Giáo trình chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên, chương 2 các phương pháp cô lập

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC HÓA THỰC VẬT Sau chiết xuất mẫu dung môi, lọc, thu hồi dung môi cô quay chân không nhiệt độ 50oC thu cao trích Với cao trích tồn phần này, người ta thường tiến hành phân tích sơ thành phần hóa học để có kết định tính trước dùng kỹ thuật sắc ký để cô lập hợp chất tinh khiết I KHẢO SÁT HOÁ THỰC VẬT Trong thường chứa hợp chất tự nhiên như: steroid, alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, glycoside…Phương pháp phân tích sàng lọc cổ điển phương pháp StasOtto Nguyên tắc phương pháp phân chia hợp chất dựa vào độ hòa tan chúng dung mơi có độ phân cực khác nhau: thuốc, nước ta thường sử dụng phương pháp phân tích trường Đại học Dược khoa Rumani tính đơn giản, rẻ tiền nhanh chóng Tuy nhiên từ kết phân tích sơ này, người ta phải phối kiểm lại phương pháp phân tích khác để có kết luận xác Đơi người ta tìm hiểu số đặc điểm cao trích trước độ hòa tan dung mơi, phân chia hai hệ dung mơi khơng hòa tan vào nhau, đặc tính acid-baz, điện tích… Tiến trình phân tích sơ hố thực vật trình bày tổng qt sơ đồ Mg/HCl đđ Lớp kiềm Dịch cồn Vết giấy lọc +KOH 10% Dịch ether KOH 10% Cặn có mùi thơm H2SO4 10% Dịch ether + H2SO4 đđ Lớp ether Dịch acid Chiết ether Liebermann TT Mayer, Bouchardat Dragendorff , Liebermann KOH, HCl NGUYÊN LI ỆU TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na2CO3 Dịch chiết cồn Na Acetat + FeCl3 3%Mg/HCl đđ KOH 10% Bã nguyên liệu Chiết cồn H2SO4 10% Bã nguyên liệu Liebermann Cồn cao độ Bã nguyên liệu FeCl3 Dịch acid TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Tạo bọt FLAVONOID ACID BÉO ANTHRAGLYCOSID TINH DẦU PHYTOSTEROL CAROTENOID ALCALOID SAPONIN ANTHOCYANIN ĐƯỜNG ALCALOID ACID HỮU CƠ TANIN FLAVONOID ANTHRAGLYCOSID STEROID H/C URONIC TANIN ĐƯỜNG ALCALOID SAPONIN I.1 Xác định chất tan dịch ether ethylic Cân 5g bột nguyên liệu cho vào bình nón nút mài 250ml, lắc với 30 ml ether ethylic phút Làm lần dịch ether khơng màu Tập trung dịch lọc bình lắng gạn, lắc với 60ml KOH (20ml x lần) tách lớp: lớp kiềm lớp ether a Phân tích dung dịch kiềm Dung dịch kiềm cho vào becher trung hòa HCl 25% để trung tính, lọc Tủa phểu lọc hòa với 5ml cồn 90o, chia làm ống nghiệm - Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10% có màu đỏ, sơ nhận định có hợp chất ANTHRAGLYCOSID - Ống 2: acid hóa với HCl đậm đặc, sau cho bột Mg kim loại, có màu đỏ, sơ nhận định có FLAVONOID - Ống 3: nhỏ giọt lên giấy lọc khơ, hơ khơ, giấy lọc có vết mờ sơ nhận định có ACID BÉO b Phân tích dung dịch ether Lớp dung dịch ether rửa lần với nước cất (20ml x lần), sau lắc lần với dung dịch H2SO4 2% (5ml x lần) Các dịch acid góp lại để làm phản ứng định tính alcaloid với: - Thuốc thử Mayer: Tủa vàng nhạt - Thuốc thử Dragendorff: Tủa Cam - Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu Dịch ether chia làm phần cho vào chén sứ, bốc đến cạn - Chén 1: có mùi thơm có TINH DẦU - Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đđ, có màu xanh có CAROTENOID - Chén 3: Hóa cắn