Sắc ký gel đầu tiên được dùng để tách các phân tử sinh học, thí dụ như hệ gel dextran nối mạng ngang chỉ phù hợp khi giải ly với dung môi là nước.. Năm 1964, hệ gel polystyrene nối mạng
Trang 1CHƯƠNG 6: SẮC KÝ GEL
I ĐỊNH NGHĨA, NGUYÊN TẮC
Sắc ký gel được Mould D.L phát triển từ năm 1954 dùng để tách các hợp chất không mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử của chúng Nguyên tắc sắc ký không thay đổi nhưng tên gọi của chúng thay đổi theo thời gian Năm 1959, tác giả Porath
và Flodin gọi là Gel filtration; đến năm 1964, Moor gọi là Gel permeation Chromatography Cuối cùng, cũng năm 1964 người ta gọi là Gel chromatography và danh
từ “sắc ký gel” được sử dụng thống nhất trong bài này
Trong sắc ký gel, pha tĩnh là mạng polimer có lỗ rỗng, các lỗ rỗng này được phủ đầy bởi dung môi dùng làm pha động Kích thước của các lỗ rỗng phải đồng nhất, bởi
vì kỹ thuật sắc ký gel dùng để tách các chất theo trọng lượng phân tử Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ rỗng sẽ không lọt vào trong lỗ rỗng và bị dung môi làm pha động cuốn ra khỏi cột Còn các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng sẽ chui vào trong các lỗ rỗng và bị giải ly ra khỏi cột chậm hơn
Như vậy, các thành phần khác nhau trong hỗn hợp cần phân tích sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trọng lượng phân tử, phân tử lớn bị giải ly ra cột trước phân tử nhỏ sẽ lần lượt ra sau
(a) : hỗn hợp mẫu được nạp trên đầu cột với (.) là phân tử có kích thước nhỏ và (•) là các phân tử có kích thước lớn
(b) : việc tách đang xảy ra một phần, phân tử lớn bắt đầu tách ra khỏi phân tử
nhỏ
(c) : việc tách xảy ra hoàn toàn, phân tử lớn chuẩn bị ra khỏi cột
Trang 2Tất cả các phân tử lớn cùng bị giải ly ra khỏi cột một lượt nhưng không thể tách riêng ra được Tương tự, các phân tử nhỏ chui vào lỗ gel cũng không tách riêng ra được Các phân tử có kích thước trung bình sẽ bị giữ lại trong cột tùy theo mức độ chui vào lỗ rỗng của hạt Nếu các hợp chất có chứa cùng nhóm chức hóa học, chúng sẽ giải ly
ra khỏi cột theo trọng lượng tương đối giữa chúng
Lức hấp thu trên bề mặt hạt Gel được bỏ qua nên sắc ký gel được xem như một loại sắc ký phân chia Pha tĩnh lỏng là chất lỏng nằm trong hệ mạng và pha động là dung môi di động, phủ tất cả các phần còn lại trong cột sắc ký Nói một cách khác, đây là loại cột sắc ký phân chia giữa 2 pha lỏng (pha tĩnh và pha động) mà cả 2 pha có cùng thành phần
Sắc ký gel đầu tiên được dùng để tách các phân tử sinh học, thí dụ như hệ gel dextran nối mạng ngang chỉ phù hợp khi giải ly với dung môi là nước Năm 1964, hệ gel polystyrene nối mạng ngang được chế tạo để giải ly với các hệ dung môi hữu cơ và được
sử dụng để tách riêng các hợp chất đồng thời còn được dùng để xác định một cách tương đối nhanh chóng trọng lượng phân tử cảu các hợp chất
II PHÂN LOẠI HẠT GEL DÙNG TRONG SẮC KÝ GEL
Việc tách trong sắc ký gel tùy thuộc vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian 3 chiều Hạt gel phải có kích thước khác nhau, trơ về mặt hóa học, bền cơ học
và các lỗ rỗng phải có cấu trúc với hình dạng đồng nhất
