Đề cương Nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu

Ver 1 B1: Xác định đối tượng nghiên cứu B2: Lựa chọn mục tiêu phân tử B3: Lựa chọn phương pháp thử sinh học B4: Nghiên cứu sản xuất ở quy mô pilot B5: Nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THUỐC MỚI TỪ DƯỢC LIỆU

Câu 1: Nguồn gốc, phân loại và ý nghĩa của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên

NGUỐN GỐC:

Nguồn gốc

"Các sản phẩm tự nhiên" là để chỉ các hợp chất có nguồn gốc sinh học lấy từ tự nhiên Chúng có nguồn gốc từ:

(1) các sản phẩm được chiết xuất từ thực vật, động vật hoặc vi sinh vật, khoáng vật

(2) được lấy từ một phần hoặc toàn bộ cơ thể sinh vật, ví dụ như lá hoặc hoa của thực vật, các tổ chức cơ thể động vật…

(3) đó có thể là dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn hoặc là chất tinh khiết

Sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên còn gọi là Hợp chất thứ cấp

– khối lượng phân tử nhỏ hơn (thường < 2000 Da)

– sự có mặt là không hiển nhiên, không bắt buộc trong cơ thể thực vật và được phân bố giới hạn theo nguồn gốc

– thường có một vài lớp chất thứ cấp trong các sinh vật cụ thể như alcaloid, flavonoid, terpenoid, tinh dầu

– được tạo ra trong quá trình chuyển hóa ví dụ như sự thiếu hụt về dinh dưỡng, cơ chế tự bảo vệ của cơ thể, đến nay chưa biết rõ vai trò của chúng trong cơ thể sinh vật

Phân biệt vs Hợp chất sơ cấp:

– là các chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của sinh vật ví dụ:

polysaccharid, protein, acid nucleic, lipid

– thuộc vào lớp chất “sống còn” của cơ thể sinh vật và thường có khối lượng phân tử lớn

– côn trùng và các loài lưỡng thể

– có thể hình thành ở trên cạn hoặc dưới nước

Câu 2: Trình bày những thuận lợi trong việc phát triển các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên ở Việt Nam

- Đất nước ta có nguồn tài nguyên cây cối, hệ sinh thái phong phú

- Điều kiện tự nhiên thuận lợi, có vị trí tự nhiên hiếm có, một mặt gắn liền với lục địa, mặt khác thông với đại dương và nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu nhiều nét độc đáo và đa dạng

- Việt Nam có nền y học dân tộc cổ truyền lâu đời với tri thức sử dụng các loại dược liệu, các loại thuốc có giá trị dùng để chữa bệnh thông thường và y nan

- Dược liệu cây thuốc có giá trị kinh tế to lớn nên không chỉ Việt Nam mà trên thế giới đều có xu hướng "trở về thiên nhiên", nhu cầu về dược liệu cũng như cây thuốc ngày càng tăng nên sẽ thuận lợi cho nước ta có thể mở rộng tầm nhìn về dược liệu

Câu 3: Xu hướng hiện nay trong việc phát triển các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên

– Thực hiện các điều tra về hóa thực vật

– Lựa chọn đối tượng nghiên cứu dựa trên thông tin từ dược lý dân tộc học, kinh nghiệm dân gian hay cách dùng truyền thống

• Xu hướng mới

– Phân lập và xác định các thành phần có hoạt tính dựa trên hoạt tính sinh học dẫn đường

(chủ yếu là các thử nghiệm in vitro)

– Tạo ra thư viện các hợp chất từ tự nhiên (ví dụ DNP)

– Chiết xuất các hợp chất từ công nghệ nuôi cấy mô, công nghệ tế bào, di truyền, quá trình lên men, sinh tổng hợp

– Tập trung nhiều hơn vào hoạt tính sinh học

– Sử dụng dấu vân tay hóa học và đi sâu vào phân tích cơ chế, chuyển hóa hóa học hoặc chuyển hóa sinh học

– Việc lựa chọn đối tượng nghiên có thể đi từ con đường lựa chọn ngẫu nhiên, sàng lọc

từ ngân hàng mẫu lựa chọn ngẫu nhiên

Câu 4: Mô tả các bước cơ bản trong tiến trình nghiên cứu thuốc mới từ dược liệu (Ver 1)