với 10 giọt anhydrid acetic cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ theo thành ống nghiệm Nếu chổ giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ sơ nhận định có hợp chất PHYTOSTEROL I.2 Xác định chất tan dịch cồn Bã nguyên liệu sau chiết ether đem chiết nóng với cồn 90 o (30ml x lần) bếp cách thủy, lọc Tập trung dịch lọc vào bình nón, chia làm phần  Phần 1: Pha lỗng dung dịch cồn với thể tích nước cất, kiềm hóa dung dịch NH4OH đđ, lọc: a Tủa phểu hòa với ml CHCl 3, hứng vào ống nghiệm Sau cho vào 1ml anhydrid acetic nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ Nếu dung dịch có màu xanh có nhân STEROID b Dịch lọc acid hóa HCl, lọc Tủa phểu hòa với 3-4 ml cồn 90 o chia làm ống nghiệm - Ống 1: Cho vài giọt KOH, có màu đỏ có hợp chất ANTHRAGLYCODID - Ống 2: cho vào bột Mg kim loại vài giọt HCL có màu đỏ có hợp chất FLAVONOID  Phần thứ 2: Pha loãng dịch cồn với thể tích nước cất chia làm phần: - Ống 1: Trung hòa với natri acetat, thêm vài giọt FeCl 2%, có màu xanh đen có TANIN - Ống 2: cho vào vài tinh thể Na2CO3, có sủi bọt có acid hữu  Phần thứ 3: Dịch cồn bóc cách thủy chen sứ đến cạn, hòa cắn với 4-5 ml H2SO4 2%, lọc Chia dịch lọc làm phần để làm phản ứng định tính alcaloid - Ống 1: + thuốc thử Mayer - Ống 2: + thuốc thử Dragendorff - Ống 3: + thuốc thử Bouchardat  Phần thứ 4: Bốc dịch cồn chén sứ cạn, hòa cắn với 3ml nước cất đun nóng Lọc, cho thêm vào nước lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A 4-5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, có tủa gạch có ĐƯỜNG KHỬ  Phần thứ 5: Dịch cồn pha loãng với thể tích nước cất, chia làm ống nghiệm: - Ống 1: acid hóa (màu đỏ) - Ống 2: Kiềm hóa (màu lục) Thì có ANTHOCYNANOSID  Phần thứ 6: Chia dịch cồn làm phần, bóc cách thủy chén sứ - Chén 1: hòa với ml nước cất, lắc mạnh có bọt có SAPONIN - Chén 2: hòa vào chén 0,5 ml CHCl 3và 0,5 ml anhydric acetic, cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ H2SO4 đđ + Có vòng tím có SAPONIN TRITERPEN + Có vòng xanh lục có SAPONIN STEROID I.3 Xác dịnh chất tan dịch acid Bã nguyên liệu sau chiết với cồn 90o chiết với H2SO4 2% (20ml x lần) Lọc, chia nước lọc làm phần: - Phần 1: Lắc ống nghiệm, có bọt bền có SAPONIN - Phần 2: Kiềm hóa với NH4OH 10% , lắc với ether (5ml x lần) Loại bỏ lớp nước, lớp ether lắc với H2SO4 2% Dịch acid chia làm phần để làm phản ứng tìm alcaloid (thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff) - Phần thứ 3: Cho tác dụng với thuốc thử Fehling, có tủa đỏ gạch có ĐƯỜNG KHỬ - Phần 4: trung tính hóa với natri acetat, sau thêm vài giọt FeCl 10% , có tủa xanh nâu có TANIN - Phần 5: Pha dịch với thể tích cồn 90o, có tủa nhiều có hợp chất URONIC Bảng 2: Tóm tắt diện hợp chất tự nhiên có cao trích (trường hợp thí dụ) Cao trích dung mơi Ether ethyl Ethanol 90% Acid 1% Thuốc thử Phản ứng màu Hợp chất thiên nhiên + + - KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycoside + - - Nhỏ lên giấy lọc Có vết ố màu Acid béo - + - Mg/HCl dung dịch Có vòng màu đỏ Flavonoid + - - Liebermann Có màu lục đỏ Phytosterol + - - H2SO4 đđ Khơng màu Carotenoid - + + Mayer, Bouchardat, Có tủa màu Hager, Dragendorff Alcaloid - - Lắc mạnh dịch Saponin ++ + FeCl 5% dung Khơng có bọt Màu lục đen Tanin - II +++ - Fehling Tủa màu đỏ gạch Đường khử TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC KỸ THUẬT KẾT TINH Kết cuối trình chiết tách, phân lập tinh chế phải thu hợp chất sạch, thông thường dạng tinh thể trừ chất lỏng chất vơ định hình khơng thể kết tinh Q trình kết tinh bao gồm việc chọn dung mơi, hồ tan nóng lọc, gạn tinh thể khỏi dung dịch mẹ làm khô tinh thể Trong bước việc chọn dung mơi thích hợp có tầm quan trọng định kết kết tinh I.1 Chọn dung môi Đối với hợp chất biết, thường tài liệu tham khảo có cho biết dung môi kết tinh điểm chảy Đối với chất chưa biết, phải chọn dung môi để kết tinh theo qui tắc sau: - Một dung môi tốt để kết tinh hợp chất hòa tan nhiều hợp chất nhiệt độ sơi, tan nhiệt độ thường Một dung mơi để kết tinh tốt độ hòa tan nhiệt độ sơi thường phải cao gấp lần nhiệt độ thường - Nếu khơng tìm dung mơi thích hợp phải phối hợp dung mơi Trong dung mơi đó, phải có dung mơi có khả hòa tan nhiều hợp chất kết tinh nhiệt độ sôi dung môi khơng hòa tan Hai dung mơi phải hỗn hợp với thành dung dịch suốt đồng - Thông thường chất rắn dễ hòa tan dung mơi có cấu trúc hình học tương tự Thí dụ ester dể hòa tan cồn ethyl acetat Các hydrocarbon dễ hòa tan eter dầu hỏa, benzen, hexan - Các chất có nhiều nhóm OH, glycoside dễ tan dung môi ưa nước MeOH, EtOH hỗn hợp dung mơi có nước - Thường hợp chất dễ tan nước khó tan dung mơi hữu ngược lại - Dung môi dùng kết tinh không tạo thành hợp chất với chất kết tinh - Dung mơi kết tinh tốt phải có nhiệt độ sôi tương đối cao Nhiệt độ sôi cao có nhiều thời gian để hình thành tinh thể, nhiên khơng nên q cao khó bay kết tinh, đồng thời nhiệt độ cao làm phân hủy chất kết tinh - Trên thực tế để kết tinh hợp chất tự nhiên, ta hay dùng MeOH hỗn hợp MeOH với dung môi khác Việc chọn dung môi kết hợp với MeOH tùy thuộc vào tính hồ tan chất cần kết tinh I.2 Cách xác định độ hoà tan chất dung mơi Cân lượng xác chất tan ống nghiệm, dùng ống hút có chia vạch 0,1 ml nhỏ dung mơi muốn hòa tan chất kết tinh, nhỏ từ từ vào hợp chất tan hồn tồn Sau lần cho dung mơi vào, cần lắc mạnh ống nghiệm để hoà tan chất Tỷ lệ lượng chất rắn với thể tích dung mơi đủ để hòa tan hồn tồn độ hòa tan dung môi với chất rắn nhiệt độ thường Cách xác định độ hòa tan nhiệt độ sơi tiến hành tương tự, thực nồi đun cách thủy Căn vào độ hòa tan xác định để tính lượng dung mơi cần thiết cho kết tinh Thí dụ: hợp chất có độ hồ tan: 5mg 1ml dung mơi B nhiệt độ thường 45 mg ml nhiệt độ sơi Dung mơi hồ tan chất nhiệt độ sôi gấp lần nhiệt độ thường nên dùng làm dung mơi kết tinh Nếu có 500 mg chất lượng dung mơi cần dùng : 1mlx 500/45 ≈ 11 ml Như dùng khoảng 12 ml dung môi để kết tinh 500 mg hợp chất Căn vào độ tan nhiệt độ thường (5mg/ml), người ta ước tính lượng hợp chất lại dung dịch sau kết tinh I.3 Cách hòa tan nóng Để kết tinh lượng nhỏ chất rắn (10-20mg), nên sử dụng bình cầu nhỏ ống nghiệm nhỏ - Trường hợp dùng dung mơi: Cho chất rắn vào bình, đổ lượng dung mơi tính trước vào