Mỗi loại gel có khoảng giới hạn về khả năng tách (theo kích thước phân tử) tùy theo kích thước lỗ rỗng của loại gel đó Do đó để tách một hỗn hợp mẫu có chứa nhiều loại hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau, người ta có thể dùng nhiều loại gel khác nhau, mỗi loại gel tách riêng ra một loại hợp chất nào đó
Các nhà sản xuất đã có những loại gel thương mại rất tốt, tuy nhiên những loại gel này không chịu được điều kiện có tính acid hoặc baz quá mạnh Các nhà sản xuất ít có những loại gel có lỗ rỗng lớn vì những loại này thường kém bền cơ học, khi tiến hành sắc
ký với áp suất nhỏ thì hạt keo dễ bị bóp méo, biến dạng làm ảnh hưởng tới vận tốc dòng chảy của pha động Giống như các loại sắc ký khác, hạt gel dùng trong sắc ký gel có dạng hình cầu Kích thước hạt gel càng nhỏ càng tốt nhưng phải đảm bảo dòng chảy thích hợp
Có 2 loại nguyên liệu chính để chế tạo gel: xerogel và aerogel Xerogel là loại gel cổ điển, gồm một polymer có nối mạng ngang Khi tiếp xúc với dung môi sẽ trương
nở tạo thành một mạng gồm những lỗ rỗng tương đối mềm, trong đó các lỗ trống là
khoảng trống giữa những chuỗi dây polymer trong hệ mạng Nếu dung môi được tách
riêng ra khỏi hệ mạng, cấu trúc gel này sẽ xụp đổ, đôi khi cấu trúc này cũng được tái tạo khi cho dung môi trở lại
Trang 3Ngược lại, aerogel là một nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel thực sự
Đó là loại chất rắn có lỗ rỗng, dung môi chui vào trong lỗ rỗng này, vì thế nó không bị sụp đổ khi người ta loại bỏ dung môi khỏi hạt gel Thí dụ, thủy tinh có lỗ rỗng và Silica
có lỗ rỗng Một vài loại nguyên liệu khác là sự pha trộn giữa xerogel và aerogel, loại này
có cấu trúc tương đối rắn chắc, nhưng có thể trương nở trong dung môi giống như nhựa trao đổi ion
Gel dextran với tên thương mại là Sephadex Gel (hãng Pharmacia, Sweden) là loại được điều chế đầu tiên và hiện vẫn còn thông dụng Nguyên liệu là polisaccharid tự nhiên mạch thẳng, tức là chuỗi dây poliglucose nối nhau bởi nối α-1,6 Nguyên liệu không tan trong môi trường nước
Các chuỗi dây polysaccharid của dextran khi được cho phản ứng với hợp chất epiclorohidrin, trong điều kiện kiềm, ở trong một môi trường dung môi hữu cơ, sẽ nối mạng ngang với nhau bởi cầu nối glyceril giữa các nhóm –OH (hình 2), để tạo thành chất rắn, dạng chuỗi không tan trong nước, nhưng có tính ái nước do mang nhiều nhóm hydroxi Đây là yếu tố giúp cho gel có thể trương nở trong dung dịch có nước; gel có thể giữ nước với số lượng là 1-20 ml/g gel
Khi thay đổi tỉ lệ giữa dextran và epiclorohidrin thì độ tạo mạng ngang sẽ thay đổi Nhờ vậy người ta có thể điều chế nhiều loại gel Sephadex với lỗ rỗng có kích cỡ khác nhau, để có thể áp dụng tách riêng các hợp chất theo nhiều trọng lượng phân tử khác nhau Gel Sephadex không tan trong nước, bền trong nước, trong các dung dịch muối, dung dịch kiềm và trong môi trường dung môi hữu cơ Gel có thể ổn định an toàn trong khoảng pH từ 2-12, mặc dù trong môi trường acid mạnh vẫn có sự thủy giải nối glycosid
Tồn trữ Gel: Cột gel có thể được sử dụng nhiều lần cho nhiều thí nghiệm, khi không
sử dụng nữa, tồn trữ bằng cách giữ nguyên trong cột (bịt chặt đầu cột để luôn có một lớp dung môi trên bề mặt gel), nhưng nếu để nguyên như thế gel có thể bị các vi sinh vật làm