B1: Xác định đối tượng nghiên cứu

B2: Lựa chọn mục tiêu phân tử

B3: Lựa chọn phương pháp thử sinh học

B4: Nghiên cứu sản xuất ở quy mô pilot

B5: Nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ của thuốc

B6: Nghiên cứu chuyển hóa

B7: Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm

B8: Thử tiền lâm sàng

B9: Nghiên cứu tổng hợp quy mô công nghiệp

B10: Thử lâm sàng

B11: Đăng ký sản xuất và lưu hành

B12: Đăng ký bảo hộ bản quyền phát minh sáng chế

B13: Chuyển giao công nghệ, ứng dụng

 Phân tích các bước

1) xác định đối tượng nghiên cứu

- Đốitượng hướng đến làđộng vật, thực vật, khoáng vật

- Có 2 cách tiếp cận đối tượng

+ Lựa chọn bệnh: dược liệu sẽ được lựa chọn sàn lọc trên mục đích tác dụng đã được xác định

+ Lựa chọn dược liệu tiềm năng: dựa trên dược lí dân tộc học, các thông tin trên sách báo

và tạp chí khoa học,tri thức bản địa, dựa vào các test sàng lọc để lựa chọn dược liệu nghiên cứu

2) Lựa chọn mục tiêu phân tử

- Đòi hỏi phải có sự tham gia của nhiều nhà khoa học cùng với sự hỗ trợ của nhiều ky thuật

y sinh học hiện đại

- Khi xác định được mục tiêu phân tử là các receptor, enzym, nucleic, protein sẽ nâng cao hiệu quả điều trị đặc hiệu của thuốc

3) Lựa chọn phép thử sinh học

- Việc lựa chọn các phép thử sinh học sẽ tương ứng với mục đích nghiên cứu của nhà sản xuất Vấn đè quan trọng là xác định ngưỡng tác dụng, nếu chỉ số này quá thấp thì mẫu được lựa chọn quá nhiều, phải qua test sàng lọc lần 2 sẽ mất time, chi phí, nếu ngưỡng tác dụng quá cao thì số mẫu đại tiêu chuẩn quá ít có thể bỏ qua các dược liệu tiềm năng

- Có thể lựa chọn dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn hoặc chất tinh khiết để thử tác dụng, thường tiến hành thử sàng lọc in vitro trước

- Thử nghiệm trên các môi trường nuôi cấy: vi sinh vật ký sinh trùng,tế bào ưng thư, virus

- Thử nghiệm trên các tác dụng đích: receptor, enzym, cảm ứng gen, AND

4, 5) Nghiên cứu sản xuất quy mô pilot của thuốc và độ ổn định

Sau khi đã lựa chọn đói tượng, dược liệu nghiên cứu, tiến hành xác định dạng bào chế và xây dựng công thức bào chế của sản phẩm Dạng bào chế có thể là: dung dịch thuốc, thuốc cốm viên năng, cao thuốc, và tùy theo dạng bào chế để thiết kế xây dựng công thức cho phù hợp

6) Nghiên cứu chuyển hóa

- Thông thường 1 chất sau khi đua vào cơ thể sẽ chịu tác động của enzym chuyển hóa Qúa trình chuyển hóa gồm 2 pha chính

+ pha 1: Liên quan đến các phản ứng OXH, khử, thủy phân

+ Pha 2: Gồm các phản ứng liên hợp để tạo các chất phân cực để thải trừ ra ngoài qua thận

- Trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới trước khi thử lâm sàng các chất ứng cử viên phải được nghiên cứu chuyển hóa ở động vật và người để khẳng định không có chất chuyển hóa độc sinh ra trong cơ thể

- Xác định số phận trong cơ thể: có chuyển hóa? Dạng chuyển hóa có hoạt tính và không có hoạt tính

7) Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm

Kết hợp các loại chỉ tiêu:

- Chỉ tiêu phản ánh về công dụng của thuốc (độ tinh khiết và hàm lượng)

- Chỉ tiêu về mức độ tin cậy và độ an toàn (độc tính, độ bền, hạn dùng)

- Tiêu chuẩn về sinh lý (dạng thuốc, đường dùng)

