Giáo trình chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên, chương 6 sắc ký gel

CHƯƠNG 6: SẮC KÝ GEL I ĐỊNH NGHĨA, NGUYÊN TẮC Sắc ký gel Mould D.L phát triển từ năm 1954 dùng để tách hợp chất không mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử chúng Nguyên tắc sắc ký không thay đổi tên gọi chúng thay đổi theo thời gian Năm 1959, tác giả Porath Flodin gọi Gel filtration; đến năm 1964, Moor gọi Gel permeation Chromatography Cuối cùng, năm 1964 người ta gọi Gel chromatography danh từ “sắc ký gel” sử dụng thống Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polimer có lỗ rỗng, lỗ rỗng phủ đầy dung mơi dùng làm pha động Kích thước lỗ rỗng phải đồng nhất, kỹ thuật sắc ký gel dùng để tách chất theo trọng lượng phân tử Các phân tử có kích thước lớn kích thước lỗ rỗng khơng lọt vào lỗ rỗng bị dung môi làm pha động khỏi cột Còn phân tử có kích thước nhỏ kích thước lỗ rỗng chui vào lỗ rỗng bị giải ly khỏi cột chậm Như vậy, thành phần khác hỗn hợp cần phân tích khỏi cột theo trọng lượng phân tử, phân tử lớn bị giải ly cột trước phân tử nhỏ sau (a) : hỗn hợp mẫu nạp đầu cột với (.) phân tử có kích thước nhỏ () phân tử có kích thước lớn (b) : việc tách xảy phần, phân tử lớn bắt đầu tách khỏi phân tử nhỏ (c) : việc tách xảy hoàn toàn, phân tử lớn chuẩn bị khỏi cột Tất phân tử lớn bị giải ly khỏi cột lượt tách riêng Tương tự, phân tử nhỏ chui vào lỗ gel không tách riêng Các phân tử có kích thước trung bình bị giữ lại cột tùy theo mức độ chui vào lỗ rỗng hạt Nếu hợp chất có chứa nhóm chức hóa học, chúng giải ly khỏi cột theo trọng lượng tương đối chúng Lức hấp thu bề mặt hạt Gel bỏ qua nên sắc ký gel xem loại sắc ký phân chia Pha tĩnh lỏng chất lỏng nằm hệ mạng pha động dung môi di động, phủ tất phần lại cột sắc ký Nói cách khác, loại cột sắc ký phân chia pha lỏng (pha tĩnh pha động) mà pha có thành phần Sắc ký gel dùng để tách phân tử sinh học, thí dụ hệ gel dextran nối mạng ngang phù hợp giải ly với dung môi nước Năm 1964, hệ gel polystyrene nối mạng ngang chế tạo để giải ly với hệ dung môi hữu sử dụng để tách riêng hợp chất đồng thời dùng để xác định cách tương đối nhanh chóng trọng lượng phân tử cảu hợp chất II PHÂN LOẠI HẠT GEL DÙNG TRONG SẮC KÝ GEL Việc tách sắc ký gel tùy thuộc vào đặc điểm lỗ rỗng hệ mạng khơng gian chiều Hạt gel phải có kích thước khác nhau, trơ mặt hóa học, bền học lỗ rỗng phải có cấu trúc với hình dạng đồng Mỗi loại gel có khoảng giới hạn khả tách (theo kích thước phân tử) tùy theo kích thước lỗ rỗng loại gel Do để tách hỗn hợp mẫu có chứa nhiều loại hợp chất có trọng lượng phân tử khác nhau, người ta dùng nhiều loại gel khác nhau, loại gel tách riêng loại hợp chất Các nhà sản xuất có loại gel thương mại tốt, nhiên loại gel khơng chịu điều kiện có tính acid baz mạnh Các nhà sản xuất có loại gel có lỗ rỗng lớn loại thường bền học, tiến hành sắc ký với áp suất nhỏ hạt keo dễ bị bóp méo, biến dạng làm ảnh