hư hại Có thể tránh bằng cách thêm azid natri NaN3 vào dung dịch giải ly cuối với nồng
độ 0,02% Ngoài ra, sau khi sử dụng xong có thể làm gel trở lại dạng bột khô như ban đầu bằng cách sau:
- Cho gel vào một phễu lọc xốp để rữa sạch muối; tiếp theo rữa với EtOH 50% để làm giảm thể tích còn phân nữa
- Cho gel này vào EtOH 99% với tỉ lệ thể tích gel:EtOH là 1:2 Cho tiếp xúc trong
30 phút, thỉnh thoảng khuấy đảo nhẹ Lọc thu gel, rồi lại ngâm vào EtOH như thế nhiều lần Sấy khô gel ở nhiệt độ 60-80oC sẽ thu được bột khô rời dạng hạt Nếu bột khô không rời là do còn EtOH trong hạt gel thì tiếp tục sấy tiếp, chú ý khi nhiệt
độ sấy khoảng 120oC thì hạt gel biến thành màu nâu
Trang 4Trong các loại gel Sephadex, thường có kèm theo một chỉ số để chỉ lượng nước
mà gel khô cần hút để thành gel trương nở Bảng 2 cho thấy gel Sephadex G-15 sẽ hút 3ml nước/g gel khô Trong khi đó loại G-100 có độ hút nước là 15ml/g gel khô Vậy gel G-15 chặt chẽ hơn G-100 nên được dùng để tách các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ hơn
Các gel có độ nối mạng cao như Gel-10, Gel-15 trương nở trong nước và có thể trương nở trong các dung môi hữu cơ sau: dimetil formamid (DMF), dimetil sulfoxid (DMSO), etilen glycol; methanol-nước, nên gel thường được sử dụng để tách các hợp chất tự nhiên thuộc các hợp chất có thể tan được trong nước như: carbohydrat, các peptid nhỏ Cơ chế tách chủ yếu theo kiểu sắc ký gel, nhưng cũng có cơ chế khác như cơ chế hấp phụ
Bảng 18: Các loại gel Sephadex Gel và khả năng phân đoạn của gel
Sephadex Khả năng tách các hợp chất theo trọng lượng phân tử Thể tích trương nở trong nước (ml/g gel khô)
LH-20 100-4.000 Trương nở trong cloroform hoặc ethanol bằng như trương nở trong nước
Gel Sephadex LH-20 là Gel Sephadex G-25 được hydroxipropil hóa Việc biến thành dẫn xuất này giúp cho gel vừa có tính ái nước vừa có tính thân dầu Gel Sephadex LH-20 trương nở tốt trong dung môi phân cực: nước, methanol, tetrahydrofuran Gel trương nở gấp 4 lần thể tích lúc khô Nhờ khả năng có thể trương nở tốt trong dung môi hữu cơ phân cực mà gel Sephadex LH-20 được ưa chuộng trong việc tách các hợp chất tự nhiên tan được trong dung môi hữu cơ Các hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 4.000 thường không giữ lại trong gel nên được giải ly ra khỏi cột gel ngay trong thể tích trống của cột Khả năng tách các hợp chất theo trọng lượng phân tử khoảng 100-4.000
III.
Trang 5IV II.2 Gel polyacrylamid
Bio-gel là gel polyacrylamid được tổng hợp bằng cách cho ngưng tụ acrylamid với tác nhân nối mạng ngang là N,N’-metilen bisacrylamid Kích cỡ các lỗ rỗng có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi tỉ lệ giữa các monomer Gel polyacrylamid giống như gel Dextran là có thể giữ được nước với lượng 1,5-18 ml/g gel khô
So với gel Sephadex, gel polyacrylamid ít bền trong môi trường kiềm và có thể
bị thủy giải nhóm amid thành nhóm acid carboxylic
V II.3 Gel polyacryloilmorpholin
Đây là loại gel Enzacryl, được tạo thành khi cho đồng polymer hóa giữa acryloilmorpholin với N,N’-metil bisacrylamid Gel trương nở trong nước, cũng trương