- Chỉ tiêu về thẫm mỹ (hình thức trình bày, đóng gói, bảo quản)

Dựa trên các nội dung chính của yêu cầu kỹ thuật, căn cứ vào thực tế, lựa chọn ra các chỉ tiêu thích hợp, không quá nhiều hoặc quá ít nhưng đủ nói lên đặc trưng chất lượng thuốc, phù hợp với nhiều điều kiện cụ thể

Xây dựng được mức cho các chỉ tiêu trên

- Độc tính trường diễn: thời gian thử ít nhất 6 tháng có gây ra độc tính gì hay không

- Độc tính trên sinh sản: trứng, tinh trùng trên di truyền ảnh hưởng đến nhiễm sắc thể

- Thuốc có bản chất kháng nguyên: có thể gây sốc phản vệ, cần đánh giá độc tính trên sinh miễn dịch

9) Nghiên cứu tổng hợp quy mô công nghiệp

10) Thử lâm sàng

Khi đã đáp ứng yêu cầu của phép thử tiền lâm sàng, thuốc sẽ chuyển sang giai đoạn thử

nghiệmlâm sàng Đây là 1 giai đoạn tốn nhiều thời gian, kinh phí và phải theo đúng quy định của pháp luật về thử thuốc trên lâm sàng

11) Đăng ký sản xuất và lưu hành

Tiến hành lập hồ sơ đăng ký theo quy định nếu kết quả lâm sàng pha III của thuốc tốt Sau khi được cơ quan có chức năng quản lý phê duệt, thuốc mới chính thức được sản xuất và lưu hành trên thị trường

12) Đăng ký bảo hộ bản quyền phát minh sáng chế

13) Chuyển giao công nghệ, ứng dụng

Câu 4: Mô tả các bước cơ bản trong tiến trình nghiên cứu thuốc mới từ dược liệu (Ver 2)

B1: Lựa chọn đối tượng đưa vào nghiên cứu

B2: Qúa trình thu mẫu và xác định tên khoa học

B3: Nghiên cứu về thành phần hóa học (Qúa trình làm khô và làm mịn, lựa chọn phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, định lượng, tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, cao nguyên liệu) B4: Thử tiền lâm sàng (thử độc tính và tác dụng sinh học trên động vật thí nghiệm)

B5: Nghiên cứu chiết xuất ở quy mô công nghiệp

B6: Nghiên cứu dạng bào chế sản phẩm

B7: Thử nghiệm lâm sàng

B8: Đăng kí sản xuất, lưu hành

B9: Đăng kí sở hữu trí tuệ

 Phân tích các bước

1) Lựa chọn đối tượng đưa vào nghiên cứu

 Lựa chọn mẫu hoàn toàn ngẫu nhiên

- Dễ bắt gặp kết quả mới

- Tốn kém và khả năng thành công không cao

 Lựa chọn từ các bài thuốc giân dan hoặc thông qua kiến thức Y học dân tộc cổ truyền

- Thực hiên điều tra

- Sử dụng tài liệu liên quan đến cây thuốc, tri thức làm thuốc

- Chia sẻ lợi ích

 Lựa chọn thông qua tài liệu tham khảo

- Các loài trong cùng 1 chi hoặc các chi trong cùng 1 họ thì có thể chứa các nhóm hợp chất tương đồng

- Khảo sát các loài trong 1 họ, 1 chi, 1 vùng địa lí cụ thể hoặc tại 1 địa phương

 Lựa chọn bệnh

- Phụ thuộc vào mục tiêu kinh tế (bệnh phổ biến, thị trường tiềm năng mang lại giá thành cao)- đầu tư từ các công ty Dược

- Bệnh hiếm gặp- cần sự đầu tư từ Chính phủ

2) Thu mẫu và xác định tên khoa học

 Mẫu đạt chất lượng từ các cá thể khỏe mạnh không bị nhiêm sâu bệnh (vi khuẩn, nấm, virut…)

 Mẫu thu nên lưu ý các điều kiện môi trường sống như nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa, lượng chiếu sáng, tính chất đất, độ cao về mặt địa lý

- Trường hợp chúng ta cần thu lại hoặc trồng lại các mẫu đó để đảm bảo giữ nguyên được bản chất và hàm lượng các hoạt chất mục tiêu

