CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hóa SINH

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HĨA SINH MỤC LỤC Contents Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM TÀI LIỆU THAM KHẦo.L ".j.r : "” ”::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::.77 DANH SÁCH CÁC HÌNH LỞI MỞ ĐẦU Thực phẩm hay nói đơn giản thức ăn, chủ yếu bao gồm chất như: carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), vitamin, khoáng chất, nước, mà người hay động vật ăn hay uống được, với mục đích thu nạp chất dinh dưỡng nhằm ni dưỡng thể hay sở thích Tuy nhiên, chất thực phẩm dễ bị chuyển hóa nhiều yếu tố khác q trình chế biến bảo quản.Một yếu tố enzyme.Do phản ứng enzyme mà chất lượng nguyên liệu trình chế biến bảo quản tăng lên, giảm sút.Các biện pháp công nghệ sản xuất thực phẩm kìm hãm hoạt độ enzyme tạo điều kiện để chúng hoạt động cách tối đa Tất thuộc tính lý, hố, sinh thành phần thực phấm đo được, biểu diễn dạng thơng số cụ thể.Việc phân tích, đo đạc định lượng thành phần hóa học thực phấm ngày trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm ihpăc nghiên cứu tạo sảnjphẩm mỚLCùng ỵớisự nhát triển nhạnh chong khoa 'Ọc Kỹ Thuật, phương pnap phân tích ngày cang phát triển hơn, đại có độ xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất lượng quản lý sản xuất Yêu cầu đặt phải xác định hàm lượng chất có thực phẩm, hoạt độ xúc tác enzyme sản xuất thực phẩm.Trên sở biết hàm lượng nguyên liệu hay chất có thực phẩm, người ta xác định giá trị dinh dưỡng sản phẩm thực phẩm.Việc xác định hoạt độ xúc tác enzyme thực phẩm nhằm biết biến đổi diễn chế biến, từ có cách thức sản xuất cho phù hợp , Hóa sinh thực phẩm mơn học quan,trọng ngành thực phẩm, cung cấp cho kiến thức cần thiết cấu tạo chuyển hóa chất có thực phẩm vào thể Ngày nay, có nhiều phương pháp phân tích hóa sinh thực phẩm.Trong tiểu luận này, chúng em xin trình bày số phương pháp phân tích phổ biến hóa sinh thực phẩm Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phan Minh Anh Thư giúp chúng em hoàn thiện báo cáo này.Vì kiến thức chun mơn chưa tốt nên q trình tìm hiểu khơng tránh khỏi thiếu sót, mong đóng góp ý kiến bạn PHÀN I: PROTEIN Protein polymer amino acid Protein có nhiều chức quan trọng • Dinh dưỡng: phát triển, tiêu hóa, trao đổi chất (enzyme) • Cấu trúc vật lý: phơ mát, bánh mì, chất tạo bọt, tạo gel Các phương pháp xác định hàm lượng protein Phương pháp Kjeldahl - Xác định hàm lượng N tổng 1.1 Nguyên tắc: Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H 2SO4 đậm đặc, hợp chất hữu bị oxy hóa Carbon hydro tham gia tạo thành CO H2O Còn nitơ sau giải phóng dạng NH kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2 SO4 tan dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch dung dịch NaOH, đồng thời cất thu NH3 lượng dư H2SO4 0.1N Định lượng H2SO4 0.1N dư dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua ta tính lượng nitơ có mẫu ngun liệu cần phân tích 1.2 Quy trình thực • Vơ hóa mẫu Q trình tiến hành hồn tồn tủ Hotte.Mẫu cho vào bình Kjeldahl.Tùy loại nguyên liệu nhiều hay chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g, mẫu lỏng lấy từ đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL) Thêm vào từ từ 10mL H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh trình vơ hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm chất xúc tác Có thể dùng Se kim loại (0.05g) dùng 0.5g hỗn hợp CuSO4 K2SO4 (1:3) Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sơi, làm tăng vận tốc q trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác acid perchloric HClO 4, giải phóng oxy cho phản ứng oxy hóa.Sau thêm chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, đun mạnh hỗn hợp hoàn toàn chuyển sang dung dịch Lưu ý: q trình vơ hóa thực đơn giản cách đun trực tiếp bình Kjendahl bếp điện trình đun lắc nhẹ, tráng khéo léo cho khơng cịn vết đen mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại thành bình Đun dung dịch bình hồn tồn trắng Hướng dẫn sử dụng vơ hóa mẫu - Bật công tắc (1) gia nhiệt trước khoảng phút - Mang găng tay bảo hộ nhẹ nhàng lắp giữ (2) chứa bình vơ hóa mẫu (4) vào - Cho dung dịch mẫu chất oxy hóa (H2SO4) vào bình vơ hóa mẫu - Đóng chặt hệ thống Gaskets - Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun Sau vơ hóa mẫu hồn tồn, dung dịch trở nên suốt.Cần làm nguội trước lắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit • Cất đạm Chuẩn bỊ máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến hình lên máy sẵn sàng làm việc Lấy vào erlen 10ml dung dịch H 2SO4, lắp vào máy Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sục hơi: 50%, thể tích NaOH 40%: - 10mL, thời gian cất: 15 - 30 phút) Tiến hành: Chuyển toàn dung dịch mẫu sau vơ hóa xong bình Kjeldahl vào bình định mức 100, thêm nước vạch định mức Lưu ý acid H 2SO4 đậm đặc háo nước tỏa nhiệt mạnh tiếp xúc với nước nên làm bay phần.Vì vậy, cần làm nguội điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đổ erlen Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống, ý khơng lắp lệch, khí ngồi, mẫu Tiến hành cất đạm máy NH giải phóng hồn tồn khỏi bình Kjendahl • Định phân Lấy erlen khỏi máy sau tráng nước cất để lấy hết mẫu bám ống.Cho 10 giọt phenolphtalein vào bình định phân NaOH 0.1N Xác định hệ số hiệu chỉnh K: Đối với chất dễ thay đổi thành phần dạng rắn, muốn pha dung dịch có nồng độ xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau hiệu chỉnh nồng độ dung dịch dựa vào phản ứng với dung dịch chuẩn thích hợp Thủ tục hiệu chỉnh sau: - Gọi K tỷ số nồng độ thực tế (Ct) nồng độ cần pha (Cp) NaOH - Lấy 10mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân V (mL) NaOH 0.1N pha sẵn.Thêm giọt thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy Ct K 1.3 Tính kết quả: Hàm lượng phần trăm Nitơ tổng có mẫu: _ (a-bK).0,0014.Q 100 v.o Trong đó: N - hàm lượng Nitơ tính phần trăm khối lượng a - số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3 b - số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ m - khối lượng mẫu đem vơ hóa, g V - tổng thể tích định mức dung dịch vơ hóa (100mL) v - thể tích dung dịch vơ hóa dùng chưng cất (10 mL) 0.0014 - lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H 2SO4 0.1N K - hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N % Protein = % Nitrogen X 6,25(Phần lớp Protein chứa 16% N => hệ số 6,25 (100/16=6,25)) ưu điềm phương pháp • ứng dụng cho tất loại thực phẩm • Đơn giản, chi phí thấp • Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thơ (AOAC 945.01) Nhược điềm phương pháp • Khơng phải tất N protein, ngồi xác định cả: Purine, Pyrimidine DNA, RNA, Urea, Nhiều tế bào thực vật có 50% N phi protein, Melamine (6N/phân tử) • Chỉ xác định hàm lượng N tổng, không xác định xác hàm lượng N protein • Sử dụng hóa chất độc hại, thời gian tiến hành tương đối lâu Phương pháp biuret 2.1 Nguyên tắc Biuret peptide phản ứng với Cu 2+ tạo thành phức hợp có màu tím hấp thụ ánh sáng bước sóng 540nm.