hết.
Rót toàn bộ dung dịch đường sang bình định mức, rửa sạch đường trong cốc, que thủy tinh và phễu bằng một ít nước cất, chuyển tất cả vào bình định mức.
Thêm nước cất đến gần vạch định mức, để yên khoảng15-20 phút cho nhiệt độ dung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong phòng.
Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2 phút rồi lọc.Khi lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng kính thủy tinh để tránh nước bay hơi làm thay đổi nồng độ Mẻ lọc đầu đổ đi.Nước lọc phải trong suốt.Rót dung dịch vào ống phân cự 200 mm; nhớ tráng ống bằng dung dịch nước lọc 1-2 lần và rót bằng cách đẩy nhẹ trên miệng ống để tránh tạo bọt. Đậy nắp ống phân cực bằng nắp thủy tinh bằng cách đẩy nhẹ nắp trên miệng ống.Giữ yên rồi vặn nút cao su vào miệng ống.
Lau khô hai đầu ống bằng một miếng giấy lọc. Đưa ống ra ánh sáng quan sát, ống phải được nhìn thông suốt và không có bọt, nếu có bắt buộc phải làm lại Đặt ống phân cực vào máy, bật điện và bắt đầu đo.Ghi kết quả và ghi nhiệt độ t.
Hàm lượng đường saccaroza tính theo %; X
Pt : hàm lượng đường đọc được trên máy ; t : nhiệt độ
Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác
Muốn biết riêng hàm lượng của glucose và fructose, người ta phải định lượng fructose.Nếu hàm lượng các đường khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucose bằng hiệu hàm lượng đường khử và hàm lượng fructose.Trước hết phải xác định lượng đường khử tổng số, sau đó mới xác định lượng fructose.
5.1Nguyên tắc Đầu tiên oxi hóa glucose và các đường khử khác bằng dung dịch kiềm của iôt
CH 2 OH(CHOH) 4 CHO+ I 2 + 3NaOH = CH 2 OH(CHOH) 4 COONa + 2NaI + H 2 O
Trong điều kiện này, fructose không bị oxi hóa Sau đó xác định fructose bằng phương pháp Bertrand hoặc phương pháp vi lượng.
Dung dịch iot 0,2N trong KI, dung dịch NaOH 0,2N, dung dịch NaOH 5%, dung dịch
H 2 SO 4 5%, dung dịch Na 2 SO 3 5%, dung dịch methyl 0,02% (0,02g metyl đỏ(C 15 H 15 N 3 O 2 )
Các thuốc thử dùng để xác định đường khử
Cho vào bình nón 250ml 20ml dung dịch thí nghiệm (chứa không quá 20 mg glucose Trung hòa đến pH 6,5 – 7,0 Cho thêm 5ml dung dịch iot 0,2N và 2,5ml dung dịch NaOH 0,2N (thêm từng giọt).Giữ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Axit hóa dung dịch bằng 2ml H 2 SO 4 5% và loại iot dư bằng dung dịch Na 2 SO 3 5% (nhỏ từng giọt cho đến khi dung dịch mất màu vàng rơm).
Thêm vài giọt metyl đỏ và trung hòa hỗn hợp bằng NaOH 5%.Thể tích dung dịch thu được là Vđo Dịch thu được chỉ chứa fructose Phân tích fructose theo phương pháp Bertrand hoặc theo phương pháp vi lượng.
Nếu fructose được xác định theo phương pháp vi lượng thì hàm lượng đường được xác định theo công thức sau:
Trong đó: a- số ml Na 2 S 2 O 3 0,1N dùng chuẩn đội đối chứng, b - hệ số Na 2 S 2 O 3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm, f - hệ số chỉnh nồng độ của Na 2 S 2 O 3 0,1N
3,3 - hệ số chuyển thành đường
V – tổng thể tích dịch chiết từm gam nguyên liệu (ml)
20 – lượng dung dịch thí nghiệm loại các đường khử khác (trừ fructose) V1– thể tích thí nghiệm (ml)
Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid
Dưới tác dụng của acid, tinh bột bị thủy phân tạo thành đường glucose.Xác định hàm lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột.
Dung dịch HCl 5%, dung dịch NaOH 5%, dung dịch Pbb(CH 3 COO) 2 10% hoặc Pb(NO 3 ) 2 10%, dung dịch Na 2 SO 4 hoặc NaHPO 4 bão hòa.
Các thuốc thử dùng để xác định đường khử
Cân 200-250g mẫu tinh bột đã nghiền nhỏ (đã biết độ ẩm), cho vào bình cầu dung tích 100ml Cho thêm vào bình 50ml nước cất, lắc đều, giữ yên 30-45 phút, lọc, bỏ nước lọc để loại bỏ đường tan.
Rửa tinh bột bằng nước cất 2-3 lần Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột vào bình cầu chứa 25ml dung dịch HCl 5%.Đậy kín bình bằng nút cao su có nắp ống làm lạnh hồi lưu. Đun cách thủy hỗn hợp 3-5 giờ Thử sự thủy phân hoàn toàn của tinh bột bằng dung dịch iot Làm nguội, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH 5,6-6,0 (bỏ trực tiếp mẫu giấy quỳcho vào bình).
Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml Kết tủa protein bằng dung dịch chì axetat 10% Loại bỏ chì axetat bằng dung dịch Na 2 SO 4 hoặc NaHPO 4 bão hòa Thêm nước cất tới vạch mức, lắc đều và lọc. Định lượng đường glucose trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phương phápBertrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột.
Hàm lượng tinh bột được tính theo công thức sau:
X – hàm lượng tinh bột tính bằng % a – số mg glucose tra bảng tính được (ứng với số ml KMnO 4 dùng chuẩn độ mẫu thí nghiệm trừ đi sốml KMnO 4 dùng chuẩn độ mẫu đối chứng)
V1– thể tích dung dịch đường (sau khi thủy phân) lấy để xác định đường glucose (ml)
V – dung tích bình định mức
W – khối lượng mẫu thí nghiệm (mg)
0,9 – hệ số quy chuyển glucozo thành tinh bột
Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử dinitrosalicylicacid (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ được khử trong một phạm vi nhấtđịnh Dựa vào phương trình đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng đường khử của mẫu thí nghiệm.
Quy trình xử lý mẫu:
Tương tự như phương pháp Bertand
Tiến hành phản ứng và dựng đường chuẩn glucose
Sử dụng dung dịch glucose chuẩn 0.1%, mẫu và thuốc thử để chuẩn bị dãy ống nghiệm sau:
Bảng 2: Chuẩn bị dãy ống nghiệm chuẩn và mẫu Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút Sau đó, làm nguội nhanh các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với các mẫu chuẩn và mẫu trắng bằng máy quang phổ so màu.
Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu: lấy 1mL phần dịch trong cho vào ống nghiệm để xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp so màu Tùy vào nồng độ đường khử có trong mẫu mà tiến hành pha loãng mẫu hoặc chuẩn theo tỷ lệ thích hợp. Viết phương trình đường chuẩn: A = f(C), xác định hệ số tương quang R.