- Đảm bảo an toàn nhất trong việc lấy lại mẫu là nên tiến hành ở cùng một địa điểm, cùng thời gian thu hái trong năm so với mẫu gốc

- Cần để ý thu hái hợp lý để không phá vỡ hệ sinh thái hợp của địa phương

- Việc thu mẫu ở những khu vực khó như rừng mưa nhiệt đới hay trong rừng sâu cũng nên cân nhắc trong trường hợp nhiều khả năng phải thu lại mẫu

 Thu mẫu

- Đúng bộ phận

+ Theo thông tin đã tham khảo

+ Thu mẫu để sàng lọc thì nên tách riêng nếu có thể

- Tuổi cây

- Thời điểm mùa vụ thu hái

Làm mẫu lưu và xác định tên khoa học

 Chuẩn bị các tiêu bản thực vật: mẫu khô, mẫu tươi ngâm và ảnh chụp

- Cơ quan sinh sản là hoa và quả

 Lưu mẫu tại các phòng thí nghiệ có chức năng lưu trữ tiêu bản (có thể là cấp quốc gia hoặc cấp địa phương

- Có kí hiệu mẫu số

- Có lưu giữ trong điều kiện phù hợp để bảo quản lâu dài và có thể đối chiếu tham khảo lại khi cần thiết

 Nhãn tiêu bản yêu cầu có đầy đủ thông tin

- nơi thu mẫu

- độ cao

- điều kiện môi trường

- tính chất mẫu lưu

- bộ phận thu mẫu

- tên người thu mẫu

- thời gian thu mẫu

Xác định chính xác tên khoa học

 Định hướng nghiên cứu về thành phần hóa học

- Thông tin các hợp chất đã được tách chiết từ các loài đó hoặc các loài gần trong chi, trong họ

- Sẽ giúp lựa chọn các phương pháp chiết xuất phân lập phù hợp, rút ngắn được thời gian và kinh phí nghiên cứu

 Giúp cho công bố chính xác

 Chuyên gia chuyên ngành thực vật học nên tham gia vào quá trình này

 Có thể kèm theo biên bản giám định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu

3) Nghiên cứu về thành phần hóa học

Qúa trình làm khô và làm mịn, lựa chọn phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, định lượng, tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, cao nguyên liệu,…

4) Thử tiền lâm sàng

- Trước khi đưa vào thử lâm sàng, các thuốc phải trải qua một bước thử độc tính tiền lâm sàng, đây là bước thử cần thiết để đánh giá độc tính của thuốc, đảm bảo thuốc khi đưa vào thử lâm sàng là an toàn

- Thông thường phép thử độc tính đầu tiên được tiến hành trên in vitro, tiếp theo là các phép thử trên động vật thực nghiệm như thỏ, chó, lợn, khỉ để kiểm tra độc tính in vivo của thuốc

- Thuốc được đưa vào động vật thí nghiệm với các liều khác nhau trong các thời gian khác nhau, sau đó phân tích mô học và sinh hóa để xác định các dấu hiệu của độc tính, biến dị tế bào hay ung thư

- Thử độc tính tiền lâm sàng bao gồm xác định độc tính cấp và độc tính trường diễn

- Độc tính của thuốc thường được đánh giá qua giá trị LD50 Tuy nhiên, giá trị này chỉ phản ánh độc tính cấp của thuốc chứ không phản ánh các độc tính mãn

- Vì vậy để đánh giá độc tính toàn diện của thuốc hiện nay phải dùng nhiều loại phép thử in

vitro và in vivo khác nhau

5) Nghiên cứu chiết xuất ở quy mô công nghiệp

- Cung cấp đủ lượng dịch chiêt cho bào chế dạng thuốc dùng trong thử lâm sàng

- Xác định quy trình chiết suất tối ưu: với các thông số chiết xuất tối ưu như độ mịn của dược liệu, loại dm, tỷ lệ dung môi/dược liệu, phương pháp chiết => đảm bảo chất lượng

cao chiết tốt nhất, hiệu quả kinh tế nhất

6) Nghiên cứu dạng bào chế sản phẩm

Xác định dạng bào chế, xây dựng và tối ưu hóa công thức Tùy theo dạng bào chế mà chọn lựa dược chất, tá dược, bao bì đóng gói thích hợp