hưởng tới vận tốc dòng chảy pha động Giống loại sắc ký khác, hạt gel dùng sắc ký gel có dạng hình cầu Kích thước hạt gel nhỏ tốt phải đảm bảo dòng chảy thích hợp Có loại ngun liệu để chế tạo gel: xerogel aerogel Xerogel loại gel cổ điển, gồm polymer có nối mạng ngang Khi tiếp xúc với dung môi trương nở tạo thành mạng gồm lỗ rỗng tương đối mềm, lỗ trống khoảng trống chuỗi dây polymer hệ mạng Nếu dung môi tách riêng khỏi hệ mạng, cấu trúc gel xụp đổ, cấu trúc tái tạo cho dung môi trở lại Ngược lại, aerogel nguyên liệu rắn gel thực Đó loại chất rắn có lỗ rỗng, dung mơi chui vào lỗ rỗng này, khơng bị sụp đổ người ta loại bỏ dung môi khỏi hạt gel Thí dụ, thủy tinh có lỗ rỗng Silica có lỗ rỗng Một vài loại nguyên liệu khác pha trộn xerogel aerogel, loại có cấu trúc tương đối rắn chắc, trương nở dung môi giống nhựa trao đổi ion II.1 Del dextran Gel dextran với tên thương mại Sephadex Gel (hãng Pharmacia, Sweden) loại điều chế thơng dụng Nguyên liệu polisaccharid tự nhiên mạch thẳng, tức chuỗi dây poliglucose nối nối -1,6 Nguyên liệu không tan môi trường nước Các chuỗi dây polysaccharid dextran cho phản ứng với hợp chất epiclorohidrin, điều kiện kiềm, môi trường dung môi hữu cơ, nối mạng ngang với cầu nối glyceril nhóm –OH (hình 2), để tạo thành chất rắn, dạng chuỗi không tan nước, có tính nước mang nhiều nhóm hydroxi Đây yếu tố giúp cho gel trương nở dung dịch có nước; gel giữ nước với số lượng 1-20 ml/g gel Khi thay đổi tỉ lệ dextran epiclorohidrin độ tạo mạng ngang thay đổi Nhờ người ta điều chế nhiều loại gel Sephadex với lỗ rỗng có kích cỡ khác nhau, để áp dụng tách riêng hợp chất theo nhiều trọng lượng phân tử khác Gel Sephadex không tan nước, bền nước, dung dịch muối, dung dịch kiềm môi trường dung môi hữu Gel ổn định an tồn khoảng pH từ 2-12, môi trường acid mạnh có thủy giải nối glycosid Tồn trữ Gel: Cột gel sử dụng nhiều lần cho nhiều thí nghiệm, khơng sử dụng nữa, tồn trữ cách giữ nguyên cột (bịt chặt đầu cột để ln có lớp dung mơi bề mặt gel), để nguyên gel bị vi sinh vật làm hư hại Có thể tránh cách thêm azid natri NaN vào dung dịch giải ly cuối với nồng độ 0,02% Ngoài ra, sau sử dụng xong làm gel trở lại dạng bột khô ban đầu cách sau: - Cho gel vào phễu lọc xốp để rữa muối; rữa với EtOH 50% để làm giảm thể tích phân - Cho gel vào EtOH 99% với tỉ lệ thể tích gel:EtOH 1:2 Cho tiếp xúc 30 phút, khuấy đảo nhẹ Lọc thu gel, lại ngâm vào EtOH nhiều lần Sấy khô gel nhiệt độ 60-80 oC thu bột khô rời dạng hạt Nếu bột khơ khơng rời EtOH hạt gel tiếp tục sấy tiếp, ý nhiệt độ sấy khoảng 120oC hạt gel biến thành màu nâu Trong loại gel Sephadex, thường có kèm theo số để lượng nước mà gel khô cần hút để thành gel trương nở Bảng cho thấy gel Sephadex G-15 hút 3ml nước/g gel khô Trong loại G-100 có độ hút nước 15ml/g gel khô Vậy gel G-15 chặt chẽ G-100 nên dùng để tách hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ Các gel có độ nối mạng cao Gel-10, Gel-15 