TIỂU LUẬN MÔN HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Đề tài Các phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột Giáo viên hướng dẫn Học viên thực hiện Lớp Hà Nội, 2021 MỤC LỤC 1 Trình bày về cách tính và ý nghĩa của gi.
TIỂU LUẬN MÔN HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Đề tài: Các phương pháp sắc ký lớp mỏng sắc ký cột Giáo viên hướng dẫn: Học viên thực hiện: Lớp: Hà Nội, 2021 MỤC LỤC Trình bày cách tính ý nghĩa giá trị Rf Khi thực sắc ký mỏng, giá trị Rf bị ảnh hưởng yếu tố nào? Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để định tính, thử tinh khiết để bán định lượng định lượng hoạt chất thuốc Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh chấm hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành lớp mỏng đồng cố định phiến kính phiến kim loại Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển lớp mỏng, theo hướng pha động, với tốc độ khác Kết thu sắc ký đồ lớp mỏng Cơ chế tách chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp đồng thời nhiều chế tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi làm pha động Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuỵển chất phân tích hệ số di chuyển R f tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi: Rf = a / b Trong đó: a khoảng cách di chuyển chất phân tích; b khoảng cách di chuyển dung mơi tính từ điểm chấm mẫu Rf có giá trị từ đến Giá trị Rf thường sử dụng để đánh giá chất giống hay khác chất chuẩn biết Ngoài ra, sử dụng để đánh giá hệ dung mơi có độ phân cực phù hợp hay chưa với thí nghiệm sắc ký cột Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf quan trọng là: - Chất lượng hoạt tính chất hấp thụ - Bề dày lớp mỏng - Chất lượng độ tinh khiết pha động Mô tả bước thực sắc ký mỏng điều chế ưu nhược điểm phương pháp Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) kỹ thuật thường sử dụng phịng thí nghiệm, cho phép xác định nhanh thành phần hợp chất phức tạp TLC phân lập chất hàm lượng nhỏ thường dùng để phân tích chất chiết từ thực vật Sắc ký lớp mỏng điều chế phương pháp sử dụng để tách lượng nhỏ đơn chất (10 - 1000 mg) từ hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử) Trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch mẫu thử chấm mỏng có tráng lớp chất hấp phụ (thường silica gel, nhơm oxit) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm phẳng (kính, nhơm) có vai trị pha tĩnh Nhúng mỏng vào bình sắc ký chứa dung mơi bão hịa (pha động) để chạy sắc ký Trong bình sắc ký pha động, di chuyển dọc theo mỏng làm di chuyển cấu tử mẫu thử theo vận tốc khác tạo thành sắc ký đồ gồm nhiều vết có thời gian lưu (Rf) khác Quá trình cịn gọi khai triển sắc ký chạy sắc ký Sau khai triển bình sắc ký làm khơ dung mơi, ta xác định vị trí diện tích vết nhiều cách khác như: soi đèn tử ngoại (đèn UV), đặt mỏng buồng iot bão hòa phun thuốc màu đặc hiệu để đánh dấu vị trí vết mỏng Để thu chất nghiên cứu, tiến hành cạo vùng chất hấp phụ chứa vết khỏi mỏng phản hấp phụ chúng dung mơi thích hợp Hợp chất thu từ mỏng tiếp tục tinh chế sắc ký lớp mỏng (TLC) hay phương pháp sắc ký điều chế khác Khi hợp chất đạt độ tinh khiết cao mức định, người ta tiến hành định tính, xác định cấu trúc phương pháp phân tích khác phép đo quang phổ Lúc vào mức độ tinh khiết đạt được, sử dụng chúng chất chuẩn hay chất đối chiếu Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế tương tự kỹ thuật TLC Nhưng để có hiệu suất cao sắc ký lớp mỏng điều chế, người ta thường dùng mỏng dày so với kỹ thuật TLC Các lớp mỏng thường có độ dày 0,5 - 2mm dày đến 10 mm tùy mục đích nghiên cứu Việc sử dụng mỏng làm cho hiệu suất điều chế tăng lên đáng kể • Cách phát vết kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế Soi UV Sau lấy mỏng triển khai khỏi bình sắc ký, để khơ tự nhiên sấy nhẹ đưa vào soi ánh sáng đèn tử ngoại Dưới tác động tia tử ngoại, vết phát sáng Ưu điểm phương pháp là, nhanh, tiện lợi, không bị hao hụt mẫu Nhược điểm phương pháp là, mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực vết dẫn đến việc xác định vị trí sai Để khắc phục, phản hấp phụ người ta thường cạo vết rộng để việc thu chất triệt để Phun thuốc màu đặc hiệu Dùng kính nhựa mỏng che hầu hết mỏng, sau khai triển làm khô dung môi Phun thuốc màu đặc hiệu lên phần không bị che Thuốc màu đặc hiệu tác dụng với chất tạo màu vết mỏng Căn vào vị trí vết màu mỏng, dùng dụng cụ thích hợp cạo phần lớp mỏng tương ứng phần mỏng bị che để thu chất nghiên cứu tiến hành phản hấp phụ Ưu điểm phương pháp là, xác định vị trí xác vết Sử dụng iod Đặt mỏng buồng iod bão hòa vết xuất Lấy mỏng khỏi buồng iod Đánh dấu vị trí vết sau phơi ngồi quạt gió để bay iod Cạo mỏng phần diện tích đánh dấu, phản hấp phụ để thu chất cần nghiên cứu Ưu nhược điểm Ưu điểm phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế là: - Nhanh, rẻ, thiết bị đơn giản dễ áp dụng so với sắc ký cột cổ điển HPLC điều chế - Dễ tìm dung mơi thích hợp để tách hỗn hợp chất - Sử dụng lượng nhỏ dung mơi - Có thể triển khai nhiều lần để thu kết phân tách tốt hơn, có độ tinh khiết cao - Dễ dàng phản hấp phụ để lấy chất cần điều chế khỏi mỏng - Có thể triển khai đồng thời nhiều chất chuẩn điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho việc xác định hợp chất mong muốn Tuy nhiên nhược điểm phương pháp là: - Các hợp chất bền chấm bề mặt mỏng bị phân hủy tiếp xúc với khơng khí ánh sáng - Trong nhiều trường hợp có xuất đồng thời tạp chất phản hấp phụ để thu hồi chất cần điều chế - Phải chạy nhiều hệ dung môi để phân biệt trường hợp chất có Rf giống hệ dung môi tách, không phù hợp với chất phát đèn UV Trình bày bước chung để thực sắc ký cột • Nhồi cột - Chọn cột, làm khô cột - Cân lượng pha tĩnh cần dùng tương ứng với dung tích cột - Pha dung mơi chạy hệ - Hịa tan pha tĩnh vào dung mơi cốc có mỏ - Nhồi đáy cột lớp bơng gịn để chặn pha tĩnh (khơng cần cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn pha tĩnh) - Chuyển pha tĩnh vào cột cách khuấy pha tĩnh dung môi (không phân cực) pha sẵn rót nhẹ nhàng vào cột Khi rót, nên mở khóa cột để pha tĩnh lắng đều, nhớ để bình hứng bên để thu hồi dung môi, tiếp tục làm đến chuyển hết lượng pha tĩnh vào cột sau khóa cột lại • Nạp mẫu vào cột - Nếu nạp mẫu ướt (hỗn hợp chất phân tích tan dung mơi chạy cột) hịa tan mẫu dung môi cho vào cột - Cách nạp mẫu khô tiến hành sau: Nếu mẫu không tan dung mơi chạy cột phải hịa tan mẫu vào dung mơi trung gian (dung mơi hịa tan mẫu) cốc có mỏ Dùng lượng pha tĩnh cho vào cốc có mỏ để hấp thu mẫu vào pha tĩnh Sau chuyển vào bình cầu cất áp lực giảm để đuổi dung mơi, thu pha tĩnh khơ có chứa mẫu Lúc nạp hết pha tĩnh vào cột cho tiếp dung môi chạy cột vào - Sau hồn tất việc nạp mẫu, lót miếng bơng gòn bên cột để ổn định hệ tiếp tục cho dung mơi vào cột - Mở khóa, lúc cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung mơi chảy có kèm theo chất tách ống nghiệm nhỏ, lần hứng khoảng 1/3 ống nghiệm Sau đó, đem chấm mỏng Những ống có vệt tương tự gom lại, chất Tiếp tục làm cuối ta tách chất mong muốn Dùng khóa cột để điều chỉnh tốc độ dịng chảy dung mơi, tốc độ chảy dung mơi định q trình tách có tốt hay khơng Nếu tốc độ chảy chậm phải chờ lâu, chảy nhanh pha tĩnh chưa kịp hấp phụ phải chảy ra, chất khơng tách • Pha động sắc ký cột điều chế Khi khảo sát pha động sắc ký cột điều chế, điều quan trọng chọn dung môi hỗn hợp dung mơi phù hợp để tách cấu tử chất cần tách thời gian ngắn sử dụng