bình, đun cách thủy đến sôi đồng thời lắc Khi dung dịch trở nên suốt, lấy bình để nguội cho vào tủ lạnh để yên kết tinh - Trường hợp dùng hỗn hợp dung mơi : thí dụ A dung môi tan, B dung môi không tan tan Trong bình cầu có chứa bột chất kết tinh, cho lượng nhỏ dung môi A đun sơi thủy Tiếp tục cho dung môi A chất rắn vừa tan hết sau dùng ống hút lấy dung mơi B cho vào bình dung dịch bắt đầu đục Bình đun sơi, lấy dung mơi A cho vào bình dung dịch bắt đầu suốt trở lại Lấy bình ra, để nguội nhiệt độ thường, sau cho vào tủ lạnh để yên kết tinh I.4 Gạn lấy tinh thể làm khơ Nếu lượng tinh thể khơng nên lọc hao hụt nhiều Nghiêng bình hút dung dịch mẹ bình khác, dùng ống hút lấy dung mơi rữa nhẹ nhàng tinh thể Sau để khơ tự nhiên 1-2 giờ, cho vào bình hút ẩm vài ngày trước đo điểm nóng chảy phân tích quang phổ Bảng 25:Một số dung mơi kết tinh thường dùng MeOH-H2O EtOH-Aceton EtOH-H2O EtOAc MeOH Ether-EtOAc EtOH Hexan-EtOAc III MeOH-EtOAc Ethet-Aceton MeOH-Aceton Hexan TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Kỹ thuật sắc ký sử dụng nhiều từ lâu Phương pháp phát triển nhanh chóng từ năm 1930-1940 Sắc ký trình tách liên tục vi phân hỗn hợp chất phân bố không đồng chúng pha tĩnh pha động cho pha động xuyên qua pha tĩnh Trong năm 1930, loạt nhà hóa học nhận giải thưởng Nobel Hóa học hợp chất thiên nhiên nhờ ứng dụng thành công phương pháp cô lập sắc ký cột hấp phụ - 1937, P KARRER (Thụy sĩ) hóa học Carotenoid, đặc biệt vitamin A vitamin B - 1938, R KURN (Đức) hóa học Carotenoid Vitamin - 1939, L.RIZICKA (Thụy sĩ) hóa học Polymetylen Terpenoid - 1940, MARTIN SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu sắc ký phân bố lớp silicagel sau phát triển sang sắc ký giấy Hai ông giải thưởng Nobel năm 1952 sắc ký phân bố - 1948, TISLIUS (Thụy điển) giải thưởng Nobel kỹ thuật điện di sắc ký hấp phụ Phương pháp sắc ký đời cung cấp cho hóa học công cụ tách chiết hiệu nhanh chóng, mở giai đoạn phát triển rực rỡ ngành hóa học, đặc biệt hóa học hợp chất thiên nhiên Một đặc điểm phương pháp sắc ký tính đa dạng, cho phép ta ứng dụng hồn cảnh, điều kiện… Trong hoàn cảnh chưa trang bị máy chuyên dùng đại máy sắc ký khí, máy sắc ký lỏng cao áp… thực việc phân tích sắc ký áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký cột hấp phụ cổ điển với dụng cụ phương tiện đơn giản mà sở nghiên cứu sắm Ngay nước tiên tiến, bên cạnh máy đại, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột công cụ đắc lực công tác nghiên cứu ngày Có nhiều phương pháp để phân loại sắc ký: - Nếu dựa theo trạng thái liên hợp pha động có sắc ký lỏng sắc ký khí - Nếu dựa theo chế trình tách: + Sắc ký hấp phụ + Sắc ký phân bố + Sắc ký gel + Sắc ký trao đổi ion III.1 Sắc ký hấp phụ Hấp phụ tích tụ hợp chất trạng thái khí lỏng lên bề mặt chất rắn Hay nói cách khác tích tụ ranh giới pha: khí-rắn, lỏng-rắn Trong sắc ký hấp phụ lỏng, pha tĩnh chất rắn mịn xốp, pha động chất lỏng Dựa tính hấp phụ khác cấu tử hỗn hợp cần tách chất hấp phụ (pha tĩnh), người ta dùng dung mơi thích hợp (pha động) qua pha tĩnh để giải hấp, ta tách riêng phần cấu tử hỗn hợp Các yếu tố