nở trong piridin, cloroform nhưng không trương nở trong những alcol thấp
VI II.4 Gel polysryren
Polymer styren-divinylbenzen là loại thông dụng trong việc chế tạo các nhựa trao đổi ion, nhưng để chế tạo gel thì nguyên liệu không được có chứa các nhóm được ion hóa, sẽ tạo thành gel trong dung môi hữu cơ ít phân cực, Một loại gel này là Bio-Beads S Tuy nhiên, loại gel này có kích thước lỗ rỗng rất nhỏ nên việc sử dụng có giới hạn
VII II.5 Gel polyvinyl acetat
Đây là gel Merk-O-Gel được tạo thành khi đồng phân hóa giữa vinylacetat với 1,4-divinyloxibutan, sẽ được tạo thành loại gel có khả năng hoạt động trong dung môi hữu cơ phân cực, kể cả alcol
VIII II.6 Gel agarose
Bảng 19: Các loại gel Bio-Gel và khả năng phân đoạn của gel
theo trọng lượng phân tử Thể tích gel trương nở trong nước (ml/g gel khô)
Trang 6Tất cả các loại Xerogel với loại lỗ rỗng to, khi trương nở sẽ cho gel rất mềm
Để khắc phục nhược điểm này, người ta điều chế gel agarose Agarose là polysaccharid (là những đơn vị gồm các nối 1,3-β-D-galactose hoặc 1,4-β-D-galactose nối với 3,6-anhydro-α-L-galactose) Ở nhiệt độ >50oC , gel tan trong nước và nếu dung dịch để nguội
<30oC, gel được thành lập và bấy giờ không tan khi <40oC Trên nhiệt độ này, gel nóng chảy hoặc xụp đổ Gel agarose có độ bền hóa học giống như gel Dextran
Có nhiều loại gel agarose thương mại như: Sepharose, Bio-Gel A, Gelarose, Sagavac Các loại gel này có thể được sản xuất với lỗ trống rất to Các gel agarose có độ bền cơ học cao hơn gel dextran cùng cỡ lỗ Để làm gel trương nở, cần ngâm gel trong dung môi trong 2 giờ (gel P-2) đến 24 giờ (gel P-300)
IX II.7 Gel Silica có lỗ rỗng
Nhiều nhà sản xuất có loại gel silica thương mại với nhiều cỡ lỗ (Porasil, Merck-O-Gel) và có cấu trúc hạt rắn chắc Gel có thể sử dụng trong một số dung môi hữu
cơ, nhưng tốt nhất vẫn là sử dụng trong nước Các loại gel này có độ phân cực tương đối cao và gel có thể có khuynh hướng bắt giữ các phân tử theo cơ chế hấp thu
X II.8 Gel thủy tinh có lỗ rỗng
Có nhiều loại hạt thủy tinh có lỗ rỗng (Corning, Bio-Glass) Hạt gel này có thể được sử dụng trong sắc ký gel, trong cả hai môi trường nước và dung môi hữu cơ
Gel có nhược điểm là có thể có hiện tượng hấp thu trên bề mặt silica vì các nhóm mang một phần điện tích âm Ưu điểm của gel là có cơ cấu rắn chắc, bền nhiệt, bền lực, sử dụng được trong cả dung môi nước lẫn hữu cơ
XI PHƯƠNG PHÁP THỰC HÀNH SẮC KÝ CỘT GEL
XII III.1.Một số thông số về cột gel
Một cột gel được hình thành khi rót dung dịch huyền phù gồm những hạt gel đã trương nở trong dung môi vào trong một ống dài, hình trụ đều Có một cân bằng liên quan đến các loại thể tích như sau:
V t =V o +V i +V m
Vt : tổng thể tích của cột gel có thể đo được (Bed volume)
Vo: thể tích trống, thể tích chết, thể tích dung môi nằm trong cột gel Thể tích dung môi cần thiết để đuổi hợp chất có màu, có trọng lượng phân tử lớn, không bị giữ trong lỗ gel, ra khỏi cột gel (Void volume, Dead volume)
Vi: thể tích của một hợp chất tan (solute) của mẫu cần sắc ký
Trang 7Vm : thể tích các hạt gel đã trương nở nằm trong cột.
