Trên thị trường ngày nay xuất hiện nhiều chế phẩmy học cổ truyền, thực phẩm chức năng có thành phầntừ dược liệu và xu hướng sử dụng những loại thuốc cónguồn gốc từ dược liệu của người dân ngày càng tăng.Do đó, thị trường dược liệu ngày một sôi động, nhưngchất lượng dược liệu đang là một vấn đề nhức nhối củacả cộng đồng. Nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càngtăng kéo theo hiện tượng giả mạo, kém chất lượng vànhầm lẫn dược liệu cũng ngày càng phổ biến.Để kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các chếphẩm y học cổ truyền, vấn đề thiết lập dược liệu chuẩncó ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, chúng tôi xây dựngbộ hình ảnh soi bột và sắc ký lớp mỏng của một số dượcliệu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V 1, nhằm cungcấp bộ hình ảnh dữ liệu chuẩn, có ý nghĩa thiết thựcphục vụ cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng dượcliệu và chế phẩm thuốc y học cổ truyền
BỘ DỮ LIỆU HÌNH ẢNH SOI BỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA DƯỢC LIỆU CHUẨN ĐỂ THAM KHẢO ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRẦN THỊ KIM NINH, VÕ THỊ HƯỜNG, BÙI THÁI THẢO LY Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Bình Định Từ khóa: Soi bột, sắc ký lớp mỏng, dược liệu chuẩn, Huyền sâm, Hà thủ ô đỏ, Độc hoạt, Hy thiêm, Thăng ma Đặt vấn đề Trên thị trường ngày xuất nhiều chế phẩm y học cổ truyền, thực phẩm chức có thành phần từ dược liệu xu hướng sử dụng loại thuốc có nguồn gốc từ dược liệu người dân ngày tăng Do đó, thị trường dược liệu ngày sơi động, chất lượng dược liệu vấn đề nhức nhối cộng đồng Nhu cầu sử dụng dược liệu ngày tăng kéo theo tượng giả mạo, chất lượng nhầm lẫn dược liệu ngày phổ biến Để kiểm tra chất lượng dược liệu chế phẩm y học cổ truyền, vấn đề thiết lập dược liệu chuẩn có ý nghĩa quan trọng Vì vậy, chúng tơi xây dựng hình ảnh soi bột sắc ký lớp mỏng số dược liệu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V [1], nhằm cung cấp hình ảnh liệu chuẩn, có ý nghĩa thiết thực phục vụ cho cơng tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu chế phẩm thuốc y học cổ truyền Thực nghiệm 2.1 Hóa chất, thiết bị - Kính hiển vi MBL 2000 – T – PL – 30W; - Máy ảnh kỹ thuật số Sony 16.1; - Các dung mơi, hóa chất, thuốc thử đạt tinh khiết phân tích theo qui định DĐVN V; - Các thiết bị, dụng cụ thủy tinh cần thiết 2.2 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Các dược liệu chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh Dược liệu Huyền sâm 20 - Huyền sâm (Radix Scrophulariae), số lô: 13DL 020; - Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae), số lô: CV 0215018.01; - Độc hoạt (Radix Angelicae pubescentis), số lô: CV 0116026.01; - Hy thiêm (Herba Siegesbeckiae), số lô: CV 0117080.01; - Thăng ma (Rhizoma Cimicifugae), số lô: 10062016 Các mẫu thử dược liệu Huyền sâm, Hà thủ ô đỏ, Độc hoạt, Hy thiêm Thăng ma mẫu lấy thị trường 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp soi bột: Tiến hành theo Dược điển Việt Nam V [2] Bột dược liệu chuẩn nghiền rây qua rây có kích thước lỗ rây 25 µm Quan sát kính hiển vi MBL 2000-T-PL-30W - Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Tiến hành theo Dược điển Việt Nam V [3] Kết bàn luận 3.1 Dược liệu Huyền sâm 3.1.1 Phương pháp soi bột - Bột màu nâu đen, vị mặn - Soi kính hiển vi thấy: Nhiều tế bào mơ cứng riêng lẻ hay tụ thành đám, hình chữ nhật, vng, trịn hình thoi, thành dày, ống trao đổi nhỏ Mạch gỗ hầu hết mạch vạch Mảnh bần gồm tế bào nhiều cạnh đặn có thành dày Mảnh mơ mềm Hạt tinh bột nhỏ, hình trịn nằm rải rác Mạch điểm Sợi gỗ ( Hình 1) Mảnh mơ mềm Mạch vạch Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) Hạt tinh bột Mảnh bần Tế bào mô cứng Mạch điểm Sợi gỗ Hình Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Huyền sâm 3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 - Dung môi khai triển: Cloroform – methanol – nước (12:4:1) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu Huyền sâm mẫu lấy thị trường, thêm 25 ml methanol, lắc để ngâm h, lắc siêu âm 30 phút, lọc, để bay dịch lọc đến cạn Thêm vào cắn 25 ml nước, lắc với n-butanol bão hòa nước lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết n-butanol, cách thủy đến cạn Hịa cắn với ml methanol dùng làm dung dịch thử Dung môi khai triển Soi UV 254 nm - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy g bột Huyền sâm (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký đến dung môi khoảng cm, lấy mỏng ra, để khô khơng khí Phun dung dịch thuốc thử vanilin 5% acid sulfuric Sấy mỏng 105°C đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 2) Soi UV 366 nm Phun dung dịch Vanilin5%/H2SO4 Rf = 0,7 Cloroform – methanol – nước (12:4:1) Rf = 0,3 Hình Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Huyền sâm Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 21 3.2 Dược liệu Hà thủ đỏ hình gần trịn, rốn hình hay phân nhánh Mạch 3.2.1 Phương pháp soi bột - Bột mùi nhẹ, màu nâu hồng, vị chát - Soi kính hiển vi thấy: Nhiều hạt tinh bột đơn kép đôi, kép ba, nằm riêng lẻ kết thành khối, điểm Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Mảnh bần gồm Mảnh bần Mảnh mô mềm tế bào hình đa giác thành dày có màu đỏ nâu Mảnh mơ mềm có tế bào thành mỏng chứa tinh bột Sợi nhỏ dài có vách dày với nhiều ống trao đổi (Hình 3) Sợi Hạt tinh bột Hình Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Hà thủ ô đỏ 3.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 - Dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol - nước (100:17:13) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu Hà thủ ô mẫu lấy thị trường, thêm 20 ml ethanol 96%, đun hồi lưu cách thủy 30 phút, để nguội, lọc, để bay dịch lọc đến cạn Thêm vào cắn 10 ml nước ml dung dịch acid hydrocloric 10%, đun hồi lưu cách thủy 30 phút, để nguội sau lắc với ether ethylic lần, lần 20 ml Gộp dịch chiết ether, để bay tự nhiên khoảng ml dùng làm dung dịch thử Dung môi khai triển Ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) Tinh thể calci oxalat Hơi amoniac Mạch điểm - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khô khơng khí Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Sau cho mỏng tiếp xúc với amoniac Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 4) Soi UV 254 Soi UV 366 Rf = 0,5 Hình Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Hà thủ ô đỏ 22 Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 3.3 Dược liệu Độc hoạt 3.3.1 Phương pháp soi bột - Bột màu nâu nhạt - Soi kính hiển vi thấy: Nhiều hạt tinh bột hình trịn, có rốn hạt chấm nhỏ dạng kẽ nứt, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám Mảnh bần màu nâu hình đa giác thành dày Mảnh mơ mềm thành mỏng chứa hạt tinh bột Mạch vạch Mạch mạng Sợi dài Ống dẫn dầu, ống dẫn dầu có dịch tiết màu nâu vàng [5] (Hình 5) Dược liệu Độc hoạt Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột Mạch vạch Hạt tinh bột Mảnh bần Mạch mạng Sợi Ống dẫn dầu Ống dẫn dầu có dịch tiết màu nâu vàng Hình Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Độc hoạt 3.3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 - Dung môi khai triển: Cyclohexan – ethyl acetat – aceton (8:2:0,5) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu Độc hoạt mẫu lấy thị trường, thêm 10 ml ether, ngâm qua đêm, lọc Để bay dịch lọc tới khơ, hịa tan cắn ml cloroform - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy g bột Độc hoạt (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ khơng khí Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết phát huỳnh quang màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 6) Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 23 Dung môi khai triển Cyclohexan - ethyl acetat - aceton Ánh sáng thường Soi UV 254 Soi UV 366 Rf = 0,4 (8:2:0,5) Hình Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Độc hoạt 3.4 Dược liệu Hy thiêm 3.4.1 Phương pháp soi bột - Bột màu lục xám - Soi kính hiển vi thấy: Lơng che chở đa bào, dài thường có tế bào đến tế bào xếp thành hàng, vách ngăn tế bào phình to đặc biệt, tế bào gần đầu lông dài nhỏ dần Hai loại lơng tiết: Loại đầu hình cầu đa bào, chân đơn bào loại đầu hình cầu đơn bào, chân đa bào Mảnh biểu bì mang lỗ khí Mảnh mơ mềm cấu tạo tế bào hình trịn, thành mỏng Sợi đứng riêng lẻ tập trung thành bó, tế bào sợi ngắn nhỏ, khoang rộng Hạt phấn hoa hình cầu gai tương đối to, gai thưa nhọn, bề mặt có lỗ rãnh, màu vàng nhạt Mảnh cánh hoa gồm tế bào màu vàng nhạt, thành mỏng Mảnh mạch vạch Mạch mạng (Hình 7) 24 Lơng che chở Lơng tiết Lỗ khí Mảnh mô mềm Hạt phấn hoa Mạch vạch Sợi Mảnh cánh hoa Hình Hình ảnh soi bột Dược liệu chuẩn Hy thiêm Mạch mạng Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 3.