Dựa trên độ hấp thu đở ở bước sóng 540nm, ta có thể xác định hàm lượng đường khử có trong 1mL mẫu.Từ đó, ta có thể xác định hàm lượng đường khử trong nguyên liệu ban đầu (G, %w/w) theo công thức:
X - nồng độ đường khử (theo glucose) trong dung dịch mẫu (mg/mL)
F - hệ số pha loãng từ bình định mức Vđm - thể tích định mức dung dịch thí nghiệm m - khối lượng mẫu (g)
8 Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với KALIFERRYCYANURE
Khi cho ferrycyanure K 3 Fe(CN) 6 phản ứng với đường khử, sản phẩm thu được là ferrocyanure Dựa vào phản ứng này, ta có thể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị xanh metylen (methylen blue).
Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dùng dung dịch kiềm của sulfat đồng do không tạo tủa và phản ứng kết thúc rõ ràng.Kết quả tính toán không dựa vào phương trình lý thuyết, mà dùng công thức thực nghiệm.Độ chính xác của kết quả phụ thuộc nhiều yếu tố, nhưng trình tự tiến hành và thao tác là quan trọng nhất.
Quy trình xử lý mẫu : tương tự như phương pháp Bertrand
Chuẩn độ xác định hàm lượng đường khử
Từ m gam (hoặc mL nếu mẫu lỏng) mẫu ban đầu, chúng ta tiến hành trích ly đường khử và định mức thành 100 mL (dung dịch chứa đường khử thô).Cho vào burette dung dịch mẫu chứa đường khử đã được lọc tách tạp chất.
Cho vào erlen 10mL dung dịch K3Fe(CN)61% và 2,5mL dung dịch NaOH 2,5N Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử hoặc đường tổng từ burette, cho từng giọt một, lắc mạnh.Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferrycyanure Điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốt không màu trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure Trong trường hợp khó nhận điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị methylen blue và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc.
• Kết quả lần chuẩn độ đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1mL để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối.
• Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi.
• Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose 0,5%.
Trong thí nghiệm, gọi Vk mL dung dịch mẫu và Vg mL dung dịch glucose 0,5% cùng phản ứng với một dung dịch ferrycyanure ở một nồng độ xác định Như vậy, Vk mL dung dịch mẫu tương ứng với Vg mL dung dịch glucose 0,5% có (0,5 x Vg)/100 g glucose.
Lượng đường khử được tính bằng công thức:
Xk– lượng đường khử, g/100g hay g/100mL
Vg– thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ, mL
Vk– thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ, mL
V – thể tích bình định mức, mL (100 mL) m – lượng mẫu thí nghiệm, g hoặc Ml
8 Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với KALIFERRYCYANURE
Lipid là dẫn xuất các acid béo cao phân tử và các alcohol.Lipid thường gặp là dầu thực vật và mỡ động vật.Ở động vật, lipid phân bố chủ yếu trong mô mỡ, não, sữa…; còn ở thực vật thường tập trung ở hạt (nành, phộng, oliu, hướng dương, cám,…).
Chất béo có thể hoà tan trong ether, chloroform, hoặc các dung môi hữu cơ khác, không hòa tan trong nước.
Các phương pháp định lượng lipid:
1 Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp
Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ.Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi.Tuy nhiên, hàm lượng của chúng tương đối thấp Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô.
Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cất loại sạch dung môi hoặc tính gián tiếp tư khối lượng bã còn lại sau khi trích ly hoàn toàn lipid bằng dung môi.
Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi.Cân khoảng 5g nguyên liệu đã được nghiền nhỏ, cho vào túi giấy chuyên dùng cho bộ Soxhlet đã được sấy khô và biết khối lượng. Đặt túi giấy vào trụchiết.Lắp cốc chứa dung môi vào các vị trí cố định trên thiết bị Mở van cho nước lạnh vào ống sinh hàn.Bất công tắc bộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ trích ly Quá trình trích ly có thể tiến hành theo 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: nhúng toàn bộ trụ chiết chứa nguyên liệu vào cốc chứa dung môi, thời gian tiến hành là 2 – 3 giờ.
- Giai đoạn 2: kéo trụ chiết lên khỏi cốc dung môi và tiếp tục trích ly bằng dung môi đã hoàn lưu.
LIPID (CHẤT BÉO)
Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet
Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ.Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi.Tuy nhiên, hàm lượng của chúng tương đối thấp Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô.
Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cất loại sạch dung môi hoặc tính gián tiếp tư khối lượng bã còn lại sau khi trích ly hoàn toàn lipid bằng dung môi.
Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi.Cân khoảng 5g nguyên liệu đã được nghiền nhỏ, cho vào túi giấy chuyên dùng cho bộ Soxhlet đã được sấy khô và biết khối lượng. Đặt túi giấy vào trụchiết.Lắp cốc chứa dung môi vào các vị trí cố định trên thiết bị Mở van cho nước lạnh vào ống sinh hàn.Bất công tắc bộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ trích ly Quá trình trích ly có thể tiến hành theo 2 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: nhúng toàn bộ trụ chiết chứa nguyên liệu vào cốc chứa dung môi, thời gian tiến hành là 2 – 3 giờ.
- Giai đoạn 2: kéo trụ chiết lên khỏi cốc dung môi và tiếp tục trích ly bằng dung môi đã hoàn lưu.
Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet
Hàm lượng phần trăm chất béo tính theo công thức:
M1 là khối lượng túi giấy và mẫu ban đầu, g M2: khối lượng túi giấy và mẫu sau khi trích lipid và sấy khô, g M: khối lượng mẫu ban đầu, g
2 Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp Adam Rose- Gottlieb
Chất béo trong mẫu sữa được trích ly bằng cách bổ sung lần lược 4 dung môi khác nhau: amoniac, cồn, diethy ether và petroleum ether.Cồn và amoniac được dùng để kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt cầu béo Diethy ether được dùng để trích ly béo và các thành phần tan trong béo Petroleum ether được bổ sung vào để trích ly béo và một lượng nhỏ các thành phần tan trong béo do petroleum ether là dung môi trích ly có tính chọn lọc cao hơn so với diethyl ether.
Hỗn hợp sau khi bổ sung dung môi và khuấy đảo tách thành hai pha: pha nhẹ nằm ở trên gồm dung môi và béo, pha nặng nằm dưới gồm nước và các chất hòa tan trong nước Ta thu pha nhẹ gồm dung môi và béo, làm bay hơi dung môi ta thu được tổng béo trong mẫu sữa.
Lấy 10mL dịch sữa cho vào erlen 250mL.Sau đó bổ sung lần lược 1.5 mL dung dịch NH3 và 10mL cồn.Lắc đều hỗn hợp trong 1 phút.Thêm từ từ 25mL diethy ether và lắc đều hỗn hợp trong 10 phút.Cuối cùng, 25mL diethy ether được bổ sung và hỗn hợp được lắc đều trong 10 phút.