XIII III.2 Các nguyên tắc cơ bản để thực hành sắc ký cột gel
Cột sắc ký gel thường được chuẩn bị theo kiểu nhồi cột sệt với huyền phù nguyên liệu gel trong một lượng dung môi phù hợp Huyền phù gel trong dung môi (có thể loại bỏ những hạt cực mịn bằng cách lắng, gạn) được điều chỉnh sao cho thật sệt nhưng vẫn bảo đảm khi rót vào cột vẫn có thể chảy được thành dòng Muốn có huyền phù gel phải ngâm gel trong dung môi theo điều kiện trong bảng 4
Bảng 20: Thời gian ngâm gel Sephadex trong dung môi để trương nở
p Thời gian ngâm ở 100 o C
• Khi rót huyền phù gel vào cột xong, ổn định cột bằng cách cho dung môi giải ly
chảy ngang qua cột Lượng dung môi có thể tích bằng 2-3 lần thể tích cột, tốc độ chảy có thể nhanh hơn một ít so với khi thực nghiệm thực sự
• Tiếp theo cột được kiểm tra bằng cách cho một lượng mẩu kiểm tra, thường là
Dextran Blue 2000, vào đầu cột Thể tích dung dịch mẫu <105 thể tích cột Cho dung môi giải ly để đuổi hoàn toàn lượng mẫu ra khỏi cột: mẫu có mù xanh dương nên có thể theo dõi bằng mắt thường Nếu cột được nhồi một cách chặt chẽ và đều đặn thì mẫu kiểm tra ra khỏi cột bằng một dãy hẹp nằm ngang
Cách thử này cũng dùng để đo thể tích trống Vo của cột (void volume) Vo là thể tích dung môi cần thiết để đuổi một hợp chất màu (không bị giữ lại trong gel) ra khỏi cột sắc ký
Lưu ý: trong suốt quá trình nạp gel cũng như trong quá trình triển khai sắc ký, không được để khô lớp mặt gel trên đầu cột
Chuẩn bị mẫu để sắc ký
Dung dịch mẫu cần được loại bỏ những hợp chất còn ở dạng rắn cũng như những phân tử có thể bị hấp thu mạnh mẽ lên bề mặt gel
Khối lượng mẫu và nồng độ của những chất tan có trong mẫu chỉ quan trọng khi chúng có ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch mẫu Nếu độ nhớt của mẫu cao hơn 2 lần độ nhớt của dung môi giải ly thì có thể ảnh hưởng đến kết quả tách chất
Thể tích dung dịch mẫu cũng quan trọng Thể tích lớn nhất có thể sử dụng là (Ve1-Ve2) ; với Ve1 và Ve2 là thể tích để lần lượt giải ly 2 hợp chất có đặc điểm gần giống
Trang 8nhau nhất Với những loại mẫu mà (Ve1-Ve2) lớn, thể tích dung dịch mẫu có thể chiếm 10-30% tổng thể tích cột gel (Vt) Với những dung dịch mẫu mà (Ve1-Ve2) nhỏ, thể tích dung dịch mẫu chỉ nên là 1-3% của thể tích Vt
Dung dịch mẫu cần được hòa tan vào dung dịch đệm Đặt dung dịch mẫu lên đầu cột giống như khi thực hành trong cột silica gel cổ điển Giải ly cột có thể bằng trọng lực hoặc bằng bơm đẩy
Triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ Các chất tan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần
XIV III.3 Chuẩn bị cột sắc ký gel Sephadex LH-20
Kể từ năm 1959, sắc ký gel đã được áp dụng nhiều trong ngành sinh hóa để tách các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharid hay protein.Trong ngành hóa học hữu cơ, các chất cần phân tách thường có trọng lượng phân tử nhỏ, ít khi dùng kỹ thuật sắc ký gel này, mà thường dùng sắc ký gel để loại muối với gel Sephadex LH-20 hoặc Sephadex G-15
Kích thước của cột: Chọn cột thủy tinh có đường kính từ 1,5-2,5 cm chiều dài
từ 40-100cm Kích thước cột được điều chỉnh tùy vào thể tích gel sử dụng
Lượng mẫu và lượng gel: trung bình với 1 mg mẫu hợp chất cần sắc ký, cần
1ml gel đã trương nở
Cho trương nở gel: Trong một erlen hoặc một becher, cho gel khô Sephadex
LH-20 vào, cho một lượng dung môi methanol vừa đủ, để yên qua đêm cho gel trương nở Quan sát nếu cần thiết thì cho thêm methanol vào sao cho dung dịch huyền phù gel tuy sệt nhưng có thể chảy được thành dòng
Gel Sephadex LH-20 có thể ngâm trong các dung môi hữu cơ để cho trương nở theo bảng 21
Nạp gel vào cột: Sử dụng cột thủy tinh, đầu ra có chặn bằng thủy tinh xốp để