(Biuret hợp chất ngưng tụ urea sau bị đốt nóng) Cường độ màu hấp thu tỷ lệ thuận với nồng độ protein mẫu • Cách pha thuốc thử Biuret Thuốc thử biuret pha từ dung dịch thuốc thử dung dịch A, B C Các dung dịch chuẩn bị sau: - Dung dịch A: 05g CuSƠ4 5H2O hòa tan 495 mL nước ( dung dịch CuS04 5H2O 1%) - Dung dịch B: 10g NaKC4@4O6.4 H2O hòa tan 490 mL nước ( dung dịch NaKC4H40i.4 H2O 2%) - Dung dịch C: 20,5g Na2CO; 4g NaOH hịa tan định mức thành lít dung dịch (dung dịch Na2CO; 2% NaOH 0,1N) Thuốc thử biuret = mL dung dịch A + mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C HỊN NH UN" NH NU + NH Cu3'* NH Nlí Cuí+ H2N o ' HM NH H7N NH Bicrret )>—o Copper Complex Hình 1: phương trình phản ứng thuốc thử Biuret với NH3 3S Amino acid đơn dipeptide không phản ứng Vùng nồng độ tuyến tính 1-5 mg/ml Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin) 2.2 Quy trình thực * Dựng đường chuẩn Pha dung dịch protein chuẩn từ huyết bò ứng với nồng độ khác 2, 4, 6, 10 (mg protein/ mL).Lấy mL dung dịch protein chuẩn mL thuốc thử biuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp lắc 15 phút nhiệt độ phịng Hỗn hợp sau đem đo độ hấp thu bước sóng 540 nm Vẽ đường chuẩn: trục hoành nồng độ protein, trục tung độ hấp thu Hình 2: Phương trình đưởng chuẩn * Xác định độ hấp thu mẫu thực phẩm - Trích ly protein (nếu mẫu mẫu rắn) Sau đó, ta tiến hành pha loãng mẫu cho nồng độ protein mẫu nằm khoảng - 10 mg/mL - Lấy mL dịch trích ml thuốc thử biuret cho vào ống nghiệm lắc đảo 15 phút nhiệt độ phịng Sau đó, hỗn hợp đem xác định độ hấp thu bước sóng 540 nm - Giá trị nồng độ protein mẫu xác định dựa vào phương trình đường chuẩn ưu điểm • Nhanh (khoảng 30 phút), đơn giản, màu sắc biến đổi so với phương pháp Lowry, uv, có hợp chất phi protein gây ảnh hưởng nên phản ứng Biuret, không phát N từ nguồn khơng phải peptide protein • Khơng sử dụng hó chất độc hại Nhược điểm • • • Khơng nhạy phương pháp Lowry Cần - mg protein cho lần đo Các muối ammoni nồng độ cao gây ảnh hưởng Phương pháp lowry 3.1 Nguyên tắc Cu2+ môi trưởng kiềm tạo phức hợp với protein.Cu 2+ xúc tác oxy hóa nhóm phenol tyrosine tryptophan thuốc thử Folin-Ciocalteau (phosphomolybdicphosphotungstic acid) => tạo hỗn hợp có màu Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein phương pháp lowry 3.2 Quy trình thực Pha lỗng mẫu (20 - 100 microgam protein) Cho mẫu phản ứng với KNa tartate- Na 2CƠ3 10 phút nhiệt độ phòng Phản ứng với CuSƠ4- KNa tartate-NaOH 10 nhiệt độ phòng Tiếp cho phản ứng với Folin 10 phút 50 0C Đo độ hấp thu bước sóng 600 nm Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Thực ống nghiệm sau: Bảng 8: Chuẩn bỊ ống nghiệm Ống nghi ệm Ure 2% (ml) 5 Nước cất (ml), Dd urease (ml) X 5 Dd urease đun cách thủy (ml) 0 Mang tất ống nghiệm đặt 40°C.Sau 20 phút cho vào ống ml formol trung tính, lắc phút.Đổ ống erlen 100ml Định phân NaOH 0,05N với phenolphtalein 1% làm thị.Lặp lại thí nghiệm lần Tính kết quả: hoạt độ urease biểu diễn số mol ure bị thủy phân lượng enzyme urease có 1g bột đậu nành thời gian phút 40oC (V 2-V 1) A.k t a.m 20.1000.2 Trong đó: Vi, V4: số ml NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch ống nghiệm a: Thể tích enzyme cho vào ống nghiệm A: Tổng tích enzyme có từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu cân k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N Xác đinh hoạt độ enzyme peroxidase Enzyme Peroxidaza phổ biến thực vật đóng vai trị quan trọng q trình oxy hóa.Peroxidaza làm hoạt hóa peroxide đặc biệt H 2O2 Peroxidaza xúc tác phản ứng oxy hóa nhiều polyphenol amin thơm tạo thành phẩm vật khác 5.1 Nguyên tắc Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme peroxidaza phổ biến phương pháp dựa oxy hóa pirogalol thành purpurogalin có H 2O2.Phản ứng xảy theo sơ đồ sau: 68 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Purpurogalin tạo thành dạng kết tủa màu nâu không tan nước, dễ tan eter H2SO4đậm đặc.Tùy thuộc vào chất chọn dùng pH tối thích enzyme peroxidaza có thay đổi chút Đa số trưởng hợp thí nghiệm tiến hành mơi trưởng kiềm yếu trung tính nhiệt độ thưởng 2O oC.Độ nhạy với nhiệt enzyme peroxidaza cao, bị vơ hoạt sau sơi.Độ nhạy dư H 2O2 lớn, tiến hành xác định hoạt độ enzyme thể tích lớn, pha thật lỗng Lượng purpurogalin tạo thành xác định hai cách: - Kết tủa purpurogalin sau lọc rửa sạch, hòa tan H 2SO4 80% đem chuẩn KMnO4 0.1 N - Kết tủa purpurogalin rửa sạch, hòa tan trực tiếp eter đem xác định phương pháp so màu, đối chiếu với purpurogalin tinh khiết tan eter Chú ý: K'i xác định hoạt độ enzyme Peroxidaza phương pháp dùng piroganol làm chất cần ỳ piroganol H2O2 dùng thi nghiệm có ảnh hưởng lớn đến hoạt độ nó, lượng dùng thí nghiệm khơng q giới hạn xác định Ngồi phải tuân theo cách nghiêm ngặt trật tự quy định trộn lẫn thuốc thử dịch chiết enzyme vào dung dịch H2O2khi chưa thêm pirogalol Hóa chất Dung dịch H2O2 %, dung dịch pirogalol 1% pha trước dùng H 2SO4 đậm đặc ( d = 1.84 ); H2SO4 80%, KMnO4 0.1 N, Eter etylic, Purpurogalin tinh khiết, dung dịch đệm phosphate pH = * 5.2 Phương pháp thực • Chuẩn bị dịch chiết peroxidaza: Cần lấy vào cối sứ -3 gram nguyên liệu (lá, rễ, hạt,).Nghiền thật cấn thận với 20ml dung dịch đệm phosphate pH = * 9, có thêm giọt toluene chlorotorm bột thủy tinh cát (khơng có Fe) Chuyển tồn hỗn hợp vào bình định mức 100ml dung dịch đệm sau thêm dung dịch đệm vạch Lọc nước thu dùng để xác định hoạt động enzyme peroxidaza 69 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Cho vào bình tam giác 250ml dung dịch pirogalol 1% pha cho thêm 1ml H 2O2 1% giữ nhiệt độ (20 -25 0C) hỗn hợp cho vào máy điều nhiệt hay trênnồi cách thủy 25°c để yên khoảng thởi gian định ( 15 phút - 20 giở ) tùy thuộc vào hoạt lực enzyme • Song song với thí nghiệm kiềm chứng : Lấy vào bình tam giác 250ml, 40ml dung dịch enzyme peroxidaza đun sôi 10 phút với ống sinh hàn thu hồi.Làm nguội cho thêm 10ml pirogalol 1%, 1ml H 2O2 1% mẫu thí nghiệm Trong thởi gian phản ứng purpurogalin tạo thành dạng kết tủa màu nâu.Thêm vào hỗn hợp phản ứng - 2ml H 2SO4 đậm đặc.Lọc kết tủa purpurogalin mẫu thí nghiệm kiểm chứng qua phễu thủy tinh xốp (G - ).Rửa kết tủa nước cất nước rửa khơng cịn khử KMnO4 Sau hịa tan kết tủa trực tiếp phễu lọc H 2SO4 80% (10 -20ml ) rửa phễu lọc nước cất ( lượng rửa gấp - 20 lần lượng acid đem dùng) Nếu pha lỗng khơng đủ nước, định phân khó, trái lại pha lỗng q mức làm kết tủa purpurogalin trở lại Đun nóng dung dịch thu tới 50 -60 0Cvà chuẩn , bằng, dung dịch KMnO 4, màu dung dịch chuyển từ màu nâu sang màu thẫm xanh nhạt cuối sang màu hồng dư giọt KMnO4 5.3Tính kết Hoạt độ peroxidaza biểu thị số ml KMnO 0.1N ứng với gram vật phẩm ngiên cứu khô sau 15 phút tác dụng.Hoạt độ peroxidaza tính theo cơng thức: (m f ) HdPer = \ m Trong đó: a, b - số ml KMnO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm kiểm chứng m - trọng lượng