dung mơi Trong sắc ký cột điều chế, người ta thường sử dụng hỗn hợp dung mơi Vì vậy, việc pha trộn tỷ lệ dung mơi để q trình tách chiết tốt cần quan tâm Việc dùng loại dung mơi tinh khiết, dung mơi có độ sơi thấp để dễ thu hồi, dung mơi có độ nhớt thấp để tránh áp lực lên cột nhồi yếu tố cần lưu ý để tăng hiệu kỹ thuật sắc ký cột điều chế • Cách phát sắc ký cột điều chế UV detector: Trong sắc ký cột điều chế phương pháp ghi nhận sắc ký đồ detector UV thường sử dụng nhiều UV detector áp dụng cho hợp chất có nhân thơm, có nối đơi liên hợp, nhóm carbonyl, có chứa iod, brom, sulfur Refractive detector: Cơ sở phát vào số khúc xạ Phát refractive detector có độ nhạy thấp so với phát UV hay ứng dụng sắc ký cột điều chế Khi lựa chọn dung môi, dựa vào số khúc xạ để lựa chọn loại dung mơi có hiệu tách cao Trình bày cách lập cột sắc ký Có hai cách nhồi cột sắc ký: Nhồi cột khô Dụng cụ cần thiết: - Cột Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khơ Van để đóng cột Dung môi Silica gel Cách làm: Cho dung môi vào cột, cho chạy qua cát miếng đêm vải để loại bọt khí Đặt phễu khơ đỉnh cột đổ từ từ Silica gel (pha tĩnh) vào dung môi Để dung môi chảy từ từ tránh bị tràn - Để pha tĩnh lắng xuống nhẹ nhàng đóng van cột lại để Silica gel nhồi chặt cột - Tháo dung môi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn Nhồi ướt • Dụng cụ cần thiết: - Cột chuẩn bị phần - Phễu phù hợp dùng cho chất rắn ướt - cốc có mỏ bình tam giác - Que khuấy thủy tinh - Dung môi - Silica gel - Pipet Pasteur Cách làm: - Rót dung mơi vào khoảng 1/3 dung tích cột - Dùng cốc có mỏ, đong lượng Silica gel vừa đủ - Trong bình phản ứng cốc có mỏ, đong lượng dung môi gấp khoảng 1,5 lần lượng Silica gel - Thêm Silica gel vào dung môi, một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng pipet Pasteur đũa thủy tinh để khuấy lên - Rót dùng pipet để thêm hỗn hợp Silica gel dung mơi vào cột Để dung mơi khỏi cột tránh bị tràn - Gõ nhẹ vào cột để bọt khí Silica gel lắng xuống - Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến tất lượng Silica gel hết - Rửa thành cột cách rót dung mơi lên thành cột - Mở van tháo dung môi đến mức dung môi cột chạm đến bề mặt pha tĩnh Sự khác mặt vật lý, hóa học chất hấp phụ Silica gel gel pha đảo Bề mặt hạt silica gel – SiO xử lý (thủy phân) cách đun nóng với HCl 0,1M hai ngày để tạo nhóm SiOH sau (thơng thường có khoảng µmol SiOH/m2 bề mặt): Trong đó, pha đảo tạo phản ứng với organochlorosilan để tạo pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình phân cực tùy theo nhóm R gắn vào Do đặc tính chứa nhóm SiOH bề mặt, silica gel có tính phân cực mạnh nên giữ lại chất phân cực cao, tương tác với chất phân cực Do đó, sắc ký pha thuận, dung môi sử dụng theo thứ tự tăng dần độ phân cực, chất phân cực trước chất phân cực Trái lại, bề mặt xử lý loại bỏ nhóm –OH thay gốc alkyl nên pha đảo có tính phân cực Trong sắc ký cột pha đảo, chất phân cực bị giữ lại lâu pha tĩnh, chất phân cực rửa giải trước Dung môi sử dụng thường điều chỉnh cho giảm độ phân cực Không sử dụng dung môi hữu phân cực cho sắc ký pha đảo 10 ... tránh áp lực lên cột nhồi yếu tố cần lưu ý để tăng hiệu kỹ thuật sắc ký cột điều chế • Cách phát sắc ký cột điều chế UV detector: Trong sắc ký cột điều chế phương pháp ghi nhận sắc ký đồ detector... bày cách lập cột sắc ký Có hai cách nhồi cột sắc ký: Nhồi cột khô Dụng cụ cần thiết: - Cột Phễu phù hợp dùng cho chất rắn khơ Van để đóng cột Dung mơi Silica gel Cách làm: Cho dung môi vào cột, ... Kỹ thuật tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế tương tự kỹ thuật TLC Nhưng để có hiệu suất cao sắc ký lớp mỏng điều chế, người ta thường dùng mỏng dày so với kỹ thuật TLC Các lớp mỏng thường có độ