Đây là tài liệu rất hay về sắc kí cột hở Đừng tìm thêm ơ đâu nữa MỘT SỐ VẤN ĐỀ TRONG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT HỞ PHA THƯỜNG Nội dung Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly 1. Chọn chất hấp thu 2 .Chọn dung môi Quá trình nạp cột 1 .Tính toán các tỉ lệ Nạp cột sệt Nạp cột khô Nạp mẫu chất phân tích 1. Nạp mẫu chất dạng dung dịch 2. Nạp mẫu chất dạng bột khô Quá trình giải ly 1. Giải ly nhờ trọng lực 2. Sử dụng lực đẩy (trong sắc ký chớp nhoáng) 3. Sử dụng lực hút (trong sắc ký nhanh – cột khô) 4. Vận tốc giải lý Giải lý sử dụng dung môi đơn nồng độ Giải ly có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang Giải ly với nồng độ tăng dần tuyến tính
MỘT SỐ VẤN ĐỀ TRONG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT HỞ PHA THƯỜNG TN 395 Nội dung I Lựa chọn chất hấp thu dung môi khởi đầu giải ly II Quá trình nạp cột III.Quá trình giải ly IV.Chọn hệ dung môi giải ly Lựa chọn chất hấp thu dung môi khởi đầu giải ly Chọn chất hấp thu -.Tùy vào tính phân cực chất cần phân tích * Đối với hợp chất phân cực, nên sử dụng sắc ký trao đổ ion hoặt sắc ký l ọc gel * Với hợp chất phân cực bình thường sử dụng sắc ký hấp thu Lựa chọn chất hấp thu dung môi khởi đầu giải ly Chọn dung môi ể dò tìm hệ dung môi phù hợp, với bước: -.DùngBướsắcc1:kýHòalớptanmỏmngẫuđtrong dung môi phù hợp - Bước 2: Chấm mỏng - Bhợướp.c 3: Mỗi mỏng khai triển với loại dung môi, sau hình vết Từ kết tìm hỗn hợp dung môi phù - BướcVớ4:i mẫu kết phản ứng tổng hợp hữu cơ, lựa chọn hệ dung môi đẩy hợp chất cần quan tâm lên với Rf = 0,2-0,3 thô cỏ, dung môi giải ly đ ẩy v ết phân cực lên v ới Rf = 0,5 Dung môi ch ấm d ứt s ắc ký dung môi đ ẩy - Vvếớti cao phân cực lên Rf = 0,2 * Bản mỏng silica gel GF254 (MERCK)Dung môi khai triển A Sắc ký đồ ánh sáng tử ngoại 254nm B Sắc ký đồ ánh sáng tử ngoại 366nm C Sắc ký đồ ánh sáng thường Hiện màu Vanilin/ H 2SO4 * Lưu ý: - Pha tĩnh SKLM SKC phải giống - Dung môi giải ly cột hệ dung môi chọn phần thực nghiệm nêu phải điều chỉnh cho có tính phân cực Quá trình nạp cột Tính toán tỉ lệ -.Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt trọng lượng chất hấp thu phải lớn 25 - 50 lần trọng lượng mẫu -.Các hợp chất khó tách cần dùng lượng nhiều (100-200 lần) Nạp chất hấp thu vào cột 10 Nạp cột sệt • Lưu ý: - Không để khô cột, nghĩa phải có dung môi phủ đầu cột - Sau nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu đầu cột phải nằm ngang - Đối với sắc ký trao đổi ion sắc ký lọc gel (sử dụng loại chất hấp thu trương nở) trước rót vào cột cần ngâm dung môi vừa đủ khoảng đêm 12 Nạp cột khô - Cố định cột thẳng đứng - Cho dung môi loại phân cực vào khoảng 2/3 cột - Cho lượng nhỏ chất hấp thu dạng bột khô vào cột vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột - Khi chiều cao chất hấp thu vào khoảng 2cm mở khóa cho dung môi chảy - Sau nạp xong, cho dung môi chạy qua chất hấp thu vài lần để chất hấp thu có dạng đồng 13 Nạp mẫu chất phân tích Nạp mẫu chất dạng dung dịch -.Dung dịch mẫu có nồng độ đậm đặc tốt, lớp dung dịch nằm thành lớp mỏng đầu cột -.Công thức: V=0,4xD2 -.Mở khóa cho dung môi chảy xuống vừa sát mặt thoáng chất hấp thu -.Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột pipette -.Mở khóa cho dung môi chảy ra, chất phân tích thấm vào chất hấp thu, không để chất hấp thu đầu cột khô 14 Nạp mẫu chất phân tích Nạp mẫu chất dạng dung dịch -.Dùng pipette cho lượng nhỏ dung môi lên đầu cột, dùng lượng dung môi rửa thành ống chất phân tích dính lên Lại mở khóa cho dung môi chảy -.Lặp lại cho dung môi vào đầu cột, dung môi suốt -.Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu trình giải ly 15 Nạp mẫu chất phân tích Nạp mẫu chất dạng bột khô -.Trong bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất (x g) hòa tan dung môi ethyl acetate methanol (50x g), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10x g) H ỗn hợp cô quay chân không đ ến có bột silica gel khô, mẫu cần phân tích tẩm lên bề mặt silica gel khô -.Cho lớp silica gel lên đầu cột (cột nạp chất hấp thu) dùng dung môi thấm ướt phần silica gel -.Cho dung môi vào đầy cột bắt đầu trình giải ly 16 Quá trình giải ly Giải ly nhờ trọng lực Các hạt gel nạp cột phải có kích thước > 60µm Sử dụng lực đẩy (trong sắc ký chớp nhoáng) -.Sử dụng áp lực để đẩy dung môi qua pha tĩnh -.Có thể sử dụng hạt gel có kích thước 40-63 µm -.Cột phải có lớp bao lưới bên tránh nổ vỡ áp suất cao 17 Biotage Isolera Automated Flash Chromatography System 18 Quá trình giải ly Sử dụng lực hút (trong sắc ký nhanh – cột khô) bơm hút chân không đầu cột -.SViửệdcụlấngy máy dung môi có phần bất tiện Tuy vậy, k ỹ thuật - an toàn 19 Quá trình giải ly • Các kỹ thuật sắc ký khác việc sử dụng kích thước khác hạt gel làm pha tĩnh việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi khỏi cột - Cột – áp suất thấp: cột thủy tinh, dùng hạt kích cỡ 40-200 µm - Cột – áp suất trung bình: cột thủy tinh dày, dùng hạt kích cỡ 25-40 µm, thực áp suất 5-40 bar (75-600 psi) - Cột HPLC: cột thép không rỉ, dùng hạt kích cỡ 3-10 µm, thực áp suất cao (500-3000 psi) 20 Quá trình giải ly Vận tốc giải ly Thông thường đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng -50 giọt/phút 1-2 cm/phút •.Vận tốc dung môi giải ly không nhanh (sẽ không kịp cân với chất hấp thu), không chậm bị cho ngừng lại thời gian lúc dãy chất tan khuếch tán trãi dài theo m ọi h ướng làm xấu trình tách 21 Dung môi giải ly - Dung môi đảm bảo tinh khiết - Tránh sử dụng vài dung môi cho silica gel cho alumin dạng acid base dạng hoạt tính mạnh (pyridin, methanol, nước, acid acetic => hòa tan giải ly chất hấp thu silica gel) - Độ phân cực số đơn dung môi: (tăng dần theo thứ tự) Hexan < cyclohexan < diclorometan < isopropanol < propanol < cloroform < etyl acetat < aceton < metanol < etanol < acetonitril (Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập h ợp ch ất h ữu c ơ, 193) 22 Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ Chỉ sử dụng đơn dung môi hỗn hợp dung môi hỗn hợp tỉ lệ thành ph ần không thay đ ổi để giải ly việc tách chất hoàn tất 23 Giải ly có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang - Trong trình sắc ký cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần để đuổi hết cấu tử khác khỏi cột - Tăng tính phân cực cho dung môi thiết phải tăng chậm, thêm từ từ VD: pha bezen vào hexan với tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% 100% bezen - Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột làm gãy cột 24 Giải ly với nồng độ tăng dần tuyến tính 25 Thay đổi dung môi giải ly - Với hợp chất có màu, đổi dung môi tách xong lớp màu - Với chất không màu, kiểm tra SKLM - Lưu ý đuổi bớt dung môi trước chấm SKLM 26 [...]