mẫu enzyme đem phân tích thí nghiệm tương ứng 40 ml dịch chiết Phân tích enzyme nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay maltala Để đánh giá chất lượng men bánh xácxuất địnhđánh hoạt lựcsản cácxuất enzyme trọng chung để đánh cần giá thiết, chất lượng khơng, menthưởng bánhmì mì định sản lượng cho giá số như: tiêuhoạt quan lực Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM 70 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM enzyme zimaza, maltaza, đo độ nở bột theo thởi gian, nhiệt dộ với lượng men nhau, xác định độ tạo váng, 6.1 Xác định hoạt lực enzyme zimaza hay maltala a Nguyên tắc Hoạt lực enzyme zimaza hay maltala biểu thị thởi gian cần thiết để tách ea 10 ml khí CO2 sử dụng 20 ml dung dịch đưởng saccarroza, glucoza hay maltoza với lượng men ép cố định thể tốc độ lên men đưởng glucoza, maltoza hay saccarroza.Thông thưởng hoạt lực nằm khoảng 30 - 40 phút men tốt, hoạt lực maltaza không 80 -90 phút men tốt b Cách xác định Dùng hệ thống micromanometre Elesco.Cân lượng men ép khoảng 0.5g hay men khơ hoạt hóa khoảng 0.2 - 0.3 cho vào cốc nhỏ hệ thống Đổ vào cốc 10 ml nước cất 350C khuấy thật cẩn thận thật dung dịch huyền phù nấm men, cho thêm vào cốc 10 ml Dung dịch đưởng glucoza, saccarroza 'ay maltoza 10% đậy năp kín vào chuyển van ba ngã từ vị trí A sang vị trí để cân áp suất bên với khí quyển, sau van chuyển vào vị trí B đặt cốc điều nhiệt 350C Đánh dấu thởi gian từ lúc khuấy huyền phù nấm men với dung dịch đưởng cho vào quan sát tăng dần dung dịch NaCl ống đo áp kế xác định thởi gian chất lỏng nâng lên 10 ml Thởi gian đơn vị đo tốc độ lên men đưởng hoạt lực enzyme nấm men.Các chủng nấm men khác sử dụng sản xuất thưởng hoạt lực zimaza thay đổi khoảng 40 - 60 phút, hoạt lực maltaza từ 70 - 80 đến 160 phút 71 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Hình 74 Hệ thống micromanometre' Cốc nhỏ Nút kín Ống đo áp suất 4.ba Ống dẫn Van ngã 72 Chú ý: Sau phân tích xong đổ dung dịch cách vặn van vỊ trí mở lắp đổ dung dịch từ cốc ra, rửa cốc sạch, lau khô Trước tiến hành xác định cần chuẩn bị: - Rót dung dịch NaCl bão hòa với dung dich, mẹthylẹn xan' vào lắp ống đo áp kế dung dịch rót từ đáy ống đo đánh dâu mức mức - VỊ trí xoay van phải đánh dâu vasẹlin ống đo khác độ với độ xác ml = 20 mm Ghi chú: Có thể xác định nhanh phương pháp tạo váng Đây phương pháp hay dùng để đánh giá nhanh sơ chât lượng mẹn ép hay mẹn khô mẹn bánh mì Thường lây 5g mẹn ép hay - 2g mẹn khô, cho vào cốc nhỏ thêm 50 ml nước thường (hoặc cho thêm 2.5 - 5g đường).Hòa mẹn vào cốc quan sát bề mặt mẹn lên sau phút.Nếu để lâu phút mà mẹn chưa tạo váng mẹn chưa tốt.TỪ đánh giá phương pháp lực nở để xác định lượng mẹn cho vào bột thích hợp 6.2Xác định lực nở nấm men bánh mì a Ngun tắc Dùng hộp nhơm hay tơn có kích thước xác định thơng thường có câu tạo: Mặt khuôn: 14.3 9.2 cm hay 150 x 100 mm Mặt : 12.6 8.5 cm hay 140 x 90 mm Chiều cao: 8.5 cm hay 84 mm Dùng gỗ đặt ngang qua bột đặt lên thành hộp, đặt cao 1.5 cm Để tính thời gian bột nở đến gỗ đặt ngang bề mặt bột b Cách xác định • • • • • _ Lấy 280g bột mì chât lượng tốt cho vào tủ ổn nhiệt giờ, nhiệt độ 30 C.Cung thơi gian cân gram mẹn ép (cân xác đến 0.01g) cho vào tủ ăn nhiệt độ 350C với 160 ml nước muối 2.5%.Lây 10 - 20 ml dung dịch nước muối cho vào chén có mẹn.Lắc khơng vón cục, đẹm đổ vào bình nhào bột phịng hóa nghiệm, nhào với tốc độ 135 vòng/phút Dung dịch muối lại đổ vào thùng, rắc bột khơ lên nhào lại