Khi thiết kế dạng thuốc phải xem xét mối tương quan giữa các thành phần trong dạng thuốc dưới

sự tác động của kĩ thuật bào chế nhằm tìm ra phương pháp tối ưu cho sản phẩm

Thử nghiệm lâm sàng thuốc là hoạt động khoa học nghiên cứu một cách hệ thống trên người nhằm:

- Đánh giá hiệu quả lâm sàng,

- Nhận biết và phát hiện các phản ứng bất lợi,

- Nghiên cứu sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ của thuốc

>>> Nhằm mục đích chứng minh sự an toàn và hiệu quả của thuốc thử nghiệm

- Trung bình đối với một nghiên cứu thuốc mới, thời gian nghiên cứu lâm sàng kéo dài từ 5 – 10 năm và trải qua 4 giai đoạn (pha I, pha II, pha III và pha IV)

- Phải tuân thủ các quy định nghiêm ngặt khi thử nghiệm trên người cũng như các quy định

về y đức

3 pha lâm sàng cần phải thử:

- Pha I: thử để xác định liều trên người tình nguyện, thường là người khỏe mạnh

- Pha II: thử để xác định hiệu quả điều trị trên người bệnh

- Pha III: thử để so sánh với các phác đồ điều trị hiện có

- Pha IV: đánh giá tác dụng phụ lâu dài (nghiên cứu post-marketing)

8) Đăng kí, sản xuất, lưu hành

Tiến hành lập hồ sơ đăng kí thuốc theo đúng quy định nếu kết quả lâm sàng pha III của thuốc tốt Sau khi được cơ quan có chức năng quản lý phê duyệt, thuốc mới chính thức được sản xuất và lưu hành trên thị trường

Việc xem xét đánh giá hồ sợ được thực hiện bởi Hội đồng chuyên gia tư vấn độc lập không có mâu thuẫn về quyền lợi đối với nhà đăng kí

9) Đăng kí sở hữu trí tuệ

Đăng kí bảo hộ độc quyền phát minh sáng chế ngay sau khi tổng hợp được và thử tác dụng thấy

có triển vọng với Cục sở hữu trí tuệ Thời gian bảo hộ là 20 năm tính từ thời điểm đăng kí

Câu 5: Phân tích vai trò và ý nghĩa của quá trình lựa chọn đối tượng nghiên cứu trong tiến trình nghiên cứu thuốc mới từ dược liệu

* Vai trò: Tùy từng mục tiêu lựa chọn mà có vai trò khác nhau:

- Lựa chọn ngẫu nhiên:

+ Tìm ra những chất mới với hoạt tính mới, nghiên cứu tạo ra sản phẩm thuốc mới  đáp ứng nhu cầu sử dụng của con người

+ Tìm ra những cấu trúc mới, chiết xuất làm nguyên liệu hoặc đóng vai trò chất dẫn đường  tổng hợp, bán tổng hợp thuốc có tác dụng mạnh hơn

+ Có thể vận dụng tối đa nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có, tránh lãng phí

- Lựa chọn nhờ tai nguyên tham khảo: Các loài thuốc cùng một chi, họ thường tương tự nhau về thành phần hóa học và tác dụng sinh học

+ Giúp chọn lựa được những đối tượng với hoạt tính tốt, ít độc tính để thay thế những đối tượng không phù hợp

+ Hoặc đóng vai trò như tiền chất để bán tổng hợp thuốc mới

- Lựa chọn từ bài thuốc dân gian, y học dân tộc: Giúp duy trì và phát huy được những tri thức của dân tộc, vận dụng một cách phù hợp hơn với xã hội hiện đại ngày nay Không làm mất những kiến thức hữu ích đã tồn tại hàng trăm năm qua

- Lựa chọn bệnh:

+ Nhằm cung cấp những thuốc đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cấp thiết, phổ biến

+ Đối với bệnh hiếm gặp: tạo cơ hội sống cho nhiều người, sản phẩm mang tính độc quyền cho nhà sản xuất

+ Theo mục tiêu kinh tế: Vừa đáp ứng nhu cầu xã hội, vừa mang lại tiềm năng kinh tế lớn, hay

có thể giảm được chi phí sản xuất đối với những thuốc đã sản xuất với chi phí cao