Chuyển toàn bộ hỗn hợp sữa và dung môi vào phễu chiết.Tráng erlen bằng petroleum ether nhiều lần nhằm trích ly hết béo còn sót lại trên thành erlen.Cho toàn bộ hỗn hợp này vào phễu chiết và để quá trình tách lớp diễn ra tự nhiên trong 30 phút.Hỗn hợp sẽ tách thành 2 pha Pha nhẹ là hỗn hợp gồm dung môi diethy ether, petroleum ether và béo, pha nặng gồm protein kết tủa, cồn, NH3và các thành phần còn lại trong sữa Thu pha nhẹ và cho vào đĩa petri Đạt đĩa petri vào trong tủ hút cho đến khi dung môi bay hơi gần hết, sau đó cho đĩa petri này vào tủ sấy đang ở chế độ sấy 102 ± 1 0 C.Sấy đến khối lượng không đổi (khoảng 1h) Sau đó đĩa petri chứa béo được làm nguội về nhiệt độ phòng và cân định lượng.
Hàm lượng chất béo có trong 100mL dịch sữa được tính theo công thức sau:
TF (total fat): hàm lượng béo trong 100mL dịch sữa(g/100mL) M:khối lượng đĩa petri và béo sau khi sấy m: khối lượng đĩa petri ban đầu v: thể tích sữa đem phân tích (10mL)
Phương pháp Chloroform- Methanol
Sử dụng methanol, chloroform hòa tan chất béo trong mẫu thực phẩm.Hỗn hợp mẫu và dung môi sẽ được tách thành hai lớp Tách lấy lớp chất béo đem đi sấy khô đến khối lượng không đổi và đi cân định lượng.
• Trộn 1g mẫu và 10ml Methanol và đồng hóa bằng cấy đảo trộn trong 1 phút.
• Bổ sung 20ml Chloroform và đồng hóa trong 2 phút.
• Lọc hỗn hợp qua giấy lọc ( dung môi hòa tan chất béo hoặc xác chất rắn )
• Bổ sung dịch lọc với 30ml hỗn hợp Chloroform-Methanol với tỷ lệ 2:1 và lọc lần hai với giấy lọc.
• Xác định thể tích dịch lọc và bổ sung dung dịch KCL 0.88 % vào dịch lọc với thể tích bằng 25% thể tích dịch lọc.
• Lúc này, hỗn hợp tách làm hai lớp: lớp dưới là dung môi hòa tan béo,lớp trên chứa KCL.Ta thu nhận lớp dung môi hòa tan béo.
• Xác định thể tích dịch trích và bổ sung nước với thể tích bằng 25% thể tích dịch trích.
• Bổ sung Na2SO4 vào hỗn hợp để loại nước.lọc hỗn hợp qua giấy lọc, Sử dụng chloroform để rửa natri sunfat trên giấy lọc. Đặt hỗn hợp chloroform - lipid trong một bình đáy tròn và loại bỏ chloroform từ lipid bằng cách sử dụng một thiết bị bay hơi quay với nhiệt độ nước dưới 50°C, ta thu được lượng lipid trong mẫu.
Phương pháp Babcook
Sử dụng H 2 SO 4 để kết tủa protein, tạo ra nhiệt và giải phóng chất béo => hỗn hợp tự tách làm hai lớp: lớp trên là chất béo, lớp dưới là những chất hào tan => đo thể tích lớp trên chứa chất béo => % chất béo trong hỗn hợp.
• Cho mẫu vào chai badcook và cho acid vào,cho phép acid chạy nhẹ nhàng xuống cổ chai,acid sẽ làm protein kết tủa,sinh nhiệt và giúp giải phóng chất béo Ly tâm hỗn hợp bằng cách lắc mạnh hỗn hợp trong 5 phút.
• Bổ sung nước vào chai để đẩy chất béo lên trên cổ chai.Thắt chặt các nút và kết hợp lắc trong 4 phút.
• Đặt chai trong cốc nước 60-63°C trong 5 phút rồi xác định thể tích chất béo bằng vạch đo trên cổ chai.
Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Lolch
Cân 1 g mẫu phân tích đã nghiền nhỏ (nếu mẫu phán tích là chất rắn) hoặc lấy 2,5-3ml (nếu mẫu phân tích là chất lỏng) vào cốc của máy li tâm (cốc có nút đậy).
Thêm vào đó 20ml hổn hợp CHCl 3 /CH 3 OH với li lệ 2:1 theo thể tích, lắc mạnh trong
1 phỳt (cú thể lắc bằng mỏy khuấy từ hoặc mỏy đồng nhất), rồi thờm vào đú 80àl HCl 6N để yên ít nhất 2 giờ, sau đó thêm 4,2ml dung dịch KCl 0,37M, lắc mạnh rồi đưa vào máy li tâm quay khoảng 10 phút, lấy ra dùng pipet loại bỏ phần trên còn phần dưới cho vào đó
10 ml dung dịch H 2 O/CH 3 OH/CHCl 3 , (dung dịch này pha sẵn theo tỉ lệ 47/48/3 theo thể tích), lắc mạnh rồi ly tâm, loại bỏ phần trên còn phần dưới lại cho 10 ml
H 2 O/CH 3 OH/CHCl 3 rồi lặp lại như trên lần 2.
Sau khi loại bỏ phần trên, phần còn lại cho vào phễu chiết, thêm vào đó một ít CHCl 3 , và nước cất lắc mạnh để lắng rồi thu hồi lấy phần dưới vào một bình cầu đã cân sẵn để biết trọng lượng Lại cho thêm CHCl 3 , và nước vào phần còn lại ở phếu chiết, lắc để thu hồi hết chất béo còn lại ở phần trên.
Phần dưới lại thu hồi vào bình cầu trên, sau đó lắp bình cầu vào một bộ cất chân không để cất đuổi CHCl 3 sau đó cho ít cồn tuyệt đối vào bình cầu và cất cho đốn khô. Phần còn lại trong binh cầu chi là chất béo Để bình cầu vào bình hút ẩm rồi cân (nếu trường hợp thấy trong bình cầu đục hoặc có cặn thì cho vào đó ít CHCl 3 , và lọc qua lớp bột amiăng, cát, bông thuỷ tinh rồi rnới cất đổ tách hết CHCl 3 ).
Hàm lượng chất béo theo % tính bằng công thức sau:
G1: trọng lượng bình cầu chứa chất béo (g)
G: trọng lượng mẫu phân tích (g)
PHÂN TÍCH VITAMIN
Caroten: Xác định caroten bằng phương pháp cột
Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi đem so màu.Đầu tiên cho một lượng nhỏ chất phân tích vào đầu cột, cho tiếp xúc với vật liệu hấp thụ, cho pha động chạy qua cột do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chất nào có ái lực mạnh hơn với pha tĩnh thì sẽ bị giữ lại lâu hơn còn những chất có ái lực yếu hơn sẽ bị pha động cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau.Sau đó lấy các cấu tử đã được tách ra đem so sánh với mẫu chuẩn.
• Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm Rửa cát qua rây bằng nước máy, rồi dùng HCl( tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm Rủa cát cho tới hết axit Rủa lại bằng nước cất, sấy khô.
• Chất hấp phụ: nhôm oxit (Al 2 O 3 )
• Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn
Cân 5g mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ nghiền kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút Để làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10g Na 2 SO 4 khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa.