gel không bị chảy ra khỏi cột, cột được dựng thẳng đứng trên một giá, mở một phần khóa ở đầu ra Rót dung dịch huyền phù gel vào cột, dung môi chảy ra ở đầu dưới cột Rót dung dịch gel vào cột thành một dòng nhỏ, đều, chậm chậm sao cho chỉ rót một lần là hết lượng gel (để tạo thành một khối gel đồng đều và chặt chẽ), tránh rót thành nhiều đợt Có thể gỏ nhẹ bên ngoài thành cột để cho gel được nén đều
Bảng 21: Thể tích gel Sephadex trương nở trong các loại dung môi
Trang 9Methanol 1.9 4.0-4.5
-Cân bằng cột gel: Khi nạp cột xong, tiếp tục cho dung môi như methanol chảy
ngang qua cột với vận tốc 1-5ml/phút để gel cân bằng với methanol
Lượng dung môi hòa tan mẫu: Mẫu được hòa tan trong dung môi methanol
- Nếu mục đích sắc ký là để tách riêng các hợp chất thì lượng dung môi là 1-5% thể tích cột gel Thí dụ nếu thể tích cột gel là 200ml thì lượng dung môi hào tan mẫu là
10 ml
- Nếu mục đích sắc ký là loại muối thì lượng dung môi có thể đến 30% thể tích cột gel
Nạp mẫu vào đầu cột: Mở khóa để hạ mức dung môi xuống gần sát mặt
thoáng gel trên đầu cột, sử dụng pipet để đưa dung dịch mẫu lên đầu cột gel Mở khóa để dung môi chảy ra khỏi cột đến khi mức dung môi xuống sát mặt thoáng gel trên đầu cột, khóa cột lại, cho thêm một ít methanol vào, mở khóa để dung môi chảy ra Làm như thế nhiều lần để cho dung dịch mẫu thấm sâu vào lớp gel trên đầu cột Đến khi bắt đầu giải
ly, mẫu không hòa tan trở lại dung môi giải ly
Giải ly cột: Cho dung môi vào đầy phần trên đầu cột và mở khóa bên dưới để
bắt đầu giải ly Sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ
Có thể giải ly bằng trọng lực, vận tốc từ 10-15cm/giờ
Tốt nhất là có thể sử dụng máy bơm đẩy khí trên đầu cột vì có thể điều chỉnh được vận tốc 2-4ml/phút
Trang 10XV CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT SẮC KÝ GEL
IV.1 Tách một hỗn hợp thành các nhóm chất riêng lẻ
Áp dụng đơn giản nhất của sắc ký gel là tách 2 nhóm hợp chất tan có kích thước khác xa nhau Nếu chọn được loại gel thích hợp, hợp chất có khối lượng phân tử lớn sẽ bị đuổi hoàn toàn ra khỏi cột gel, thường bị đuổi ra khỏi cột ngay từ thể tích trống
Vo Còn hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ sẽ bị giữ chặt trong cột và bị đuổi ra sau
Thí dụ: trong quá trình chuyển đổi hóa học, các hợp chất protein có trọng lượng phân tử lớn sẽ sinh ra các phụ phẩm có trọng lượng phân tử nhỏ hơn như urê, đường, peptid…Các phụ phẩm này được loại bỏ ra khỏi sản phẩm có trọng lượng phân tử lớn bằng sắc ký gel
IV.2 Xác định trọng lượng phân tử của một hợp chất có trọng lượng phân
tử lớn
Đầu tiên, sắc ký gel được sử dụng để tách các đại phân tử có nguồn gốc sinh học như: polysaccharid, protein, acid nucleic và enzym Các quan sát thấy rằng các hợp chất bị đuổi ra khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần Người ta sử dụng nguyên tắc này để ước đoán trọng lượng phân tử của một hợp chất chưa biết
Cách thực hiện: Cột gel được sắc ký lần lượt bởi nhiều hợp chất cùng chủng
loại có trọng lượng phân tử đã biết, vẽ đường biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích giải ly
và trọng lượng phân tử Với một hợp chất bất kỳ, nạp vào cột và giải ly ra khỏi cột để biết được thể tích giải ly Nhờ vào đường chuẩn để suy ra được trọng lượng phân tử của chất
đó Cần cố gắng chọn chất chuẩn có cấu trúc hóa học tương đồng với chất cần xác định trọng lượng phân tử
Các nhà sản xuất thường có nhiều bộ chất chuẩn, tùy thuộc vào hợp chất cần xác định mà chọn bộ chất chuẩn thích hợp Một số bộ chất chuẩn thương mại là protein được trình bày trong bảng 22
Bảng 22: Một số protein được sử dụng làm chất chuẩn để đo trọng lượng phân tử