quan trọng sắc ký hấp phụ lựa chọn chất hấp phụ dung môi Chất hấp phụ cần phải thỏa mãn tính chất sau: - Khơng tương tác với cấu tử cần phân tách: không tạo phản ứng phụ oxyd hóa, polymer hóa… - Phải có tính chọn lọc, tức lực hấp phụ cấu tử cần tách hỗn hợp phải khác - Độ mịn hạt phải thích hợp: hạt bé, cân hấp phụ thiết lập nhanh, nhỏ ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy pha động - Chất hấp phụ phải ổn định tiêu chuẩn hóa để kết trùng lập Dựa kinh nghiệm, chất hấp phụ hay dùng xếp theo thứ tự hoạt tính giảm dần sau: Than hoạt tính Silicagel Đất tẩy trắng Magie silicat Nhôm oxyd (axit) Nhôm oxyd (baz) Crom (III) oxyd Kẽm sulfur Nhơm oxyd (trung tính) Nhơm hydroxyd Calci hydroxyd Calci carbonat Calci sulfat Tal C Đường, tinh bột Inulin Bột Celluloz Trong thực tế, người ta hay dùng rộng rãi oxyd nhôm silicagel để tách hỗn hợp phân cực không phân cực Đối với dung môi phải thỏa mãn điều kiện sau: - Hòa tan tương đối tốt tất cấu tử hỗn hợp cần phân tích - Bị hấp phụ pha tĩnh - Khơng phản ứng hóa học chất cần phân tích chất hấp phụ - Phải tinh khiết Đối với chất phân tích (chất bị hấp phụ), cấu trúc hóa học có ảnh hưởng trực tiếp lên độ hấp phụ chúng Các hợp chất hydrocarbon bão hòa có độ hấp phụ kém, thêm nối đơi hay nhóm chức lực hấp phụ chúng tăng lên Trong thực nghiệm, người ta xây dựng dãy nhóm chức có độ hấp phụ giảm dần sau: - Đối với hydrocarbon nhân thơm: -COOH > -CONH2 > -OH > -NHCOCH > -NH3 > -OCOCH3 > -(CH3)2 > -OCH3 > -H > -Cl - Đối với hydrocarbon mạch thẳng: -COOH > -OH > -NH2 > C=O > -OR > -CH3 III.2 Sắc ký phân bố Sắc ký phân bố dựa phân chia chất chất lỏng không trộn lẫn vào (hoặc chất lỏng chất khí) cho chất lỏng thứ (pha động) di chuyển qua chất lỏng thứ (pha tĩnh) Thông thường pha tĩnh hấp thụ bề mặt chất rắn gọi chất mang liên kết hóa học với chất mang Các phương pháp sắc ký dựa nguyên tắc phân bố: - Sắc ký cột - Sắc ký giấy - Sắc ký khí Bảng 3: Phân loại kỹ thuật sắc ký Loại pha tĩnh Loại pha Dụng cụ Loại sắc ký Sắc ký hấp phụ (sự cạnh tranh chất hấp phụ rắn pha động ) động pha tĩnh Khí Cột Sắc ký khí Lỏng Cột Sắc ký cột Lớp phẳng Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy Sắc ký phân bố (sự cạnh tranh pha tĩnh lỏng pha động) Khí Cột Sắc ký lỏng-khí Lỏng Cột Sắc ký lỏng-lỏng Sắc ký trao đổi ion (sự cạnh tranh pha tĩnh resin trao đổi ion pha động lỏng) Lỏng Cột Sắc ký trao đổi ion Sắc ký rây phân tử (sự cạnh tranh khung polymer pha động lỏng) Lỏng Cột Sắc ký lọc gel ... TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC KỸ THUẬT KẾT TINH Kết cuối trình chiết tách, phân lập tinh chế phải thu hợp chất sạch, thông thường dạng tinh thể ngồi trừ chất lỏng chất vơ định hình... thêm vài giọt FeCl 2% , có màu xanh đen có TANIN - Ống 2: cho vào vài tinh thể Na2CO3, có sủi bọt có acid hữu  Phần thứ 3: Dịch cồn bóc cách thủy chen sứ đến cạn, hòa cắn với 4-5 ml H2SO4 2% ,... từ vài giọt H2SO4 đđ theo thành ống nghiệm Nếu chổ giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ sơ nhận định có hợp chất PHYTOSTEROL I .2 Xác định chất tan dịch cồn Bã nguyên liệu sau chiết ether đem chiết