* Ý nghĩa:

- Có ý nghĩa quyết định thành công của quá trình nghiên cứu, các bước sau của quy trình nghiên cứu đều phụ thuộc vào đối tượng nghiên cứu

- Điều hướng cho các bước nghiên cứu tiếp theo trong trình tự nghiên cứu:

+ Là cơ sở định danh xác định đặc tính về thực vật học  từ đó thu hái đúng đối tượng

+ Quy trình chiết xuất phân đoạn

+ Lựa chọn mô hình thử nghiệm

- Đây là một bước vô cùng quan trọng trọng trong quy trình nghiên cứu, vì vậy phải được tiến hành một cách kỹ càng, thỏa mãn, đáp ứng các nhu cầu của cộng đồng, xã hội

Câu 6: Thử nghiệm in vitro là gì? hãy nêu ưu và nhược điểm của thử nghiệm in vitro? Thử nghiệm in vitro có vai trò như thế nào trong sàng lọc dược liệu? Thiết kế thử nghiệm in vitro bao gồm những bước cơ bản nào?

1 Thử ngiệm in vitro là gì?

- Thử nghiệm in vitro là phép thử thường được tiến hành trong ống nghiệm, đĩa peptri…

và không liên quan đến động vật mà chỉ sử dụng tế bào, enzym…

- Thử nghiệm in vitro có thể thử trên :

+ Môi trường nuôi cấy như vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm…), tế bào (tế bào ung thư ), virus

+ Đích tác dụng : enzym, receptor…

2 Ưu nhược điểm

- Ưu điểm

+ Ít tốn kém, dễ thiết lập

+ Có độ lặp lại và độ nhạy cao

+ Có thể tiến hành trong các hệ thống thử nghiệm ít phức tạp

+ Có thể tự động hóa

+ Tính toán kết quả nhanh

+ Dễ kiểm soát chất lượng thí nghiệm

+ Có thể sử dụng tế bào người nên hạn chế được yếu điểm phải ngoại suy từ động vật sang người

- Quan sát đồng thời được nhiều thông số

- Cần thiết cho một số nghiên cứu không thể thực hiện được trên in vitro hoặc cho nghiên cứu các bệnh mãn tính

Nhược - Thử các tác dụng cấp, không

đánh giá được tác dụng lâu dài

- Không thấy được ảnh hưởng

của quá trình trao đổi chất

- Không nghiên cứu được khả

năng hấp thu hoặc sinh khả

- Vấn đề về đường dùng và liệu lượng

- Vấn đề đạo đức trong thử nghiệm trên súc vật

Vai trò của thử nghiệm in vitro trong sàng lọc tự nhiên

- Thế giới

+ <2500/800000 loài thực vật được nghiêm cứu một cách đầy đủ, các nghiên cứu về động vật làm thuốc cũng như sinh vật biển còn khá hạn chế

+ tiềm năng cung cấp các hợp chất mới với cấu trúc vô cùng đa dạng mà các nhà tổng hợp không thể nghĩ tới

- Việt nam

+ Hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng

+ Đường bờ biển dài trên 3260km, phát hiện có khoảng 11000 loài sinh vật cư trú

 Còn một khối lượng vô cùng lớn dành cho các nhà nghiên cứu

 Thử nghiệm in vitro thường được lựa chọn trong nghiên cứu sàng lọc ban đầu, góp phần định hướng cho các nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học

3 Thiết kế thử nghiệm in vitro bao gồm các bước cơ bản sau

- Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

- Lựa chọn tác dụng cần thử nghiệm in vitro

- Mô hình nghiên cứu tác dụng in vitro có thể có nhiều phương pháp -> xác định phương pháp thử nghiệm

- Lựa chọn thuốc đối chiếu (chứng dương) cho mô hình đã lựa chọn

- Chuẩn bị mẫu thử, dung môi, hóa chất và thuốc thử cần thiết sử dụng trong thử nghiệm

- Chuản bị hỗn hợp phản ứng

- Lựa chọn phương pháp phát hiện (đánh giá kết quả trước và sau khi them mẫu thử thì có gì thay đổi hay không, nếu có thay đổi thì mức độ thay đổi như thế nào)

- Xử lí số liệu và đánh giá kết quả

Câu 7: Mục đích nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa in vitro? Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu chống oxi hóa in vitro bằng phương pháp sử dụng DPPH? Thiết kế nghiên cứu tác dụng chống oxi hóa in vitro bằng phương pháp sử dụng DPPH gồm những bước cơ bản nào?

+ hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sang của dung dịch thử nghiệm so với chất đối chứng, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517nm

- Thiết kế nghiên cứu gồm các bước:

B1: Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

B2: Xác định mô hình thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa in vitro, lựa chọn thuốc đối chiếu (Chọn mô hình DPPH)

B3: chuẩn bị mẫu thử và các dung môi, hóa chất, thuốc thử cần thiết sử dụng trong mô hình

đã lựa chọn thuốc đối chiếu Cụ thể:

+ Chuẩn bị dung dịch DPPH

+ Chuẩn bị dung dịch thử

+ Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chứng dương): thường sử dụng rutin, quercetin, acid

ascorbic, acid gallic, catechin, glutathione…

+ Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng ( dung dịch thử + dung dịch DPPH + dung môi)

+ lắc đều các ống, để ổn định trong bóng tối, ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

B4: Phương pháp đánh giá: Phương pháp đo quang, đo độ hấp thụ của mẫu thử, mẫu trắng, mẫu chứng, chứng dương tại λ = 517nm

- Mục đích

Xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng gây độc tế bào hay không, mức độ tác dụng in vitro như thế nào và cơ chế tác dụng là gì

- Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT

+ Đánh giá khả năng sống sót của tế bào thong qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành phức hợp formazan( màu tím) bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể của tế bào sống

+ Lượng formazan tạo ra tỉ lệ thuận với lượng tế bào sống trong môi trường nuôi cấy và được xác định bằng phương pháp đo quang

+ Nếu chất thử nghiệm có hoạt tính gây độc tế bào thì số lượng tế bào sống giảm và giá trị

OD giảm

- Các bước cơ bản của phương pháp MTT

B1: lựa chọn đối tượng nghiên cứu

B2: Xác định mô hình thử nghiệm hoạt tính gây độc TB in vitro : Phương pháp MTT

Chọn thuốc đối chiếu: ellipticine, doxorubicin, vincristine,…

B3 : Lựa chọn dòng TB ung thư cần nghiên cứu và tiến hành nuôi cấy TB ung thư

+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào

+ Cho TB và môi trường nuôi cấy TB vào giếng, ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2 trong 24h

B4: Chuẩn bị mẫu thử và các thuốc thử, dung môi, hóa chất cần thiết

B5: Cho mẫu thử/mẫu chứng / mẫu chứng dương (thuốc đối chiếu) vào các giếng có TB đã

nuôi cấy

+ Cho chất thử vào giếng, ủ ở 37oC, 5% CO2 sau 24 – 72h, loại bỏ môi trường nuôi cấy ( sử dụng phương pháp ly tâm)

+ Cho MTT vào giếng, ủ ở 37oC/4h

+ Thêm dung môi (DMSO/SDS/DMF…) để hòa tan formazan tạo thành

B6: Đo quang ở bước sóng thích hợp ( 540nm, 570nm, 595nm…)

B7: Tính toán kết quả, xử lí số liệu

MTT

(vàng)

Formazan (tím đen)

Hoạt lực của thuốc tương ứng với lượng

giảm Formazan

Câu 9: Mục đích của nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro? Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro theo phương pháp của Noro? Thiết kế nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro theo phương pháp của Noro bao gồm những bước cơ bản nào?

 Mục đích: xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric hay

không và mức độ tác dụng in vitro như thế nào

 Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu:

Dựa trên phản ứng :

Xanthin +H2O +O2 → acid uric + H2O2

Hoạt độ XO được xác định thông qua việc định lượng acid uric tạo thành,được đo độ hấp thụ ở λ=290nm ở 25oC

 Các bước tiến hành:

1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

2 Chuẩn bị mẫu thử và các thuốc thử, dung môi, hóa chất cần thiết

- Chuẩn bị mẫu thử: hòa tan trong dung môi thích hợp, sau đó pha loãng bằng dung dịch đệm thành các dung dịch có nồng độ cần nghiên cứu