... hút (trong sắc ký nhanh – cột khô) bơm hút chân không ở đầu ra của cột -.SViửệdcụlấngy máy dung môi có phần bất tiện Tuy vậy, k ỹ thuật - này an toàn hơn 19 Quá trình giải ly • Các kỹ thuật sắc ký khác nhau là việc sử dụng kích thước khác nhau của hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột - Cột – áp suất thấp: cột thủy tinh, dùng hạt kích cỡ 40-200 µm - Cột – áp suất... rót hỗn hợp sệt vừa gõ nhẹ thành cột - Sau khi nạp hết chất hấp thu cho dung môi chảy ra và rót trả lại đầu cột vài lần để chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất 11 Nạp cột sệt • Lưu ý: - Không được để khô cột, nghĩa là luôn phải có dung môi phủ trên đầu cột - Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang - Đối với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel (sử dụng loại chất hấp... gel này lên đầu cột (cột đã được nạp chất hấp thu) dùng một ít dung môi thấm ướt phần silica gel -.Cho dung môi vào đầy cột bắt đầu quá trình giải ly 16 Quá trình giải ly 1 Giải ly nhờ trọng lực Các hạt gel nạp cột phải có kích thước > 60µm 2 Sử dụng lực đẩy (trong sắc ký chớp nhoáng) -.Sử dụng áp lực để đẩy dung môi đi qua pha tĩnh -.Có thể sử dụng những hạt gel có kích thước 40-63 µm - .Cột phải có lớp... cột thủy tinh, dùng hạt kích cỡ 40-200 µm - Cột – áp suất trung bình: cột bằng thủy tinh dày, dùng hạt kích cỡ 25-40 µm, thực hiện ở áp suất 5-40 bar (75-600 psi) - Cột HPLC: cột bằng thép không rỉ, dùng hạt kích cỡ 3-10 µm, thực hiện ở áp suất cao (500-3000 psi) 20 Quá trình giải ly 4 Vận tốc giải ly Thông thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly là khoảng 5 -50 giọt/phút hoặc 1-2 cm/phút •.Vận... ion và sắc ký lọc gel (sử dụng loại chất hấp thu có thể trương nở) trước khi rót vào cột cần ngâm trong dung môi vừa đủ khoảng một đêm 12 Nạp cột khô - Cố định cột thẳng đứng - Cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 cột - Cho từng lượng nhỏ chất hấp thu dạng bột khô vào trong cột vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột - Khi chiều cao chất hấp thu vào khoảng 2cm thì mở khóa dưới cho dung môi chảy ra...Nạp cột sệt - Cố định cột trên giá, chặn phần đầu ra của cột bằng một miếng bông - Cho chất hấp thu vào becher có sẵn dung môi (loại bắt đầu giải ly) đều đặn từng lượng nhỏ, khuấy đều Lượng dung môi phải vừa đủ không được quá sệt cũng không được quá lỏng - Rót hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu, mở khóa dưới cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lên đầu cột. .. theo kiểu bậc thang - Trong quá trình sắc ký cần thay đổi nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần để có thể đuổi hết nhưng cấu tử khác nhau ra khỏi cột - Tăng tính phân cực cho dung môi nhất thiết phải tăng chậm, thêm từ từ VD: pha bezen vào hexan với các tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100% bezen - Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột 24 Giải ly với nồng độ tăng dần tuyến... lớp mỏng trên đầu cột -.Công thức: V=0,4xD2 -.Mở khóa cho dung môi chảy xuống vừa sát mặt thoáng chất hấp thu -.Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột bằng pipette -.Mở khóa cho dung môi chảy ra, chất phân tích thấm vào chất hấp thu, không để chất hấp thu ở đầu cột khô 14 Nạp mẫu chất phân tích 1 Nạp mẫu chất dạng dung dịch -.Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, dùng lượng dung... dung môi mới lên đầu cột, dùng lượng dung môi này rửa sạch thành ống do chất phân tích dính lên Lại mở khóa cho dung môi chảy ra -.Lặp lại như thế cho đến khi cho dung môi vào đầu cột, dung môi trong suốt -.Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly 15 Nạp mẫu chất phân tích 2 Nạp mẫu chất dạng bột khô -.Trong bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất (x g) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate