Giáo trình chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên, chương 4 sắc ký cột

CHƯƠNG 4: SẮC KÝ CỘT Sắc ký phương pháp vật lý để tách riêng thành phần hỗn hợp cách phân chia chúng thành pha: pha động pha tĩnh Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm cho pha cố định nhồi ống hình trụ gọi “cột” Tùy theo tính chất chất được sử dụng làm cột mà trình tách cột xảy chủ yếu theo chế hấp phụ (cột hấp phụ), chế phân bố (cột phân bố) hay chế trao đổi ion (cột trao đổi ion) Ở trình bày sắc ký cột hấp phụ I NGUYÊN TẮC Sắc ký hấp phụ thực ống thủy tinh thẳng đứng gọi “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung mơi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ Đối với chất riêng biệt hỗn hợp, tùy theo khả hấp phụ khả hòa tan dung mơi rửa cột để lấy trước sau Chất hấp phụ sắc ký cột thừơng dùng oxid nhơm, silicagel, CaCO , than hoạt tính, polyamid, …Các chất phải tiêu chuẩn hóa - Oxid nhơm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh) o Độ hoạt hóa số - I 0,5 % H2O II 2,4 % H2O III 4,3% H2O IV 6,6% H2O V 15% H2O Oxid nhôm baz (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh) o Độ hoạt hóa số - Silicagel 60 cỡ hạt 0,063-0,200 mm I 1,2 % H2O II 3,5 % H2O III 5,8% H2O IV 8,1% H2O V 10% H2O - Polyamid M-K cỡ hạt < 0,07 mm Silicagel pha tĩnh dùng rộng rãi để tách hợp chất thiên nhiên Dung môi dùng sắc ký cột loại riêng biệt hỗn hợp 2, loại dung mơi có tỉ lệ thích hợp Với chất hấp phụ cổ điển, dung mơi sử dụng có độ phân cực tăng dần Cột ống làm thủy tinh, đầu có khóa, đầu có nút mài để nối với phễu chứa dung môi, loại thường bán sẵn thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ Hoặc cột tự lắp ống thủy tinh thường, đầu nhỏ nối với ống cao su, dùng khóa kim loại để điều chỉnh tốc độ chảy dung mơi Việc lựa chọn kích thước cột quan trọng Thơng thường cột có đường kính nhỏ chiều dài dài tách tốt Một vài cột bán sẵn thị trường có kích thước tương ứng với chiều dài kích thước cột: Đường kính (cm) Chiều dài (cm) II 15 25 40 60 KỸ THUẬT NHỒI CỘT VÀ TRIỂN KHAI SẮC KÝ II.1 Chuẩn bị cột - Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất sấy khơ - Cho bơng gòn vào đáy cột (có thể cho thêm lớp cát mịn sạch) - Kẹp cột thẳng đứng giá Yêu cầu cột sắc ký chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng điểm cột tạo thành khối đồng Cho chất hấp phụ vào cột thường gọi nhồi cột Trọng lượng chất phân tích Tỷ lệ = Trọng lượng chất hấp phụ Tùy thuộc vào khả tách chất hấp phụ mà tỷ lệ thay đổi, thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,… Có cách nhồi cột: nhồi cột ướt nhồi cột khô Nhồi cột ướt: Dùng cho chất hấp phụ có khả trương phình Silicagel, Sephadex … phải ngâm dung mơi trước thời gian trước cho vào cột để tránh làm nứt cột Lắc, trộn bột hấp phụ với dung mơi thành hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột Hỗn dịch dung môi chất hấp phụ không nên sệt để tránh bọt khí bị giữ cột khơng nên q lỏng để rót nhiều lần vào cột Chú ý q trình nhồi cột, dung mơi liên tục chảy bình hứng, khơng để khô dung môi cột Sau chất hấp phụ cho hết vào cột, dung môi tiếp tục rót hứng thêm khoảng thời gian để cột hồn tòan ổn định Mặt thống cột phải phẳng, người ta cho thêm lớp cát để tránh làm xáo trộn lớp Silicagel rót dung mơi Nhồi cột khơ: Dùng cho chất hấp phụ khơng có khả trương nở Al 2O3, CaCO3 Chất hấp phụ nhồi từ từ vào cột dạng khô phểu có cuống dài Dùng que gỗ cao su gõ nhẹ xung quanh cột theo chiều từ lên để bột xuống Khi chất hấp phụ cho hết vào cột, rót dung mơi vào cho chảy liên tục thời gian để cột ổn định không để khô dung mơi cột II.2 Đưa chất phân tích vào cột Yêu cầu đưa chất phân tích vào cột phải phân tán thành lớp mỏng đồng mặt thống phẳng Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột: Phương pháp dùng đĩa giấy: Dùng giấy lọc cắt hình tròn có đường kính nhỏ đường kính cột 0,5mm Dùng kim châm lỗ thủng cách Chất cần phân tích hòa tan lượng dung môi vừa đủ, cho giấy thấm dung dịch đậm đặc Lấy giấy ra, cho bốc dung môi cách sấy tiếp tục tẩm dung dịch thử Nếu cột lớn, lượng mẫu nhiều dùng nhiều đĩa giấy Sau cột ổn định với dung môi, tháo dung môi bề mặt dung môi ngang với mặt lớp chất hấp phụ cột khóa van lại Đặt cẩn thận đĩa giấy vào cột, dùng ống hút cho dung môi cho tẩm ướt đĩa giấy Cho lớp cát mịn lên đĩa giấy bắt đầu cho dung môi chảy Cho thẳng dung dịch thử lên cột: Hòa tan chất cần phân tích vào lượng vừa đủ dung mơi (càng tốt phải đảm bảo hòa tan hồn tồn Dung dịch thử có nồng độ đậm đặc nằm thành lớp mỏng đầu cột Cột ổn định tháo dung mơi mặt thống gần sát bề mặt chất hấp phụ khóa vòi lại Dùng ống hút hút dung dịch đậm đặc chất cần phân tích chảy dọc thành cột Mở khóa bên cho dịch thử ngấm vào cột (không để chất hấp phụ đầu cột bị khơ) Khi tồn lớp dung dịch thử ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy dung mơi rửa thành cột, cho dung môi ngấm hết vào cột Tiếp đến cho dung mơi để bắt đầu tiến hành q trình giải ly Trộn chất thử với lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi cho vào cột cách trải thành lớp mặt cột Trong cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột gọn nhanh cả, phải đảm bảo yếu tố sau: - Chất thử hồ tan hòan tòan - Dung dịch chất thử phải nạp vào cột - Khi toàn chất thử ngấm hết vào cột cho tiếp dung môi - Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột Nếu chất thử ngấm vào cột tạo thành lớp có bề dày chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo III RỬA CỘT Rửa cột gọi giải ly chất khỏi cột Tùy theo chất hấp phụ dùng yêu cầu tốc độ chảy cột mà tiến hành giải ly cột áp suất thường áp suất nén - Rửa cột áp suất thường: nghĩa dung môi chảy nhờ vào trọng lực Cột áp suất thường có nhược điểm chảy chậm, dùng cho chất hấp phụ có kích thước hạt lớn - Rửa cột áp suất nén: Thường cho dòng khí nén (khí nitrogen khơng khí) vào đầu cột Tốc độ dồng khí kiểm sốt nhờ vào van điều chỉnh Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín miệng, có khóa dây buộc chặt vào miệng cột Việc lựa chọn phương pháp rửa cột khác tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi khỏi cột Một hợp chất bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu tùy thuộc vào độ phân cực dung môi giải ly Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung mơi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột Tạp chất có dung môi thường làm thay đổi độ phân cực, người ta thường cất dung môi trước sử dụng Hiện thị trường có bán loại silicagel đảo pha Khi sử dụng silicagel làm pha tĩnh, pha tĩnh có tính hấp thu tỉ lệ với tính thân dầu hợp chất sắc ký Cho nên pha động sử dụng thường nước hỗn hợp dung mơi có chứa nước Như thành phần phân cực hỗn hợp chất cần sắc ký giải ly trước, thành phần không phân cực sau Phương pháp ứng dụng hiệu hợp chất có độ phân cực mạnh cao thực vật như: saponin hay triterpen Sự thay đổi từ dung môi sang dung môi khác phải chuyển từ từ cách pha tỉ lệ tăng dần giảm dần Nếu tăng tính phân cực nhanh đột ngột làm gãy cột Nguyên nhân chất hấp phụ Al2O3 silicagel trộn với loại dung môi sinh nhiệt, nhiệt làm cho dung môi bốc cục bộ, sinh tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu tách không tốt Vận tốc chảy dung môi rửa cột phải điều chỉnh cho phù hợp; không nhanh (sẽ không kịp cân với chất hấp phụ) không chậm cho dừng lại thời gian làm cho chất tan bị khuye61ch tán, ảnh hưởng đến hiệu tách Tốc độ di chuyển chất mặt hấp phụ phụ thuộc vào dung môi Bảng xếp Trappe theo thứ tự tăng dần lực phản hấp phụ số dung môi: Ether dầu hỏa - cyclohexan - carbon tetraclorur - tricloroetylene - toluen - benzen methylclorur - chloroform - ether ethylic - ethylacetat - pyridin- aceton - n-propanol ethanol - methanol - nước Trên thực tế, nhiều dùng dung môi đơn không tách nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi Bảng 7: Một số hỗn hợp dung môi thường dùng cho hợp chất phân cực (dùng cho sắc ký cột sắc ký lớp mỏng) CHẤT HẤP PHỤ CỔ ĐIỂN A CHCl3/MeOH /H2O 15:12:2 B CHCl3/MeOH /H2O 8:4:1 C BuOH/AcOH/H2O 4:1:5 D CHCl3/MeOH /H2O 13:7:2 E CHCl3/MeOH /H2O 7:3:1 F CHCl3/MeOH/EtOAc/ H2O G BuOH/ EtOAc/ H2O 4:1:2 H CHCl3/MeOH /H2O 13:7:1 I EtOAc/Acetone/MeOH/H2O J Benz/Dioxane/AcOH 90:25:4 K Benz/MeOH/AcOH 45:8:4 L EtOAc/ Acetone/MeOH/H2O M BuOH/AcOH/H2O 2:2:4:1 10:10:1:1 10:10:1:1 4:1:2 N EtOAc/AcOH/H2O O Benz/Acetone/AcOH 100:16:13 75:25:1 CHẤT HẤP PHỤ ĐẢO A MeOH/H2O 1:2 B MeOH/H2O 1:1 C MeOH/H2O 2:1 D CH3CN/MeOH/H2O 1:1:1 E H2O/ CH3CN/AcOH 7:2:1 Theo dõi trình giải ly cột: Với chất cần phân tích có màu, q trình giải ly sắc ký cột theo dõi mắt thường Tuy nhiên, phần lớn hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng kiểm tra phân đoạn giải ly khỏi cột thường phương pháp sắc ký lớp mỏng Thường trước tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ dung môi, thăm dò SKLM để chọn hệ dung mơi tách tốt Khi chọn chất hấp hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể tích phân đoạn hứng hay thể tích loại dung mơi giải ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm kinh nghiệm người thực hành IV SẮC KÝ CỘT NHANH (Flash chromatography) Xuất phát từ yêu cầu thực tế cần phải có phương pháp tách tinh chế hợp chất thiên nhiên với lượng mẫu nhỏ, thời gian tiến hành nhanh chóng làm giảm bớt khả phân hủy chất gặp trường hợp sắc ký cổ điển Phương pháp sắc ký nhanh nghiên cứu công bố W CLARK STILL , MICHEAL KAHN, ABHIJIT MITRA vào năm 1978 đăng ký phát minh vào năm 1981 (US Patent 4293422) Sắc ký nhanh kỹ thuật sắc ký lỏng có tác dụng áp suất khơng khí, thực cột thủy tinh ngắn nhằm gia tăng tốc độ chảy dung dịch rửa cột Nguyên tắc phương pháp sắc ký nhanh (FC) đơn giản, dụng cụ rẻ tiền, tách thực nhanh chóng có hiệu cao Cột thủy tinh: Trong phương pháp sắc ký cột nhanh, người ta sử dụng cột thủy tinh ngắn với đường kính thích hợp từ 10-50mm tùy thuộc vào lượng mẫu phân tích Dưới đáy cột có gắn vòi có khóa để dẫn dung dịch ngồi Bộ phận điều chỉnh áp suất tốc độ dòng chảy gồm phận dẫn khí nén có lắp van điều chỉnh tốc độ chảy Sau người ta thêm phận chứa dung môi thủy tinh đầu cột Sự tương quan đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung mơi rửa cột phân đoạn ghi bảng Bảng 8: Sự tương quan đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung mơi Đường kính Thể tích dung Lượng mẫu cho vào (mg) cột (mm) môi rửa (ml) 4Rf ≥0,2 4Rf ≥0,1 Phân (ml) đoạn 10 100 100 40 20 200 400 160 10 30 400 900 360 20 40 600 1600 600 30 50 1000 2500 1000 50 Chất nhồi cột: Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu silicagel với cỡ hạt nhỏ 40-60m (230-400 mesh) Bảng 9: Các loại silicagel dùng FC Nhãn hiệu Loại silicagel Cỡ (m) hạt Diện tích bề mặt (cm2/g) Amicon (Danvers, MA) Si 60 20-30 500 (60 Ǻ) Si 100 50-105 300 (100 Ǻ) J.T.Baker (Phillipsburg, NJ) Si 60 40-63 480 63-200 100-425 EM.Science / Merck Si 40 25-40 675 (40 Ǻ) Gibbstonin, NJ Si 60 63-200 550 (60 Ǻ) Si 100 40-63 420 (100 Ǻ)) 63-100 15-40 ICN (Woelm) Si 60 (Cleveland, OH) 10-18 500-600 10-35 18-32 32-63 32-100 63-100 63-200 Universal absorbents Si 60 (Atlanta , GA) 18-32 500-600 32-63 63-100 53-200 100-200 Whatman (Clifton NJ) Si 40 13-24 37-53 75-40 Dung môi rửa cột: Dung môi chọn FC nên có độ nhớt thấp như: CHCl , EtOAc, MeOH Dùng SKLM để tiến hành thử hợp chất cần sắc ký để tìm hệ dung mơi thích hợp cho thành phần hỗn hợp có giá trị R f ≥ 0,35 Như hỗn hợp gồm nhiều chất chất phân cực phải có giá trị Rf tối thiểu 0,35 Việc tách đạt hiệu tốt khác biệt số R f chất hỗn hợp đạt điều kiện Rf >0,15 Tuy nhiê,n số trường hợp Rf khơng đạt u cầu dùng giải pháp tăng chiều dài cột giảm lượng mẫu phân tích điều chỉnh hệ dung mơi Bằng biện pháp trên, Still cộng tách chất có Rf >0,1 Rf >0,05 Hệ dung môi dùng cho pha thường dung mơi có độ phân cực thấp ether dầu hỏa, hexan, ethyl acetat Hệ dung môi dùng cho pha đảo thường dung mơi có độ phân cực cao MeOH, H2O, MeOH-H2O Bảng 10: Áp dụng FC để tách hợp chất tự nhiên Hợp chất Nguồn thực vật Neolignans Piperfuto Kasura Chất hấp phụ SiO2 Dung môi rửa Hexan-EtOAc Piperaceae Sesquiterpen Canelle Winterane SiO2 Canellaceae Capsaicinoid Alcaloid quinolizidin Onion Ether -Hexan ethyl RP-18 MeOH RP-18 40 m MeOH-H2O Lipinus argentens Al2O3 baz Ether Ethyl Fabaceae (Merck) Ether MeOH ethyl- Nhồi cột: Đầu tiên cho lớp bơng thủy tinh lót đáy cột, sau cho lớp cát biển Cho từ từ silicagel khô 40-63 m vào cột, sau cho lớp cát biển lên bề mặt lớp silicagel Đổ dung môi giải ly lên bề mặt lớp biển đến đầy cột, gắn phận điều chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột Van kim mở, mở nhẹ nhàng