- Chuẩn bị dung dịch enzym xanhthin oxidase (pha trong đệm phosphat, pH=7.5, được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và dung dịch xanhthin

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng:

mẫu thử / mẫu chứng / mẫu đối chiếu + dung dịch đệm + dung dịch enzym →ủ ở

15oC/15 phút, sau đó thêm xanhthin → ủ ở 25oC/30 phút Ngừng phản ứng bằng cách cho thêm HCl 0.1N

- Mẫu trắng của thử / chứng / đối chiếu được tiến hành tương tự nhưng thay đổi trình tự enzym cho vào (enzym được cho vào sau HCl 0.1N)

3 Đo quang ở λ=290nm

4 Tính toán kết quả, xử lý số liệu

%Ứ𝐜 𝐜𝐡ế =∆𝐎𝐃 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠 − ∆𝐎𝐃 𝐭𝐡ử

∆OD chứng=OD chứng-OD trắng chứng

∆OD thử=OD thử-OD trắng thử

Câu 10: Mục đích của nghiên cứu tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro? Nguyên tắc của mô hình nghiên cứu tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro theo phương pháp của Elliman? Thiết kế nghiên cứu tác dụng ức chế enzym

acetylcholinesterase in vitro theo phương pháp của Elliman bao gồm những bước cơ bản nào?

 Mục đích: xác định mẫu thử nghiên cứu có tác dụng ức chế acetylcholinesterase hay

không và mức độ tác dụng in vitro như thế nào

 Nguyên tắc (Ellman):

Cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin Thiocholin phản ứng

với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid (có màu vàng) Hợp chất

này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412nm

 Thiết kế nghiên cứu:

1 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu

2 Chuẩn bị mẫu thử và các thuốc thử, dung môi, hóa chất cần thiết

- Chuẩn bị dung dịch enzym, dung dịch đệm, dung dịch đối chiếu

- Chuẩn bị mẫu thử

- Thêm lần lượt dung dịch gồm: dung dịch đệm tris-HCl ph=8, dung môi hoặc mẫu thử và dung dịch enzym vào từng giếng của đĩa 96 giếng Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở 25oC/15 phút

- Dung dịch thuocs thử DTNB và dung dịch cơ chất ATCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp

và trộn đều Tiếp tục ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian nhất định ở 25oC

3 Đo độ hấp thụ ở 412nm

4 Tính toán kết quả và xử lý số liệu:

𝑰% = 𝟏 − 𝐀 𝐭𝐡ử

𝑨 đố𝒊 𝒄𝒉ứ𝒏𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎%

Câu 11 phương pháp tính diện tích bề mặt cơ thể (BSA)

– Xác định diện tích bề mặt cơ thể bằng công thức

Diện tích bề mặt cơ thể người theo cân nặng và chiều cao, công thức DuBois (1916):

BSA=a*W0,425*H0.725

Trong đó: BSA:diện tích bề mặt cơ thể(cm2)

a : hằng số đối với mỗi loài động vật, với người a=71.84

W: khối lượng cơ thể(kg)

H: chiều cao (cm)

– Xác định diện tích cơ thể bằng toán đồ:

Trong phương pháp này, có thể sử dụng chung một toan đồ cho cả trẻ em va người lớn Tuy nhiên, để kết quả tính được chính xác hơn, người ta còn xây dựng toán đồ cho trẻ em Để sử dụng toán đồ cần sử dụng một thước thẳng, đặt mép thước vào giá trị chiều cao và cân nặng của người cần xác định, điểm giao với cột diện tích ở giữa cho biết diện tích bề mặt cơ thể tương ứng Trong thực hành sử dụng thuốc, nếu tính liều theo tuổi thì thường phải ghi chi tiết liều cho người lớn là bao nhiêu, liều của trẻ em, chẳng hạn 1-2 tuổi, 3-5 tuổi, 6-9 tuổi là bao nhiêu Còn khi hướng dẫn liều dùng theo diện tích bề mặt cơ thể thì chỉ có một liều chung cho tất cả các lứa tuổi

Câu 12: Phương pháp xác định độc tính của thuốc (theo tác giả Đỗ Trung Đàm (2014))

1 Các định nghĩa liên quan