vịng phút Nếu phịng hóa nghiệm khơng có máy nhào nhào tay, phải nhào kỹ thẹo chế độ quy định Bột nhào xong nặn thành hình bành mì dài va để vào khn sắt Dùng gỗ để ngang qua bột, đặt cao 1.5 cm cho vào tủ âm 35 0C.Tính thời gian cho bột vào khuôn đến thây bột nở đến ngang gỗ khn Đó thời gian nở bột, hay qua đánh giá chât lượng mẹn tốt hay mẹn xâu Đối với men khơ: lấy 2.5 gram men hịa với 30 ml nước thưởng đưa vào tủ ổn nhiệt để 300C 30 phút Sau trộn với 15 gram bột lại cho vào tủ ổn nhiệt để giở nhiệt độ trên.Đồng thởi cho vào tủ ấm 350C, 265 gram bột (đã lấy 15 gram trên) Sau cho men vào với 130 ml dung dịch muối 2.5% cho vào tủ ấm 30 - 350C.Nhào bột phút để xác định thởi gian nở giống men ép Quan sát bột nở đến bề mặt gỗ, đánh giá thởi gian thởi gian hay lực nở men Bảng 9: đánh giá chất lượng nấm men bánh mì Ngồi ngưởi ta đánh giá thởi gian (độ bền vững) men.Trạng thái bị chảy xệ, xẫm màu hay hình dạng bề ngồi để đánh giá chất lượng men xác 6.3 Xác định hoạt độ enzyme z - glucosidasa Nguyên tắc phương pháp enzyme xúc tác phản ứng thởi gian xác định, sau dừng phản ứng lượng chất hay lượng sản phẩm sinh để xác định hoạt độ chế phẩm enzyme Một đơn vị hoạt độ z - glucosidasa (UI) định nghĩa lượng enzyme có chế phẩm dùng để xúc tác thủy phân chất giải phóng micromole sản phẩm thởi gian phút pH = 4.8 nhiệt độ 50 0C chất p - NPG (para - nitrophenylglucoza), sản phẩm tạo p - NP (para nitrophenol) a Nguyên tắc Sản phẩm phản ứng thủy phân chất p - NPG enzyme z - glucosidaza sau Lượng p - NP mẫu phản ứng suy từ đường chuẩn.Đường chuẩn thiết lập cách xây dựng mối quan hệ nồng độ biết mẫu có nồng độ p - NP khác với độ hấp thu bước song 405 nm (OD 405) Từ dễ dàng suy lượng chất tính theo micromole p - NP giải phóng tác dụng enzyme z - glucosidaza '■ • • • • • P Cương ạXgte 'chứa ml dung dịch chất p - NPG (được pha dung dịch đêm acetat pH = 4.8) đun nóng bể ổn nhiệt ( t = 50 0C) với thời gian phút Hút 0.2 ml dung dịch enzyme cần xác định hoạt độ ( pha lỗng tới nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm Lắc đều, giữ chô phản ứng diễn 15 phút nhiệt độ 50 0C Dùng ml Na2CO; 1M lạnh để dừng phản ứng tạo môi trường kiềm Mẫu kiểm chứng thực tương tự bao gồm: 0.2 ml dịch enzyme bị vô hoạt ml Na 2CO; 1M bổ sung thêm vào hỗn hợp ml chất giữ 15 phút Hàm lượng p - NP giải phóng đo máy so màu quang phổ bước sóng 405 nm so với mẫu kiểm chứng c Cơng thức tín' đơn vỊ hoạt độ z - glucosidaza • HDE ? CẾĨ8-n Trong đó: HDE: hoạt độ enzyme z - glucosidaza (Ul/ml) a: nồng độ p - NP giải phóng (tra theo đồ thị đường chuẩn) 0.2: thể tích dịch enzyme tham gia vào phản ứng (ml) 15: thởi gian tiến hành phản ứng N: hệ số pha lỗng enzyme Hình 9: Đồ thi đưởng chuẩn I :Ỡ / áig^HRgtẵ8gKọyd|at!ẵg phân tích hóa sinh Trong thực phẩm, cacbohydrate chiếm khối lượng lớn đóng vai trò quan trọng dinh dưỡng.Các loại đưởng đối tượng phân tích thưởng xun • Glucose: xác định phương pháp enzym hexokinase Phản ứng q trình xảy sau: D-glucose ■+■ ATP hcxiikinnse Ạ0P T gluccse-6-phcsphate „,_ Ễliicnsc~6-phosphaLc đcìiydrogcnasc glueo&e-õ-phosptiate + NADP+ —— > D-ghicỉỊse-ó-phoặpháte -I- NADPH + íT' • Fructose : enzym hexokinase tác động lên tructose Ta xác định tructose sau xác định glucose D-fructose + ATP ADP + fructose-6-phosphate fructose-6-phosphate glucose phosphate isomerase glucose-6-phosphate • Galactose : xác định theo phản ứng sau D-galactonic acid + NADH + H +galactose de'ydrogenase kD-gaiactose + NAD+ • Mannose : xác định mannose tự theo phương trình phản ứng sau D-mannose + ATP hexokinase ADP + mannose-6-phosphate mannose-6-phosphate phosphomannose isooerase fructose-6-phosphate • Saccharose: thưởng khơng có tế bào động vật Saccharose + H2O P~fructosidase _^.D-glucose + D-fructose • Maltose : xác định maltose theo phương trình phản ứng sau Maltose + H2O • - g|ucosidase 2-D-glucose Lactose: thưởng có sữa Lactose + H2O ^aiactosidase r D-galactose + D-glucose Ratinose : ratinose có củ cải đường • Rafinose + H2O • : galactosidase " ► D-galactose + saccharose Tinh bột : tinh bột có nhiều thực vật có số lồi vi sinh vật Xác định tinh bột theo phương trình phản ứng sau Tinh bột + (n-1)H2O aoyl gluc sidase ° ° n D-glucose Xác định acid hữu Acid hữu muối chúng có nhiều nguyên liệu sản phẩm thực p'mậỉ.'éRgHgóổ§hvđii-ừè tậo quao qỏ?grìtronênsmen'ý ngưởi- động vật- thực vật vi • Acetic acid : Thuộc nhóm acid bay hơi, ngưởi ta sử dụng enzym để xác định acetic acid Acetate có nhiều vang Phản ứng sau xem phản ứng thị Acetate + ATP + CoA ace‘yl-CoA-syn‘he‘ase Acetyl-CoA + AMP + Pyrophosphate Acetyl-CoA + oxaloacetate + H2O citrate synthetase citrate + CoA L-malate + NAD +L-malate dehydrogenase oxaloacetate + NADH + H+ • Ascorbic acid: giống vitamin, ascorbic acid đóng vai trò sinh học lớn sinh lý ngưởi động vật Chúng sử dụng chất phụ gia thực phẩm Ngưởi ta sử dụng enzym để xác định ascorbic acid L-ascorbic acid (XH2) + MTT PMS dehydro ascorbic acid (X) + formazan + H+ PMS: 5-methylphenazinium sultate MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Ascorbate oxy hóa tiếp: L-ascorbic acid ascorbate oxidase dehydro ascorbic acid + H2O Ngưởi ta thưởng xác định ascorbic acid nước quả, rau, quả, sữa, sản phẩm thịt dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử) L-ascorbic acid + dithiothreitol (chất oxy hóa) • Aspartic acid : có nhiều nước táo xác định theo phản ứng sau L-aspartate + u-oxoglutarate GOT oxaloacetate + L-glutamate Oxaloacetate + NADH + H +LMDH • Citric acid : đóng vai trị trao đổi chất sinh vật Chúng có nhiều trái cây, sữa xác định theo phươngtrình sau Citrate • L-malate + NAD+ citrate (pro-35) lyase oxaloacetate + acetate Formic acid : sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn nấm sợi Acid xem chất bảo quản thực phẩm phải tuân thủ nghiêm ngặt an toàn vệ sinh thực phẩm acid formic xác định theo phương trình sau Formate + NAD+ + H2O formate dehydrogenase hydrogencarbonate +NADH + H+ • Gluconic acid: sử dụng enzym gluconate kinase để xác định D-gluconate + ATP gluconate kinase D-gluconate-6-phosphate + ADP +6 PGDH ‘ D-gluconate-6-phosphate + NADP D-ribulose-5-phosphate + NADPH + H+ + CO2 (6.PGDH : 6-phosphogluconic acid dehydrogenase) • Glutamic acid : enzym sử dụng glutamate dehydrogenase ' L-glutamate + NAD+ + H2O glutamate de • ydrogenase rc.-oxoglutarate + NADH + NH4+ 3-hydroxybutyric acid: Trong trứng có nhiều 3-hydroxybutyric acid Enzym sử dụng 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (3-HBDH) D-3-hydroxybutyrate + NAD +3-HBDH acetoacetate + NADH + H+ • Isocitric acid: sử dụng enzym isocitrate dehydrogenase D-isocitrate + NADP+ isocitrate dehydrogenase a -oxoglutarate + NADH +CO2+ H+ • Lactic acid: lactic acid tạo nhiều trình lên men L-lactate + NAD+L-lactate dehydrogenasepyruvate + NADH + H+ D- lactate + NAD+L-lactate dehydrogenase pyruvate + NADH + H+ • Malic acid: có nhiều nho, rau, khác Sử dụng enzym malate