Phần dưới của cột sắc ký kỹ với 5g cát sạch trong 30 phút.Để làm khô kỹ, ta cho thêm được nhồi bông thấm nước.Sau đó cột được nhồi nhôm oxyt khoảng 2/3 cột.Dùng đũa thủy tinh nén nhôm oxyt cho chặt.Trên cùng lại đặt 1 lớp bông dày 1cm.
Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký.Cho bezen vào cột đến khi thấy lớp bột không thấm benzen nữa.Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rữa chầm chậm bằng benzen đến khi không còn thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng cần chú ý cho bezen phủ ngập lớp bột vì caroten dễ bị oxy hóa bởi không khí.
Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc 100ml(tùy thể tích nước hứng được) và thêm bezen đến vạch mức, lắc nhẹ Dung dịch caroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã pha loãng 10 lần).Trong 1ml dung dịch có màu giống dung dịch azobenzen tiêu chuẩn chứa 0,00235 mg caroten.
Xác định vitamin A bằng phương pháp so màu
Vitamin A là một alcohol cao cấp chưa no có công thức hóa học như hình sau và thường kết hợp với axit béo (palmitic và stearic) tạo thành este phức tạp Vì vậy khi muốn xác định vitamin A phải xà phòng hóa cácsản phẩm, ròi xác định vitamin A trong phần không xà phòng hóa.Vitamin A được tách ra khỏi dung dịch không xà phòng hóa bằng chloroform khan và nó cho phản ứng với antimony (III) clorua tạo sản phẩm màu xanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn.
Cần 10 đến 20g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung dịch kali hydroxit 20% trong rượu etylic Đậy bình bằng nút bất có gắn ống làm lạnh và đun hồi lưu trên nồi cách thủy ở nhiệt đọ 85-90 o C trong 2 giờ để xà phòng hóa Dung dịch đã xà phòng hóa được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu chiết thêm vào phễu chiết 50ml ete etylic và lắc kĩ ( để tránh huyền phù cần chiết dịch lúc nguội và lắc mạnh ) chiết phần không xà phòng hóa ra, tiếp tục lắc và chiết lấy lớp trên vào phễu chiết thứ 2. Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3-4 lần mỗi lần 20ml nước cất cho đến khi nước rửa có phản ứng trung tính ( thử bằng giấy quỳ) Làm khô nước chiết đã rửa bằng 6gam natrisunfat khan trong 30 phút Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đun đuổi este trên nồi cách thủy.
Hòa tan cặn không xà phòng hóa thu được bằng cloroform ( sau khi đã đuổi hết este) và chuyển vào bình định mức dung tích 25ml, thêm cloroform cho đến vạch, lắc nhẹ.
Cho vào ống nghiệm ( khô,sạch,cùng màu ,cùng kích thước như ống nghiệm chứa dung dịch tiêu chuẩn) đúng 0,2ml dung dịch trong bình định mức trên, thêm 1-3 giọt anhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl 3 bão hòa lắc nhanh và để không quá 10 giây đem đo màu với ống tiêu chuẩn trong 20 giây.
Xác định vitamin C
Vitamin C(axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật Trong phân tử ascorbic chứa nhóm dienol (-COH=COH-) có tính khử mạnh vitamin C dễ bị oxy hóa thành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch.
Dựa trên tính khử mạnh của acid ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt phương pháp hóa học để định lượng nó.Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và hay dùng nhất là phương pháp cho acid ascorbic khử muối natri của 2,6 diclophenolindophenol.
Xác định vitamin C dựa trên nguyên tắc: vitamin C được chiết ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng acid acetic hoặc acid clohydric Sau đó chuẩn độ nước chiết trong môi trường axit (pH=3-4) bằng 2,6 diclophenolindophenol, rồi tính ra lượng vitamin C.
• Lượng cân sản phẩm lấy tùy thuộc vào hàm lượng vitamin C của nó.
• Có thể dùng acid oxalic 1% để tráng cối và thêm đến vạch mức, hoặc dùng acetat chì 5%(5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố.
• Dùng pipet hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin C,thêm 5ml dung dịch oxalat amoni bão hòa, 10ml nước cất và định phân bằng dung dịch 2,6 diclophenolindophenol 0,001N từ microburet cho tới xuất hiện màu hồng bền (không mất màu trong 1 phút ).
Xác định vitamin B1 bằng phương pháp so màu huỳnh quang
Vitamin B1 (thiamin) có công thức cấu
Vitamin B1 bền trong môi trường axit, ở pH = 3 nó không bị phân hủy khi đun nóng tới 120 0C Thiamin dễ tan trong trong nước, trong rượu etylic loãng, rượu metylic, trong axit axetic và không tan trong cloroform, rượu butylic, isobutylic, isoamylic ete petro, ete sunfuric.
Thiamin rất nhạy với chất oxy hóa với chất khử.Và khi bị oxy hóa nó biến thành thiocrom.Chất này dưới tác dụng tử ngoại có màu huỳnh quang xanh.Đây là cơ sở của phương pháp xác định vitamin B1 vì phản ứng oxy hóa vitamin thành thiocrom xảy ra theo đúng tỷ lệ đương lượng: một phân tử thiamin tạo thành một phân tử thiocrom.Để phản ứng trên có thể xảy ra, trước hết phải giải phóng thiamin ra khỏi mẩu bằng chế phẩm men.
• Rượu butylic, isobutylic hoặc isoamylic.Các rượu này phải không phát huỳnh quang Có thể khử chất phát huỳnh quang bằng than hoạt tính (15gam than cho một 1ml rượu) rượu trộn với than lắc 30 phút trên máy lắc,làm khan bằng CaCl2 và cất ở nhiệt độ thích hợp.
• Chế phẩm men của vi khuẩn ti penicillum, khuẩn ti pencillium được sấy khô ở nhiệt độ dưới 40o rồi chiết lấy men bằng cách nghiền khuẩn ti với một ít dung dịch natri axetat
• Dung dịch vitamin B1 tiêu chuẩn.
Cân 5-10g mẫu, nghiền kỹ trong cối sứ với 10-15ml H 2 SO 4 0,1N Chuyển cả vào bình định mức, thêm H 2 SO 4 đến 75ml.Đặt bình vào cách thủy sôi trong 45 phút, lắc đều.Để nguội bình và cho chế phẩm men vào.Đặt bình vào máy điều nhiệt ở 40 0 C trong 12 giờ.Sau đó lấy bình ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc.
Hút lấy 10ml nước lọc cho vào phễu chiết, thêm vào 20ml rượu butylic, lắc mạnh 1-2 phút.Chiết tách lớp rượu ra.Thêm vào 1ml K 3 Fe(CN) 6 dung dịch 1% và 3ml NaOH dung dịch 15%, lắc nhanh hỗn hợpvà thêm vào 10ml rượu butylic, lại lắc.Tách bỏ lớp nước, còn lớp rượu cho qua giấy lọc chứa Na 2 SO 4 khan.
Sau đó chuyển dung dịch vào ống nghiệm có cùng kích thước, cùng dung tích và màu thủy tinh giống như dãy ống tiêu chuẩn. Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thử so với dãy tiêu chuẩn trên máy huỳnh quang. Đo cường độ huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh thủy ngân, dùng kính lọc màu đen.