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 - Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat - aceton - acid formic (15:2:2:1) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu Hy thiêm mẫu lấy thị trường, thêm 30 ml ethyl acetat, lắc siêu âm 30 phút, lọc, để bay dịch lọc tới khơ, hịa tan cắn ml ethanol 96% làm dung dịch thử - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy g bột Hy Dung môi khai triển Ánh sáng thường thiêm (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Phun dung dịch thuốc thử vanilin 5% acid sulfuric, sấy mỏng 1200C đến rõ vết Quan sát ánh sáng thường Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 8) Soi UV 254 nm Soi UV 366 nm Phun dung dịch thuốc thử vanilin 5%/H2SO4 Toluen - ethyl acetat - aceton - acid formic (15:2:2:1) Hình Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Hy thiêm 3.5 Dược liệu Thăng ma 3.5.1 Phương pháp soi bột Tế bào biểu bì Mảnh mạch điểm Mạch vạch Mảnh mô mềm Hạt tinh bột Tế bào mô cứng Sợi libe Tế bào mô mềm hóa gỗ Sợi gỗ Hình Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Thăng ma Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 25 - Bột màu xám đen, mùi thơm nhẹ - Soi kính hiển vi thấy: Tế bào biểu bì [6] có màu nâu nhạt, hình chữ nhật hình đa giác thành dày Mảnh mạch điểm Mạch vạch Mảnh mô mềm mang thể cứng chứa hạt tinh bột Tế bào mô cứng thành dày, đứng thành đám riêng lẻ Sợi libe thành dày, sợi libe bó hẹp kéo dài Sợi gỗ Tế bào mơ mềm hóa gỗ có hình chữ nhật Hạt tinh bột hình trịn, rốn khơng rõ, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, Hình 3.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60 F254 - Dung môi khai triển: Toluen – cloroform – acid acetic (6:1:0,5) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu Thăng ma mẫu lấy thị trường, thêm 50 ml ethanol 96%, đun sôi hồi lưu h, lọc Để bay dịch lọc tới khơ, hịa tan cắn ml ethanol làm dung dịch thử - Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy g bột dược liệu Thăng ma (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần dung dịch thử Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Sau triển khai sắc ký, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết phát huỳnh quang màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 10) Dung môi khai triển Soi UV 254nm Soi UV 366nm Toluen – cloroform – acid acetic (6:1:0,5) Hình 10 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Thăng ma Kết luận Kết nghiên cứu xây dựng liệu chuẩn phương pháp soi bột sắc ký lớp mỏng theo Dược điển Việt Nam V dược liệu chuẩn Huyền sâm, Hà thủ ô đỏ, Độc hoạt, Hy thiêm, Thăng ma góp phần nhỏ việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho vị dược liệu trên, giúp cho trình kiểm tra chất lượng dược liệu chế phẩm từ dược liệu, phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu Tài liệu tham khảo Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Tập 2, trang 1199, 1180, 1171, 1206, 1336 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Tập 2, PL12.18 “Định tính dược liệu chế phẩm kính hiển vi”, PL-283 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Tập 2, PL5.4 “Phương pháp sắc ký lớp mỏng” Chinese Pharmacopoeia Commision (2015), Pharmacopoeia of the People’s Republic of China Hong Kong Chinese Materia Medica Standards (HKCMMS), Volume 2, Volume Indian herbal drug microscopy SUMMARY Examing quality of five herbs including Radix Scrophulariae, Radix Fallopiae multiflorae, Radix Angelicae pubescentis, Herba Siegesbeckiae, Rhizoma Cimicifugae lappae was carried out the method for thin layer chromatography and microscopical followed by Vietnamese Pharmacopoeia fifth edition (VP V) (Ngày nhận bài: 24/02/2020 ; Ngày phản biện: 10/08/2020 ; Ngày duyệt đăng: 16/12/2020) 26 Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) ... vàng [5] (Hình 5) Dược liệu Độc hoạt Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột Mạch vạch Hạt tinh bột Mảnh bần Mạch mạng Sợi Ống dẫn dầu Ống dẫn dầu có dịch tiết màu nâu vàng Hình Hình ảnh soi bột dược liệu. .. Rf = 0 ,5 Hình Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Hà thủ ô đỏ 22 Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72) 3.3 Dược liệu Độc hoạt 3.3.1 Phương pháp soi bột - Bột màu nâu nhạt - Soi kính...Hạt tinh bột Mảnh bần Tế bào mô cứng Mạch điểm Sợi gỗ Hình Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Huyền sâm 3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng - Bản mỏng: Silica gel 60 F 254 - Dung môi khai