trương nở nước trương nở dung mơi hữu sau: dimetil formamid (DMF), dimetil sulfoxid (DMSO), etilen glycol; methanol-nước, nên gel thường sử dụng để tách hợp chất tự nhiên thuộc hợp chất tan nước như: carbohydrat, peptid nhỏ Cơ chế tách chủ yếu theo kiểu sắc ký gel, có chế khác chế hấp phụ Bảng 18: Các loại gel Sephadex Gel khả phân đoạn gel Loại gel Khả tách hợp chất Thể tích trương nở nước (ml/g Sephadex theo trọng lượng phân tử gel khô) G-10 0-700 2.5 G-15 0-1.500 G-25 100-5.000 LH-20 100-4.000 Trương nở cloroform ethanol trương nở nước G-50 500-10.000 G-100 1000-100.000 Gel Sephadex LH-20 Gel Sephadex G-25 hydroxipropil hóa Việc biến thành dẫn xuất giúp cho gel vừa có tính nước vừa có tính thân dầu Gel Sephadex LH-20 trương nở tốt dung môi phân cực: nước, methanol, tetrahydrofuran Gel trương nở gấp lần thể tích lúc khơ Nhờ khả trương nở tốt dung môi hữu phân cực mà gel Sephadex LH-20 ưa chuộng việc tách hợp chất tự nhiên tan dung mơi hữu Các hợp chất có trọng lượng phân tử khoảng 4.000 thường không giữ lại gel nên giải ly khỏi cột gel thể tích trống cột Khả tách hợp chất theo trọng lượng phân tử khoảng 100-4.000 III II.2 Gel polyacrylamid IV Bio-gel gel polyacrylamid tổng hợp cách cho ngưng tụ acrylamid với tác nhân nối mạng ngang N,N’-metilen bisacrylamid Kích cỡ lỗ rỗng điều chỉnh cách thay đổi tỉ lệ monomer Gel polyacrylamid giống gel Dextran giữ nước với lượng 1,5-18 ml/g gel khô So với gel Sephadex, gel polyacrylamid bền mơi trường kiềm bị thủy giải nhóm amid thành nhóm acid carboxylic II.3 Gel polyacryloilmorpholin V Đây loại gel Enzacryl, tạo thành cho đồng polymer hóa acryloilmorpholin với N,N’-metil bisacrylamid Gel trương nở nước, trương nở piridin, cloroform không trương nở alcol thấp VI II.4 Gel polysryren Polymer styren-divinylbenzen loại thông dụng việc chế tạo nhựa trao đổi ion, để chế tạo gel ngun liệu khơng có chứa nhóm ion hóa, tạo thành gel dung mơi hữu phân cực, Một loại gel Bio-Beads S Tuy nhiên, loại gel có kích thước lỗ rỗng nhỏ nên việc sử dụng có giới hạn VII II.5 Gel polyvinyl acetat Đây gel Merk-O-Gel tạo thành đồng phân hóa vinylacetat với 1,4-divinyloxibutan, tạo thành loại gel có khả hoạt động dung môi hữu phân cực, kể alcol VIII II.6 Gel agarose Bảng 19: Các loại gel Bio-Gel khả phân đoạn gel Gel Bio-Gel P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 P-100 P-150 P-200 P-300 Khả tách hợp chất Thể tích gel trương nở theo trọng lượng phân tử nước (ml/g gel khô) 200-2.000 3.8 500-4.000 6.1 1.000-5.000 7.4 1.500-17.000 12 20.000-50.000 14 30.000-70.000 18 40.000-100.000 22 50.000-150.000 27 80.000-300.000 47 100.000-400.000 70 Tất loại Xerogel với loại lỗ rỗng to, trương nở cho gel mềm Để khắc phục nhược điểm này, người ta điều chế gel agarose Agarose polysaccharid (là đơn vị gồm nối 1,3--D-galactose 1,4--D-galactose nối với 3,6anhydro--L-galactose) Ở nhiệt độ >50oC , gel tan nước dung dịch để nguội