Bảng 3: Một số Vitamin và các phương pháp phân tích
KHOÁNG
Phương pháp định lượng Canxi (trong mẫu sữa)
Oxalate omonium sẽ làm trầm hiện hoàn toàn ion Ca có sẵn trong dung dịch nào đó nếu dung dịch thỏa mãn những điều kiện sau đây:
Dung dịch (COONH 4 ) 2 phải bão hòa sôi và được đổ vào một lần.
Làm lạnh ngay hỗn hợp sau khi nấu sôi 1 phút.
Lấy 3 chén nung trên đó đã được đánh số trước.Cân đúng trong mỗi chén nung một lượng sữa bột từ 0.5 đến 0.6 g Nung khô nhẹ cho đến khi hết bốc khói, để vào lò vô cơ hóa 1 phút. Để nguội dần.Thêm 5ml nước cất và 5 giọt HCl đậm đặc khuấy đều.Để sang một cốc thủy tinh 250ml (đã đánh số trước) và rửa với lượng tối thiểu nước Thêm vào 2 hay 3 giọt rouge dimethyl và trung hòa HCl bởi NH 4 OH 1/10.Thêm acetic acid loãng để đem pH về từ đến 5,2 (màu hồng cam). Đun sôi Trong khi khuấy dung dịch cho vào đó một lần từ 2 tới 3 ml (COONH 4 ) 2 bão hòa Đun sôi tiếp trong nửa phút (khuấy đều).Làm lạnh tức khắc bằng cách nhúng cốc thủy tinh vào một chậu nước lạnh.Để yên trong 20 đến 30 phút.
Lọc, tráng sạch cốc thủy tinh.Rửa trầm hiện bằng nước cất tới khi hết ion (COO)2 thử bằng CaCl2.
Bỏ cả giấy lọc và trầm hiện trở vào trong cốc thủy tinh ban đâu thêm 20 ml H2SO4
N Đun đến chừng 70 0 Dịnh phân (COOH)2 sinh ra bằng KMnO4 N/50
Tính ra gram lượng Ca chứa trong 100 g sữa bột.
Phương pháp phân tích mangan
• Dùng phương pháp so màu chuẩn độ bằng dung dịch kali pemanganat 0.01 N.
• Lấy mẫu: lấy mẫu để phân tích mangan không nhỏ hơn 250ml Mẫu không xác định ngay mà cần pải cố đinh bằng 3ml acid nitric hoặc 5ml acid clohidric tỷ lệ 1.1 trong 1000ml nước cho đến pH=2 Mẫu đã cố định có thể sử dụng trong một tháng.
• Dùng kali pesunfat và chất xúc tác là ion Ag+ trong môi trường acid để oxy hóa Mn2+ đến MnO4- Kết quả đucợ xác định trên máy đo màu hoặc so màu chuẩn độ bằng dung dịch kali pemanganat 0.01 N.
NƯỚC
Nhiệt độ
Để xác định nhiệt độ của nước, người ta thường dùng nhiệt kế thủy ngân có chia độ từ 0-50o
C).Muốn xác định nhiệt độ của nước ở tầng mặt, ta đặc bầu thủy ngân của nhiệt kế vào trong nước ở độ sâu 15-20 cm, cho đến khi nhiệt độ trong nhiệt kế không đổi (khoảng 5 phút), sau đó nghiêng nhiệt kế và đọc nhiệt độ của nước xong mới lấy nhiệt kế lên khỏi mặt nước.
Muốn xác định nhiệt độ của nước ở tầng giữa hay tầng đáy của thủy vực, ta cắm nhiệt kế vào nắp bình thu mẫu nước, thả bình xuống đúng vị trí cần xác định nhiệt độ, cho nước vào đầy bình, để yên 5 phút sau đó kéo lên và đọc ngay nhiệt độ nước ở tầng đó.
Chúng ta cũng có thể đo nhiệt độ bằng máy, hiện nay một số máy đo pH hay máy đo
DO được chế tạo có thể đo được cả chỉ tiêu nhiệt độ.
Độ pH
Giấy được tẩm dung dịch chỉ thị màu thích hợp, sấy khô cho vào hộp sử dụng Khi được thấm ướt giấy sẽ hiện màu.Tùy thuộc pH của nước, giấy sẽ hiện màu khác nhau.Sau đó đem so màu với bảng màu tiêu chuẩn kèm theo trên nắp hộp, ta sẽ biết được pH của nước.
2.2 Phương pháp điện thế - máy đo pH
Ion H+ hoạt động (pH) được xác định trực tiếp bằng phép đo điện thế Sức điện động
E của tế bào Galvanic có liên quan đến hoạt động của ion H+ trong dung dịch theo phương trình Nernt Điện thế sinh ra từ tế bào tỷ lệ với nồng độ ion H+ trong mẫu nước, điện thế này được đo bằng một điện thế kế và được thiết bị đặc biệt dịch sang trị số pH hiện trên màn ảnh của máy.
Tế bào Galvanic bao gồm 1 điện cực thủy tinh, và 1 điện cực Calomel tiếp xúc với mẫu nước bằng một tia Amiăng ở cuối điện cực Khi tiếp xúc với mẫu nước, ở điện cực Calomel sẽ xảy ra phản ứng:
H g2Cl + 2e - ⇔ 2Hg + 2Cl - Điện cực thủy tinh gồm 1 điện cực Ag - AgCl ngâm trong dung dịch HCl 0,1M và được bao bọc bởi 1 màng thủy tinh có độ nhạy cảm rất cao với ion H+
.Điện thế này của điện cực sẽ xuất hiện khi ion H+ được màng thủy tinh hấp thụ.Sự hấp thụ 1 ion H+ trên màng thủy tinh sẽ phóng thích 1 ion Li+ từ màng thủy tinh vào dung dịch điện cực.
Theo Peters (1975) thì tế bào Galvanic đối với việc xác định pH có thể được viết như sau:
Ag / AgCl, HCl (0.1M) / màng thủy tinh / mẫu nước / Hg2Cl2, KCl / Hg
Tất cả điện thế trong tế bào Galvanic đều không thay đổi, trừ điện thế giữa màng thủy tinh - mẫu nước và giữa mẫu nước - dung dịch KCl trong điện cực Calomel.
Độ trong (Transparency), độ đục (Turbidity)
Có nhiều cách xác định trong và độ đục của nước, nhưng kỹ thuật phổ biến nhất cho việc nuôi thủy sản là sử dụng đĩa secchi để đo độ trong Độ đục có thể được đo chính xác bằng cách sử dụng máy đo độ đục theo phương pháp Nephelometric Ngoài ra có thể xác định lượng vật chất lơ lửng trong nước thông qua lượng chất rắn hoà tan (TDS) và tổng lượng chất rắn lơ lửng (TSS).
3.1 Đo độ trong bằng đĩa Secchi Đĩa secchi dạng hình tròn làm bằng vật liệu không thấm nước (inox, thiếc, tole ) chia đĩa làm 4 phần đều nhau, sơn hai màu đen và trắng xen kẽ nhau Đĩa được treo trên một que hay trên một sợi dây có đánh dấu khoảng cách mỗi khoảng chia là 5 hoặc 10cm.