dehydrogenase NAD+ L-malate + NAD+malate dehydrogenase Oxaloacetate + L-glutamate GOT • oxaloacetate + NADH + H+ L-aspartate + a-oxoglutarate Oxalic acid: oxalid acid đóng vai trị quan trọng hấp thụ calcium thể Oxalate oxalate dehydrogenase formate + CO2 người Pyruvic acid: acid chu trình chuyển hóa thể Enzym • sử dụng L-lactate dehydrogenase Pyruvate + NADH + H+L-|actate dehydrogenase L-lactate + NAD+ • Succinic acid : acid quan trọng chu trình tricarboxylic acid Succinate + ITP + CoA succinyl-CoA-synthetase IDP + Succinyl-CoA + P IDP + PEP pyruvate kinase ITP + pyruvate ổthanác: đtíMcohoả n phẩm lên men đường nấm men Ngoài phương pháp bình thường, người ta cịn dùng enzym để xác định ethanol Ethanol + NAD+ alcoho1 dehydrogenase (ADH) acetaldehyde + NADH + H+ • Glycerol: glycerol phổ biến nhiều thiên nhiên có nhiều q trình lên men Glycerol + ATP glycerol kinase glycerol-3-phosphate + ADP • ADP + PEP pyruvate kinase ATP + pyruvate • Alcohol đường : - Người ta xác định sorbitol enzym sorbitol dehydrogenase D-sorbitol + NAD +sorbitol de'ydrogenase D-fructose + NADH + H+ - Tương tự, người ta xác định xylitol enzym sorbitol dehydrogenase Xylitol + NAD +sorbitol dehydrogenase xylulose + NADH + H+ Xác định thành phần khác • Cholesterol: cholesterol steroid có ý nghĩa lớn sinh lý người động vật Các phản ứng xác định cholesterol sau Cholesterol + O2cholesterol oxidase cholestenone + H2O2 H2O2 + methanol catalase formaldehyde + 2H2O Formaldehyde + NH4+ + acetylacetone • • lutidine + 3H2O Triglyceride: xác định triglyceride esterase lipase Triglyceride + 3H2O esterase lipase glycerol + acid béo Acetaldehyde: chất tạo mùi cho bia, yaourt loại nước giải khát Acetaldehyde + NAD+ + H2O acetaldehyde de'ydrogenase acetic acid + NADH + H+ • Amoniac : người ta sử dụng enzym glutamate dehydrogenase a-oxoglutarate + NADH + H+ + NH4+glutamate dehydrogenase L-glutamate + NAD+ + H2O • Nitrate: enzym sử dụng để xác định nitrate nitrate reductate Nitrate + NADPH + H+nitrate reductate nitrite + NADP+ + H2O • Sultite: enzym ứng dụng để xác định sultite sultite oxidase SO32- + O2+ H2O sulfite oxidase SO42- + H2O2 H2O2 + NADH + H+NADH-peroxidase 2H2O + NAD+ • Creatine Creatinine: hai chất có Creatinine + H2O creatininase creatine Creatine + ATP creatine kinase creatine phosphate + ADP • Lecithin : (phosphotidylcholine) phospholipide quan trọng phospholipase C Lecithin + H O .1,2-dLglvce,rjde_ + phosphorvlcholine Phospnorylcholine + H2O aka*n®wosp“aa®® pcnonne +yPí Choline + ATP choline kinase phosphorylcholine + ADP • Urea: người ta sử dụng urease để xác định urea Urea + H2O urease 2NH3 + CO2 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thí nghiệm phân tích thực phẩm_ Lê Hồng Du [2] Phân tích hóa học thực phẩm_ Hà Duyên Tư [3] Hóa sinh (Phần III)_ TS Bùi Xn Đơng [4] Phương pháp phân tích thành phần hóa lý thực phẩm_TS Phạm Tại Huân [5] Thực hành hóa sinh thực phẩm_ TS Trịnh Khánh Sơn [6] Food Analysis _S.Suzanne Nielsen [7] Food Biochemistry and food processing ... khác, khơng, hịa tan nước 30 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Các phương pháp định lượng lipid: 31 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM... song thay dung dịch đường nước cất 1.3Tính kết 17 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Hàm lượng đưởng... không chứa nhiều tinh bột inulin: 1.3Tính kết 15 Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩo EBOOKBKMT.COM Có thể chiết