cho dòng khí chảy qua, tay bịt air gió Áp suất cột gia tăng, nén lớp dung mơi chảy qua cột nhanh Áp suất trì đến tất khơng khí cột bị đuổi ngòai Chú ý khơng để lớp Silicagel đỉnh cột bị khơ Cho chất phân tích vào cột giống sắc ký cột thường nghĩa chất cần sắc ký hòa tan vào dung mơi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén tất dung dịch mẫu vào lớp silicagel, sau dùng vài ml dung môi tinh chế để rửa quanh thành cột Rót dung mơi đầy cột, mở van điều chỉnh áp bắt đầu hứng phân đoạn Lượng dung mơi rửa cột thể tích phân đoạn hứng tùy thuộc vào lượng mẫu tương ứng V SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography) Sắc ký cột nhanh khô cải biên sắc ký cột nhanh, dùng áp suất để gia tăng tốc độ giải ly pha động Kỹ thuật khác với FC cột sắc ký rút khô sau phân đoạn thu Dụng cụ gồm phễu lọc xốp thủy tinh Phễu có bán sẵn thị trường với đủ loại kích thước thích hợp Một hệ thống tạo áp thường dùng vòi nước máy bơm cần áp suất vừa phải Chất hấp phụ thường dùng silicagel dùng cho SKLM tức loại có độ mịn hạt 40-15 m) Al2O3 dùng cho SKLM Nạp chất hấp phụ vào phễu lọc trạng thái khô, gắn phễu vào hệ thống tạo áp suất kém, vừa gõ nhẹ vào thành phễu để chất hấp phụ nén đều, tạo thành khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phẳng… Chiều cao chất hấp phụ không cao, muốn tách lượng chất nhiều dùng phễu có đường kính to Chất cần sắc ký hòa tan vào dung môi phân cực, nạp vào cột, gắn áp suất kém, dung dịch mẫu hút vào phần silicagel đầu cột thành lớp mỏng Cũng nạp mẫu dạng khô, dung dịch cao mềm mẫu thử trộn với lượng vừa đủ chất hấp phụ, tạo thành bột rắn khơ (có thể đuổi dung mơi quay chân khơng), sau cho lớp bột lên đầu cột để có lớp mỏng Nối với hệ thống tạo áp suất Đổ lượng dung môi định lên bề mặt phễu, dung mơi rút xuống bình cầu hứng phía Sau dung mơi rút hết, ngưng áp suất, rót phần dung mơi vừa giải ly từ cột qua bình khác Lần lượt triển khai từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực Theo dõi trình giải ly thay đổi hệ dung mơi thích hợp sắc ký lớp mỏng sắc ký cột cổ điển Với cao trích từ cỏ, thường chứa nhiều thành phần khác nên thường khơng có phương pháp sắc ký cột hiệu để thu cấu tử mong muốn lần thực sắc ký cột mà phải thực nhiều lần Ưu điểm sắc ký cột nhanh sắc ký cột nhanh khô là: - Tiết kiệm: so với sắc ký cột cổ điển, kỹ thuật dùng chất hấp phụ dung môi Thời gian tiến hành nhanh - Đơn giản, dễ thực hiện, dụng cụ thường có sẵn phòng thí nghiệm Giới thiệu số dụng cụ dùng sắc ký cột: ... pháp sắc ký cột hiệu để thu cấu tử mong muốn lần thực sắc ký cột mà phải thực nhiều lần Ưu điểm sắc ký cột nhanh sắc ký cột nhanh khô là: - Tiết kiệm: so với sắc ký cột cổ điển, kỹ thuật dùng chất. .. xuống Khi chất hấp phụ cho hết vào cột, rót dung mơi vào cho chảy liên tục thời gian để cột ổn định không để khô dung môi cột II.2 Đưa chất phân tích vào cột Yêu cầu đưa chất phân tích vào cột phải... gòn vào đáy cột (có thể cho thêm lớp cát mịn sạch) - Kẹp cột thẳng đứng giá Yêu cầu cột sắc ký chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng điểm cột tạo thành khối đồng Cho chất hấp phụ vào cột thường