Khi đo, cầm đầu dây thả từ từ cho đĩa ngập nước và ghi nhận lần 1 khoảng cách từ mặt nước đến đĩa khi không còn phân biệt được hai màu đen trắng trên mặt đĩa.Sau đó cho đĩa secchi sâu hơn vị trí vừa rồi và kéo lên đến khi vừa phân biệt được hai màu đen trắng, ghi nhận khoảng cách lần 2. Độ trong của nước ao đo bằng đĩa secchi là trung bình của hai lần ghi nhận khoảng cách.
3.2 Đo độ đục bằng phương pháp Nephelometric
Thiết bị đo độ đục có các bộ phận dò ánh sáng được đặt ở vị trí vuông góc (90o
) so với chùm tia tới được gọi là máy đo ánh sáng khuếch tán.
Phương pháp này được dựa trên việc so sánh cường độ ánh sáng tán sắc của mẫu (trong điều kiện xác định) với cường độ ánh sáng khuếch tán của mẫu chuẩn đối chứng trong điều kiện tương tự Cường độ ánh sáng khuếch tán càng cao thì độ đục càng cao.Formazin polymer được sử dụng làm chất lơ lững trong mẫu chuẩn.Độ đục của nồng độ chất lơ lững bằng formazin được xác định đến 4000 NTU Ngoài ra, một số thiết bị đo độ đục được thiết kế để xác định độ đục theo đơn vị mg/L (Model QWC-22A-TOA, Nhật) Chất lơ lững tiêu chuẩn được sử dụng làm dung dịch đối chứng làKaolin tinh chế (theo hệ thống công nghiệp Nhật bản-JIS) Có thể đo độ đục dễ dàng bằng các máy đo nêu trên.
Tổng chất rắn hòa tan (TDS) và tổng chất rắn lơ lửng (TSS)
Chất rắn hiện diện trong nước bao gồm vật chất hòa tan và không hoà tan Để đo được tổng lượng chất rắn hoà tan (TDS) Mẫu cần được lọc để loại bỏ vật chất không hoà tan, và nước đã được lọc cho bốc hơi và phần còn lại được cân để tính hàm lượng chất rắn hòa tan Tổng lượng chất rắn hòa tan bao gồm vật chất hữu cơ và vô cơ hoà tan,biểu thị bằng mg/L.
Tổng lượng chất rắn lơ lửng (TSS) được tính bằng cách cân trọng lượng những chất còn lại trên giấy lọc được sử dụng khi lọc nước phân tích chất rắn hoà tan TSS biểu thị lượng vật chất không hòa tan lơ lửng trong nước và được biểu thị là mg/L Vật liệu và dụng cụ dùng phân tích tổng chất rắn hòa tan và tổng chất rắn lơ lửng gồm: Giấy lọc sợi thủy tinh, tủ nung 550o
C, bình làm nguội hút ẩm, hệ thống lọc chân không cân phân tích.
4.1 Tổng chất rắn hòa tan TDS (Total dissolved Solid)
Thu mẫu vào bình 1 lít và đậy kín Bảo quản lạnh 4o
C Ngâm giấy lọc thủy tinh trong
24 giờ, sau đó sấy khô
Nung cốc sứ (đĩa sành) ở nhiệt độ 550o
C trong 30 phút, sau đó làm nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của cốc sứ (W1)
Lọc nước bằng hệ thống lọc chân không.Lấy100mL đã được lọc cho vào cốc sứ đã được chuẩn bị sẵn. Đặt cốc sứ vào tủ sấy ở nhiệt độ 95o
C.Sau đó gia tăng nhiệt độ lên 105o
Làm nguội đĩa và cân trọng lượng 2 (W2)
Tổng lượng chất rắn hòa tan được tính theo công thức sau:
Trong đó: W 2 – Trọng lượng đĩa lần 2 (mg)
W 1 – Trọng lượng đĩa lần 1 (mg)
4.2 Tổng chất rắn lơ lửng TSS (Total Suspended Solid)
Thu mẫu vào bình 1 lít và đậy kín Bảo quản lạnh 4o
C Lọc mẫu bằng giấy lọc có cấu tạo bằng chất liệu sợi thủy tinh đường kính 47 mm, cỡ
48 lọc 0,22 - 0,45 àm. Đánh số mẫu trên giấy lọc.
C trong 2-3 giờ.Cân và ghi khối lượng giấy lọc (Wo) Lắc đều mẫu nước trước khi lọc.
Lọc mẫu nước, ghi thể tích mẫu nước đã lọc (V mL)
C trong 2-3 giờ, hút ẩm 30 phút trong bình hút ẩm, cân khối lượng (W1).
C trong 2-3 giờ, hút ẩm 30 phút trong bình hút ẩm, cân khối lượng (W2)
Các chỉ tiêu về vật chất lơ lửng được tính theo công thức sau:
Trong đó: V – Thể tích mẫu nước đã lọc (mL)
W – Khối lượng (mg)TSS – Tổng vật chất lơ lửngOSS – Tổng vật chất hữu cơ lơ lửng (Organic Suspended Solid)ISS – Tổng vật chất vô cơ lơ lửng (Inorganic SUuspended Solid)
Độ dẫn điện (EC)
Độ dẫn điện là khả năng mang một dòng điện của dung dịch.Khả năng này tùy thuộc vào sự hiện diện của các ion, tổng nồng độ, tính linh động, hóa trị của các ion và nhiệt độ lúc đo đạc Các dung dịch của hầu hết các hợp chất vô cơ là các chất dẫn tốt nhưng ngược lại đối với các phân tử hữu cơ có tính dẫn điện kém. Đơn vị đo độ dẫn điện là micromho/cm (àmho/cm) hoặc theo hệ thống đơn vị đo lường quốc tế (SI) là millisiemens/m (mS/m); 1 mS/m àmho/cm và 1 àmho/cm=1 àS/cm Trong nước ngọt, độ dẫn điện thường từ 50 đến 1.500 àmho/cm (Theo Hiệp hội sức khỏe cộng đồng người Mỹ-APHA, 1989; Arce và Boyd,
1980), môi trường nước lợ và mặn thì độ dẫn điện cao hơn nhiều.Độ dẫn điện và nồng độ muối có liên quan rất chặt về nồng độ các ion trong môi trường, độ dẫn điện tăng cùng với sự tăng nồng độ muối Việc đo đạc chính xác độ dẫn điện thường không được đòi hỏi cao đối với nuôi trồng thủy sản, mà thay vào đó việc đo nồng độ muối của nước thường được sử dụng hơn Máy đo độ đẫn điện thường được sử dụng để ước tính nhanh mức độ khoáng hóa của nước thiên nhiên và mức độ ô nhiễm nguồn nước thải công nghiệp.
Nồng độ muối
Thuật ngữ nồng độ muối chỉ tổng nồng độ các ion hòa tan trong nước Đơn vị tính là mg/L hoặc phần ngàn (‰) Để ước tính nồng độ muối của nước một cách tốt nhất thì cần tính tổng nồng độ 7 ion quan trọng trong môi trường làm cho nước thiên nhiên có nồng độ muối đó là: Na+
, và HCO3- vì các ion này thường chiếm hơn 95% trong tổng số các ion hòa tan trong nước. Để đo nồng độ muối chúng ta có thể sử dụng tỉ trọng kế, nhưng mức độ chính xác của dụng cụ đo này không cao Trong lĩnh vực thủy sản, thiết bị đo nồng độ muối được sử dụng phổ biến nhất là khúc xạ kế và máy đo nồng độ muối.
Oxy hòa tan (DO)
7.1.1 Nguyên tắc: Trong môi trường bazơ mạnh, oxy hòa tan trong nước sẽ oxy hóa ion Mn2+ thành Mn4+ có kết tủa nâu.
Sau đó MnO2 được hòa tan bằng H2SO4 đậm đặc Trong môi trường acid,MnO2 là chất oxy hóa mạnh, có khả năng oxy hóa I- thành I2 bằng đúng với lượng I2 có trong mẫu nước lúc ban đầu:
I2 được giải phóng ra sẽ hòa tan trong nước và được xác định bằng phương pháp chuẩn độ với dung dịch Na2S2O3 Hồ tinh bột được sử dụng làm chất chỉ thị để xác định điểm tương đương trong quá trình chuẩn độ này: Khi I2 có mặt trong dung dịch, nó sẽ kết hợp với tinh bột hình thành một phức chất có màu xanh Khi tất cả I2 trong dung dịch đã được chuẩn độ hết với Na2S2O3, dung dịch sẽ trở nên không màu.
Thu mẫu nước vào lọ nút mài nâu 125 mL, cho hóa chất cố định bằng 1 mL MnSO4 và 1mL dung dịch KI-NaOH, đậy nắp lọ lại, lắc đều, trong lọ xuất hiện kết tủa Chú ý, khi thu mẫu và sau khi cố định không để bọt khí xuất hiện trong chai khi thu mẫu nước.
7.1.2 Thuốc thử: o Dung dịch MnSO4: Hòa tan 50 g MnSO4.5H2O hay 41 g MnCl2.4H2O với nước cất thành 100 mL. o Dung dịch KI-NaOH: Hòa tan 50 g NaOH và 15 g KI (hay 14 g NaI) với nước cất thành 100 mL. o H 2 SO 4 đậm đặc (d = 1,84) hay H 3 PO 4 đặc (d = 1,88) o Dung dịch Na2S2O3 tiêu chuẩn 0,1N:Pha một ống Na2S2O3 tiêu chuẩn 0,1N trong 1000mL nước cất. o Dung dịch Na2S2O3 0,01N: Sử dụng công thức N1V1 = N2V2 để pha dung dịch cụ thể như sau: Lấy 50 mL dung dịch Na2S2O3 0,1N pha loãng với nước cất thành 500 mL. o Chỉ thị hồ tinh bột 1%: Hòa tan 0,49g K2S2O3 trong 100 mL nước ấm (từ 80-
) khuấy đều cho đến khi dung dịch màu trong suốt, cho vào 0,5 mL formaline nguyên chất để sử dụng được lâu.
Sau khi cố định bằng hóa chất, để yên cho kết tủa lắng.Tiếp tục lắc đều một lần nữa để kết tủa hoàn toàn, sau đó để yên 5 phút đối với nước ngọt, 10 phút đối mẫu nước lợ mặn.
Cho tiếp 2 mL H2SO4 đđ hay H3PO4 đậm đặc (vẫn không cho bọt khí xuất hiện trong lọ)
Lắc đều cho đến khi kết tủa hòa tan.Dung dịch có màu vàng nâu Đong 50 mL dung dịch vừa được acid hóa ở trên, cho vào bình tam giác 100 mL Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt, cho 3 giọt chỉ thị hồ tinh bột, lắc đều dung dịch có màu xanh, tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang không màu thì dừng lại Ghi thể tích (V1 mL) dung dịch Na2S2O3 0,01N đã sử dụng chuẩn độ mẫu.
Làm tương tự 2 hoặc 3 lần, ghi thể tích dung dịch Na2S2O3 0,01N đã dùng chuẩn độ.
Tính V trung bình của Na2S2O3 0,01N đã dùng chuẩn độ
Trong đó: V TB – là thể tích trung bình dung dịch Na 2 S 2 O 3 0.01N
N – là nồng độ đương lượng g của dung dịch Na 2 S 2 O 3 đã sử dụng
8 – đương lượng gam của Oxy
V M – thể tích (ml) mẫu nước đem đi chuẩn độ 1000– hệ số chuyển đổi thành lít
7.2 Phương pháp điện cực Oxy hòa tan – máy đo Oxy
Theo phương pháp này thì áp suất riêng phần của oxy hòa tan được đo trực tiếp Sau đó áp suất riêng phần được chuyển đổi thành nồng độ (mg/L).Máy đo oxy tính toán các giá trị này dựa trên mối quan hệ giữa nhiệt độ, độ hòa tan của oxy và áp suất không khí. Đầu dò oxy bao gồm 1 điện cực dương (anode) được làm từ Ag/AgCl, 1 điện cực âm(cathode) được làm từ kim loại quý như platinum, vàng, tungsten hoặc rhodium và dung dịch điện cực KCl bảo hòa ngăn cách với môi trường ngoài bởi màng cảm ứng polyethylene, teflon, polypropylene hoặc vật liệu tương tự có độ dày thường 25àm hoặc mỏng hơn (cú khả năng thấm oxy) Cỏc điện cực trong hệ thống này có 1 hiệu điện thế giữa chúng thường khoảng 0,7 volts.
Khi oxy trong mẫu nước tiếp xúc với màn cảm ứng, màn có khả năng thấm oxy và tỷ lệ mà oxy đi qua màng cảm ứng có liên quan đến áp lực của oxy trong mẫu nước.Khi cung cấp mật hiệu điện thế cho đầu dò thì oxy phân tử thấm thấu qua màng, phản ứng với cực cathode và bị khử thành hydroxide với tỷ lệ 4 moles
/mole oxy theo phương trình sau:
Sau đó 1 dòng điện chạy qua cực anode (điện cực bằng bạc) và OH- phản ứng với bạc tạo thành dạng oxit bạc theo phương trình sau:
Do đó, sự chính sự khác biệt về áp lực oxy giữa trong và ngoài màng cảm ứng làm cho oxy thẩm thấu qua màng.Vì vậy, nếu áp lực oxy bên ngoài màng cảm ứng thấp thì dòng điện giữa 2 điện cực sẽ ít hơn so với khi áp lực oxy bên ngoài cao.
Ngoài ra, tính thấm của màng cảm ứng bị ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ (Mancy và Jaffe, 1966) (Trích dẫn bởi Boyd & Tucker, 1992).Thí dụ, dòng điện tạo ra 10 mg/L oxy hòa tan ở 10o
C chỉ bằng 1/ 4 so với việc tạo ra 10 mg/l ở 30o
C.Bên cạnh đó, nhiệt độ còn ảnh hưởng đối với dòng điện giữa 2 điện cực thông qua mối quan hệ về nhiệt độ và áp lực oxy Do đó, hầu hết các máy đo oxy hòa tan trong nước thường được thiết kế có bộ phận hiệu chỉnh nhiệt độ tự động để tránh sai số do sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên số liệu đo đạc.
Hàm lượng oxy hòa tan trong nước cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối Hàm lượng oxy hòa tan trong nước ở mức bảo hòa giảm khi giảm áp suất không khí và tăng nồng độ muối Vì vậy, hầu hết các máy đo oxy thường được thiết kế có sự hiệu chỉnh áp suất và nồng độ muối để tăng độ chính xác trong đo đạc.
Việc xác định độ cứng tổng cộng của nước được thực hiện theo phương pháp chuẩn độ Complexon.
Trong môi trường pH ion Ca2+ và Mg2+ sẽ kết hợp với thuốc thử EDTA (Ethylene DiamineTetra-acetic Acid) (EDTA - Ký hiệu Na2H2Y ) hình thành phức chất bền vững, không màu Calcium hay Magnesium ethylene diamine tetraacetate.
Eriochrome black T (C20H13O7N3SNa) được sử dụng làm chất chỉ thị để xác định điểm tương đương Eriochrome black T kết hợp với ion Ca2+ và Mg2+ hình thành phức chất không bền vững có màu hồng của rượu vang Khi dùng EDTA chuẩn độ, các ion
Ca2+ và Mg2+ sẽ kết hợp với EDTA hình thành phức chất bền vững, không màu, và khi có Eriochrome black T tự do, dung dịch có màu xanh lơ
+ M-Eriochrome black T + Na2H2Y = Na2MY + 2H +
(Màu hồng rượu vang) (màu xanh lơ)
Trong quá trình chuẩn độ ion Ca2+ và Mg2+ bằng Na2H2Y luôn giải phóng ra 2 ion
, phần nào làm acid hóa môi trường, do đó trong quá trình chuẩn độ phải cho dung dịch đệm vào môi trường để pH của môi trường không đổi trong suốt quá trình chuẩn độ, dung dịch đệm thường là NH4OH, NH4Cl.
Nếu trong mẫu nước có chứa một lượng đáng kể ion Fe3+
PHÂN TÍCH ENZYME
Các phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme thông dụng
Xác định hoạt độ alpha amylase theo phương pháp wohlgemuth
Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đến dextrin.Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa.
Dụng cụ và hóa chất
11 ống nghiệm, pipet 1ml (4 cái), tủ ấm, NaCl 0,5%, tinh bột 0,5%, H2SO4 10%, Iodine 0,3% trong KI 3%.
• Chuẩn bị dịch chiết amylase
Cân khoảng 10 g malt xay cả vỏ, chuyển vào bình định mức 100ml, định mức đến 100ml, lắc thật kỹ.Ngâm 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều bình định mức Lọc qua 2 lần giấy lọc mịn, thuđược dịch trong suốt chứa enzyme amylase (có thể dùng dung dịch alpha amylase đã pha loãng để thay thế).
• Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase.
Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự.Hút vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch NaCl 0,5%.
Trong ống nghiệm 1 cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc kỹ.Sau đó lấy 1 ml từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2, lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm 10 thì hút 1ml và bỏ đi Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1 ml dung dịch hồ tinh bột 0,5% lắc đều, để vào tủ điều nhiệt ở 37oC.Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống 1 ml H2SO4 10% và 2 giọt Iodine trong KI lắc đều Kết quả được thể hiện trong bảng, có đánh dấu xanh (x), đỏ (đ) , nâu (n), vàng (v).
Bảng 4: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với các nồng độ và độ pha loãng khác nhau
Lấy ống nghiệm còn lại (ống thứ 11) cho vào 3 ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iodine trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzym thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin.
Lượng enzyme được cho vào ống nghiệm (1): n = m V 1
V1- Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml)
V2- Thể tích dịch chiết enzyme (100 ml ) m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg)
F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW):
2 Xác định hoạt độ lipase 2.1Nguyên tắc
Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo.Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm.Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòa acid mới được hình thành.Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng enzyme.
Hóa chất Đệm acetate pH=4,7 (trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1), cồn 96 0 , toluen, ether ethylic, NaOH 0.1 N , Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với
50 ml ethanol và 50 ml nước cất Dầu đậu nành tinh khiết.
Cân 5g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn bằng cối sứ Chuyển vào erlen, thêm 10ml nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30oC.
Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml đệm acetate với vài giọt toluene, lắc đều hỗn hợp ở 30o
C trong 24 giờ Khi hết thời gian phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96o và 15ml ether, lắc đều và để yên 2 phút.
Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1%.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần.Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết enzyme phải được đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính trước khi cho cơ chất vào.
Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ :
Trong đó: a : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình thí nghiệm b : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình kiểm chứng k : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N m : khối lượng hạt sử dụng
3 Khảo sát hoạt độ invertase 3.1Nguyên tắc
Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructose.Dựa vào tính chất Iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác dịnh lượng glucose sinh ra bằng cách định phân Iodine dư với dung dịch Na2S2O3.
• NaOH 0,1N: hòa tan 4 g NaOH cho đủ 1000 ml bằng nước nước cất.
• Iodine 0,1N: cân 40 g KI và hòa tan với 100 mL nước cất trong bình cầu 1000-ml Cân 12.7 g I2 cho vào bình cầu trên và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 3 giọt 37% HCl Định mức cho đủ 1000 ml bằng nước cất.
• H2SO4 1N: hòa tan 27.7 ml H2SO4 96% cho đủ 1000 ml bằng nước cất.
• Hồ tinh bột 1%: 1 g hồ tinh bột hòa tan trong 100 ml Đun cách thủy trong 15 phút.
• Dung dịch Na2S2O3 0,05N: cân 12.5 g Na2S2O3.5H2O trong nước cất cho đủ
3.2Cách tiến hành Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hòa tan vào 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút Để lắng, lọc lấy dịch lọc Thực hiện 3 ống nghiệm như sau:
Bảng 5: Chuẩn bị ống nghiệm
Dịch enzyme đã đun cách thủy 10 phút Để 3 ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong chính xác 30 phút sau đó dem đun cách thủy trong 10 phút.Ở từng ống nghiệm, hút ra 5ml hỗn hợp dung dịch cho vào một bình tam giác 250ml để xác định hàm lượng glucose
Xác định glucose: thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung dịch iodine 0,1N và 15mlNaOH 0,1N.
Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2 phút.Để yên trong bóng tối 20 phút.Lấy ra, thêm vào 2ml H2SO4 1N.Định phân lượng iodine thêm thừa bằng Na2S2O3 0,05N với hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị.Lặp lại thí nghiệm 2-3 lần
Hoạt độ của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân bởi lượng ezyme có trong 1g men bánh mì trong một phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
V1: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1
V2: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2
A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml)
B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (ml) a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml) b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml) t: thời gian thủy phân (phút)
4 Khảo sát động học và xác định hoạt độ enyme urease 4.1 Nguyên tắc
Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng:
Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene tetramine và giải phóng acid carbonic.
Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành sẽ tính được lượng urea bị thủy phân.
• Formol trung tính: cho 10 ml dung dịch 10% formol và erlen, bổ sung 2 ml
